嬰兒配方奶粉中二十碳四烯酸的測量不確定度評定

葛萃萃，王文祥，吳曙霞，張惠君，王 瀟，秦蕓樺，王 靜

1 浙江公正檢驗中心有限公司，浙江杭州 310009

2 贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江杭州 310009

3 中國檢驗認(rèn)證集團(tuán)澳新分公司，悉尼-奧克蘭 2220

0 引言

母乳是母親為嬰兒提供所需全部營養(yǎng)的最佳食物。在人生最初階段，嬰兒通過母乳攝入充分的能量和營養(yǎng)對生長發(fā)育至關(guān)重要。當(dāng)母親由于種種原因無法提供充足的母乳時，嬰兒配方奶粉就成為了最好的替代品。嬰兒配方奶粉通過添加各種營養(yǎng)物質(zhì)模擬母乳以實現(xiàn)與母乳組成成分高度相似。二十碳四烯酸（C20:4n-6），俗稱花生四烯酸（Arachidonic Acid，ARA）是嬰兒生長發(fā)育的必需脂肪酸之一，具有幫助腦部神經(jīng)發(fā)育、參與造血與免疫調(diào)節(jié)、促細(xì)胞分裂等一系列生理活性[1，2]。依據(jù)《GB 10765—2021 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》，ARA的最大添加值為19.1 mg/100 kJ[3]，和歐盟、澳大利亞和新西蘭等國家一致[4]，同時，也是嬰兒配方奶粉可選擇性成分食品安全的必檢項目[5]。

測量不確定度是表征測量結(jié)果準(zhǔn)確度的重要指標(biāo)，在食品檢驗中得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展[6]。分析和評定測量不確定度可以發(fā)現(xiàn)影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵步驟，進(jìn)而通過改善和優(yōu)化關(guān)鍵步驟進(jìn)一步提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。對于影響嬰兒配方奶粉中ARA等油脂檢測結(jié)果不確定度的主要來源多數(shù)具有共識，重復(fù)性檢測十分必要，但對于次要來源存在一定分歧。本文采用《GB 5009.168—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測定》第二法乙酰氯-甲醇法甲酯化（外標(biāo)法）[7]，區(qū)別于第一法（內(nèi)標(biāo)法），結(jié)合《JJF1059.1—2012 測量不確定度的評定與表示》中規(guī)定的基本程序[8]，對采用氣相色譜法測定嬰兒配方奶粉中ARA檢測結(jié)果進(jìn)行了不確定度分析。通過分析不確定度來源的各因素對ARA檢測結(jié)果的偏移，尤其關(guān)注次要來源對檢測結(jié)果的影響，旨在為進(jìn)一步提升檢測結(jié)果的可靠性提供具體建議和參考。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

嬰兒配方奶粉，市售澳大利亞DEVONDALE；ARA甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品，Merck公司；乙酰氯（分析純），西亞化學(xué)公司；無水碳酸鈉（分析純），西隴科學(xué)公司；甲醇（色譜純）, Merck公司；甲苯（色譜純），Merck公司。

1.2 儀器設(shè)備

氣相色譜儀配氫火焰離子檢測器GC-2010 plus，島津制作所；SP-2560聚二氰丙基硅氧烷色譜柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm），Merck公司；XP-205電子天平，Sartorius公司；組織粉碎機(jī)，IKA公司；旋渦混勻儀，上海雷磁公司；電熱恒溫水浴鍋，上海博迅公司；離心機(jī)，Beckman Coulter公司。

1.3 分析步驟

稱取嬰兒配方奶粉0.5015 g試樣于螺口玻璃管中并加入5 mL甲苯混勻，再加入10%乙酰氯甲醇溶液6 mL，充氮氣后旋緊螺旋蓋。振蕩混合置于80 ℃水浴鍋2 h，期間每20 min振搖1 次，水浴后冷卻至室溫。將玻璃管中樣液完全轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，并分別用3 mL碳酸鈉溶液清洗玻璃管3 次合并轉(zhuǎn)移后混勻，5 000 r/min離心5 min，分離上清液后氣相色譜儀測定。

1.4 色譜條件

載氣：氮氣；程序升溫：初始溫度100 ℃，持續(xù)13 min；100～180 ℃，升溫速率10 ℃·min-1，保持6 min；180～200 ℃，升溫速率1 ℃·min-1，保持20 min；200～230 ℃，升溫速率4 ℃·min-1，保持10.5 min；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；檢測器溫度：280 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比=100∶1；進(jìn)樣量：1.0 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 影響量化不確定度的主要來源

2.1.1 相關(guān)檢測過程

2.1.1.1 不確定度ur（x1） （源于樣品總重復(fù)性）

2.1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（x2） （源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）

2.1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（x3） （源于樣品）

2.1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（x4）（源于儀器設(shè)備）

2.1.2 不確定度傳播律

由于檢測函數(shù)為非線性，將泰勒級數(shù)展開成為近似線性的模型，采用以下相對不確定度合成公式：

2.2 量化不確定度分量

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量ur（x1）（源于樣品總重復(fù)性）

ur（x1）包括：檢測人員和設(shè)備，檢測地點和當(dāng)時環(huán)境條件等產(chǎn)生的不確定度，全覆蓋影響檢測結(jié)果精密度的因素。按GB 5009.168-2016要求，對同一樣品開展實驗室內(nèi)比對，檢測結(jié)果見表1。

表1 樣品重復(fù)測定結(jié)果

ARA含量測定單次標(biāo)準(zhǔn)偏差

按標(biāo)準(zhǔn)要求重復(fù)兩次取算術(shù)平均值作為ARA含量，故測定重復(fù)性產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量為：

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量ur（x2）（源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）

2.2.2.1 不確定度分量ur（x2.2.2.1）（源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量）

ARA甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品證書信息表明ARA甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)展不確定度為U=0.5%，k=2。

按正態(tài)分布（純度99%）：

2.2.2.2 不確定度分量ur（x2.2.2.2）（源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量）

天平稱量ARA甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品重量m=0.0168 g，天平校準(zhǔn)證書表明測量結(jié)果示值誤差的擴(kuò)展不確定度U=0.02 mg，k=2，屬正態(tài)分布。標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2.3 不確定度分量ur（x2.2.2.3）（源于溶液定容過程）

50 mL 單標(biāo)線容量瓶（A級）產(chǎn)生的不確定度是溶液定容過程中不確定度的主要來源。

標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（x2.2.2.3.1）（源于50 mL 容量瓶校準(zhǔn)）：v=50 mL 單標(biāo)線容量瓶校準(zhǔn)證書表明50 mL 單標(biāo)線容量瓶屬于A級，測量結(jié)果擴(kuò)展不確定度U=0.03 mL，k＝2，屬正態(tài)分布。

標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（x2.2.2.3.2）（源于溶液與校準(zhǔn)溫度差異）：溶液與校準(zhǔn)溫度的差異為±5 ℃，容量瓶體積為50 mL。甲苯體積膨脹系數(shù)為（1.08×10-3）/℃，甲苯體積膨脹顯著大于玻璃體積膨脹，故只考慮甲苯體積膨脹因素，按矩形分布取k=

標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（x2.2.2.3）（源于50 mL單標(biāo)線容量瓶）：

由以上不確定度結(jié)果綜合計算：ARA甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（x3）（源于嬰兒配方奶粉樣品）

2.2.3.1 不確定度ur（x3.2.3.1）（源于樣品稱量）

天平稱量樣品重量m=0.5083 g，天平校準(zhǔn)證書顯示測量結(jié)果示值誤差的擴(kuò)展不確定度U=0.02 mg，k=2，屬正態(tài)分布。

標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3.2 不確定度ur（x3.2.3.2）（源于樣品定容）

樣品與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容過程產(chǎn)生的不確定度相同，均為0.31%。

由分析綜合計算：嬰兒配方奶粉樣品產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4 不確定度ur（x4）（源于氣相色譜儀）

由于儀器設(shè)備性能因素的影響屬A類評定，故對同一樣品開展重復(fù)實驗，檢測結(jié)果見表2。

表2 重復(fù)進(jìn)樣峰面積的測量值

單次檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差:

標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定

根據(jù)以上結(jié)果，綜合評定合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.3 擴(kuò)展不確定度評定

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘包含因子得到擴(kuò)展不確定度：置信概率p=95%，k=2，故嬰兒配方奶粉樣品中ARA 含量檢測擴(kuò)展不確定度為：U95=k×ucr（x）=2×2.73%=5.46%

2.4 報告與表示測量不確定度

由上述結(jié)果表述嬰兒配方奶粉樣品ARA 含量：檢測結(jié)果為（0.264±0.007）g，k=2，即95%可能性為0.257～0.271 g。

2.5 測量不確定度的結(jié)果與討論

通過對檢測嬰兒配方奶粉樣品ARA含量的不確定度分量進(jìn)行定量分析，利用相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度開展分布計算和整體合成，綜合評定得到：合成不確定度為2.73%，擴(kuò)展不確定度為5.46%。檢測嬰兒配方奶粉樣品中ARA 含量為（0.264±0.007）g，95%可能性為0.257～0.271 g。本文不確定度的評定結(jié)果表明，影響檢測嬰兒配方奶粉樣品中ARA含量（外標(biāo)法）的不確定度主要來源于樣品重復(fù)測定（分量不確定度2.68%），其次為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制（分量不確定度0.40%）和樣品處理（分量不確定度0.31%），氣相色譜儀器（分量不確定度0.00002%）影響最小。

李永凱等[9]采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測裂殖壺菌培養(yǎng)物中二十二碳六烯酸（DHA）含量的評定結(jié)果表明，重復(fù)測定引起的分量不確定度（1.12%）是稱量環(huán)節(jié)（0.0058%）的193倍，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、內(nèi)標(biāo)添加量、回收率、校正因子等分量不確定度介于0.15%～0.58%。張方圓等[10]采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測嬰兒配方奶粉中ARA和DHA，將樣品的重復(fù)性測定及檢測定量誤差作為同一不確定度來源分析，在各影響因素中相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度最高（0.0173%），其次為前處理過程及儀器波動、重現(xiàn)性等引起的不確定度0.00612%。與此不同，陳蕊等[11]在檢測調(diào)制乳中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測量不確定度評定過程中引入了標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和方法回收率引起的不確定度來源，兩者的影響程度僅次于對測量結(jié)果的不確定度影響最大的分量重復(fù)測定。張喜金等[12]利用氣相色譜法測定藻油中DHA含量不確定度評定時得出最大分量為標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液配制（各為0.6%），重復(fù)性分量僅為0.3%。作者認(rèn)為氣相色譜檢測脂肪酸采用的前處理方法繁瑣復(fù)雜，無論是內(nèi)標(biāo)法還是外標(biāo)法，人為操作的及時準(zhǔn)確性對檢測結(jié)果的顯著影響多數(shù)已達(dá)成共識，重復(fù)檢測的必要性毋庸置疑。但不確定度來源的次要因素存在著較大差異，作者經(jīng)過ARA含量的不確定度主要來源比較和綜合分析認(rèn)為，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的重要程度超過除重復(fù)性檢測的其余不確定度來源，其微小差異對檢測結(jié)果的可靠性影響較大，建議在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時采用專人專區(qū)專用具，避免對檢測結(jié)果可靠性的較大影響。樣品處理過程產(chǎn)生的不確定度通過規(guī)范操作動作和習(xí)慣來降低對可靠性的影響。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和方法回收率以及氣相色譜等儀器引起的不確定度影響較小，周期性關(guān)注即可。

3 結(jié)論

無論內(nèi)標(biāo)法還是外標(biāo)法檢測嬰兒配方奶粉中ARA含量，檢測過程中人為操作帶來的不確定度對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性影響最大，重復(fù)檢測的必要性毋庸置疑。此外，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和樣品處理過程產(chǎn)生的不確定度有必要通過必要手段來降低其對檢測結(jié)果可靠性的影響。為提高檢測嬰兒配方奶粉中ARA含量的準(zhǔn)確度，通過樣品重復(fù)檢測、專人專區(qū)專用具配制標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品處理過程中規(guī)范操作動作和習(xí)慣，多項措施共同實施具有現(xiàn)實意義。