抗痤瘡藥物模型研究進展

李 雪 丁 鑫 汪 奇 譚寧華

中國藥科大學中藥學院，南京，211198

痤瘡是由毛囊皮脂腺慢性炎癥主導，同時受多因素影響的皮膚疾病。現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡的發(fā)病機制主要與毛囊皮脂腺導管上皮的過度角化、毛囊口阻塞、皮脂腺分泌增多、皮膚微生態(tài)失衡以及炎癥反應(yīng)等有關(guān)[1]，且這些機制存在一定的相關(guān)聯(lián)系。

為了探討?zhàn)畀彽陌l(fā)病機制以及治療藥物的篩選，研究人員建立了多種痤瘡藥理模型，這些模型的建立對痤瘡病理研究和新藥與化妝品研發(fā)具有重要意義。本文通過文獻調(diào)研，系統(tǒng)總結(jié)了包括兔、鼠、狗、豬、猴等的體內(nèi)痤瘡藥理模型(表1)，以及人皮脂腺離體器官、人皮脂腺細胞、角質(zhì)形成細胞、單核/巨噬細胞、全層人體皮膚、3D皮膚皮脂腺等的體外篩選模型(表2)，希望為痤瘡治療藥物及化妝品的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 體內(nèi)痤瘡藥理模型

1.1 兔耳粉刺模型 兔內(nèi)耳毛囊與人的毛囊相似，兩者均有細小毛發(fā)和粗大皮脂腺，且用藥兩周后易產(chǎn)生紅斑、脫屑等癥狀[2]。因此，兔耳粉刺模型是最常用的痤瘡藥物抗角化實驗模型。

兔耳粉刺模型造模常用Kligman法，于兔耳內(nèi)側(cè)面2 cm×2 cm范圍涂2%煤焦油0.5 mL/d，連續(xù)2周[3]。潘學東等[4]基于Kligman法，隔日一次在兔耳皮下注射痤瘡丙酸桿菌50 μL/每單耳(濃度6×107CFU/mL)，直至造模結(jié)束。

造模多選用12周齡，體重2.0 kg左右的雄性家兔。造模后兔耳粉刺和丘疹明顯，并有表皮增厚、角化物堆積、炎性細胞浸潤等現(xiàn)象。

1.2 各類鼠模型

1.2.1 大鼠模型 大鼠在痤瘡模型中應(yīng)用廣泛，常用于研究痤瘡丙酸桿菌所導致的皮膚炎癥，通過抗菌治療痤瘡的效果來篩選藥物。

He等[5]向大鼠耳廓注射痤瘡丙酸桿菌(6×107CFU/mL)，引起慢性炎癥并形成痤瘡樣病變。馬佳慧等[6]在大鼠右耳廓皮內(nèi)注射50 μL痤瘡丙酸桿菌(6×107CFU/mL)3天的基礎(chǔ)上聯(lián)合腹腔注射1 mL痤瘡丙酸桿菌(6×107CFU/mL)7天進行造模。此造模時間僅為10天，成模后可以維持14天。除此之外還可以應(yīng)用大鼠耳廓復合痤瘡模型，如郭斐斐等[7]采用涂抹100%油酸和注射1 mL痤瘡丙酸桿菌聯(lián)合使用的方法進行造模，直至肉眼可見囊腫時停止造模。應(yīng)用表皮葡萄球菌也可以得到相似的結(jié)果[8]。

表1 體內(nèi)痤瘡藥理模型的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點比較

表2 體外痤瘡藥理模型的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點比較

實驗動物一般選用Wistar大鼠，體重200 g左右。造模后表觀會出現(xiàn)耳腫脹、表皮粗糙干燥、角質(zhì)層增厚、毛囊孔增大、炎性丘疹結(jié)節(jié)及囊腫等痤瘡病理現(xiàn)象。

1.2.2 小鼠模型 小鼠因其體積小、成本低、數(shù)量大、易操作而被廣泛應(yīng)用于痤瘡炎癥發(fā)生機制的研究。

目前，小鼠痤瘡模型已較為成熟，主要是通過化學物質(zhì)誘導，例如二甲苯、角叉菜膠、2，4-二硝基氯苯等；還可以向小鼠耳皮內(nèi)注射痤瘡丙酸桿菌(107～109CFU/mL)致其感染，會引起嚴重的肉芽腫反應(yīng)；亦有研究人員連續(xù)7天給小鼠皮內(nèi)注射50 μL痤瘡丙酸桿菌(107CFU/mL)并涂抹20 μL新鮮合成的皮脂，此方法可促進皮膚病理學的重現(xiàn)性和顯著性[9]；此外，已有研究報道一種生物工程的方法，將真皮細胞捕獲系統(tǒng)作為支架與含有人皮脂細胞的組織腔結(jié)合使用。將組織腔植入ICR小鼠腹部皮膚，在組織腔注入20 mL痤瘡丙酸桿菌(107CFU/mL)誘導宿主免疫應(yīng)答，測定組織腔液中菌落數(shù)和炎癥因子的水平。該模型提供了體內(nèi)微環(huán)境，為篩選新型抗痤瘡藥物和疫苗提供了獨特的條件[10]。

實驗動物一般選用ICR小鼠。造模后，鼠耳會產(chǎn)生明顯的肉芽腫反應(yīng)和紅斑，皮膚病變中浸潤的炎性細胞的數(shù)量顯著增加；背部膿腫形成、紅斑、硬結(jié)、皮膚壞死和鱗屑等。

1.2.3 金黃地鼠模型 金黃地鼠側(cè)腹皮脂腺斑是雄激素依賴性器官，在解剖學特征上以及對激素刺激的反應(yīng)上與人相似，因此金黃地鼠被應(yīng)用于研究藥物抗雄激素及抗皮脂腺增生活性的實驗[11]。

造模方法是通過在金黃地鼠局部應(yīng)用痤瘡丙酸桿菌，處理4周，然后用油紅O染色，半定量分析顯示皮脂腺和導管中皮脂積聚增加。魏鳳等[12]應(yīng)用痤瘡丙酸桿菌(107CFU/mL)感染金黃地鼠皮脂腺斑產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)，觀察光動力療法對痤瘡丙酸桿菌感染炎癥的抑制效果。

實驗動物多選用雄性金黃地鼠，體重100～120 g左右，實驗中需測量皮脂腺斑的大小、皮脂腺斑重疊葉數(shù)，并進行切片染色觀察，或檢測睪酮、雌二醇等水平。

1.2.4 豚鼠模型 于豚鼠腹部皮內(nèi)注射人的角質(zhì)細胞，可模擬痤瘡炎癥的發(fā)病過程，常用于臨床痤瘡藥物療效的評估及其作用機制的研究。

造模方法是將人的足部角質(zhì)混懸液0.1 mL注射到豚鼠的側(cè)腹，每天1次，連續(xù)7天，可制備豚鼠痤瘡模型。本模型持續(xù)不少于14天[13]。

實驗動物一般選用成年豚鼠，雌雄各半，體重230～270 g。造模后，豚鼠的側(cè)腹可產(chǎn)生炎性丘疹，組織學觀察其特征是早期聚集多形核白細胞，后期表現(xiàn)為肉芽腫。

1.2.5 犀牛鼠粉刺模型 成年犀牛鼠屬于無毛突變體，其皮膚毛囊漏斗部擴張，角蛋白積聚，形成類似于人的非發(fā)炎微粉刺結(jié)構(gòu)。因此，犀牛鼠模型多用于評估藥物對粉刺的溶解作用。

犀牛鼠模型主要用于評估影響上皮分化(維生素A)或促進角質(zhì)細胞間凝聚力喪失(除垢劑)藥物的效果。Veit等[14]應(yīng)用犀牛鼠模型證實DX314降低了粉刺密度，并誘導了表皮增厚。

實驗動物一般選擇成年犀牛鼠，其真皮中含有囊腫，毛囊管形成一壺腹樣腔，腔內(nèi)充滿了潴留的角化細胞。

1.2.6 裸鼠模型 裸鼠是一種表現(xiàn)為無毛、無胸腺的免疫缺陷動物[15]，可以接受來自多種異種皮膚移植，且移植物存活時間長。常用于研究各種局部應(yīng)用的抗痤瘡活性化合物的治療效果。

Otulakowski等[16]分別在裸鼠背部和尾巴底部移植痤瘡患者皮膚，移植成功率超過70%。1984年，Petersen等[17]移植人面部全層皮膚到成年雄性CD-1裸鼠皮膚上。移植4周后，通過植入充滿T或DHT的導管給裸鼠注射雄激素，建立人皮脂腺的裸鼠痤瘡模型。該模型對人類皮脂腺生理學和病理學的研究具有重要的應(yīng)用價值，可以用來研究雄激素導致痤瘡的機制及抗痤瘡藥物的療效[18]。此外，裸鼠還可用于研究氯、溴等取代的芳香族化合物引起的痤瘡。Puhvel[19]用3，4，3’，4’-四氯二苯刺激皮膚產(chǎn)生氯痤瘡的全部病理組織學改變。實驗動物一般選用成年裸鼠雄性或雌雄各半，在移植前至少1周去勢。造模后，會出現(xiàn)皮脂腺體積增大、表皮增生、毛囊和真皮囊腫過度角化、真皮內(nèi)可見炎性細胞浸潤。

1.2.7 無皮脂腺鼠模型 無皮脂腺鼠是由于基因突變導致皮脂腺發(fā)育缺陷的一類鼠，不能進行皮脂腺分泌，因此，可用于研究皮脂腺的作用。

Fluhr等[20]使用此模型評估了皮脂是否會影響皮脂腺嚴重發(fā)育不全的asebia J1和2J小鼠的角質(zhì)層水合或滲透屏障功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)皮脂腺來源的甘油是角質(zhì)層水化的主要貢獻者。

1.2.8 細毛鼠模型 細毛鼠是由于基因突變形成的雄激素依賴、皮脂分泌過多、皮脂腺過度增生的一類鼠。

Ye等[21]以其為痤瘡模型動物，進行皮脂腺腺體和導管增生的退行性研究，證實此模型可用于研究化合物的經(jīng)皮吸收率、對靶器官的穩(wěn)定性和親和力以及對局部外用藥物載體的篩選。

1.3 其它動物模型

1.3.1 墨西哥無毛犬模型 墨西哥無毛犬是由于常染色體半致死突變導致的復雜產(chǎn)物[22]。不同于大多數(shù)痤瘡模型動物，它能像人類一樣自發(fā)產(chǎn)生粉刺，皮損類似于人的黑頭粉刺，且有相似的病理改變[23]，這些粉刺幾乎是開放的，在面、頸、大腿均有散在分布。墨西哥無毛犬主要用于篩選溶解粉刺的藥物。

Kimura等[24]以墨西哥無毛犬為對象進行自發(fā)形成粉刺的研究，證實其是評估抗痤瘡藥物有效性的理想模型。

1.3.2 豬耳模型 豬耳前部皮脂腺與人面部皮脂腺相似，所以豬耳可作為皮脂腺皮膚的模型。

臨床上常用氨基酮戊酸光動力療法(ALA-PDT)治療痤瘡。Sakamoto等[25]對豬耳前部進行ALA-PDT后，觀察到卟啉類的積累，說明豬耳對ALA的代謝與人一致，這表明豬耳前部皮膚是合適的痤瘡動物模型。

1.3.3 恒河猴模型 恒河猴模型可作為藥物經(jīng)皮吸收的監(jiān)測模型。作為靈長類動物，恒河猴與人類存在近親關(guān)系，相似度達到94%。Wester等[26]建立了恒河猴痤瘡模型，利用該模型確定了潛在的抗粉刺劑的局部生物利用度。

2 體外痤瘡篩選模型

2.1 人皮脂腺離體器官培養(yǎng)模型 人類皮脂腺(SG)是一種微小的、分枝型的多腺體，幾乎存在于人體所有皮膚上。SG原位培養(yǎng)模型對于探索人類一些皮膚病如脂質(zhì)沉積、脂溢性皮炎和痤瘡的病理生理學非常重要。其優(yōu)勢是潛在的皮脂抑制化合物不會阻礙向腺體輸送，因此可以評估絕對的生物學效果，是開發(fā)和評價藥品和化妝品的有效方法。

Guy等[27]采用顯微解剖方法分離人皮脂腺漏斗部器官，與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)，加入IL-1α、EGF以及TGF-α引起漏斗部的過度角化、角質(zhì)形成細胞的紊亂和破裂，類似于更嚴重的膿性痤瘡。

2.2 人皮脂腺細胞培養(yǎng)模型 SG器官培養(yǎng)的優(yōu)勢是顯而易見的，但細胞培養(yǎng)提供了器官培養(yǎng)維護的另一種選擇，大量的細胞可以被反復傳代和凍存，允許在類似的細胞譜系上進行多次實驗[28]。

Xia等[29]最早建立了人類皮脂腺細胞培養(yǎng)模型，能闡明皮脂腺的作用以及對細胞水平的調(diào)節(jié)。Wei等[30]用此模型研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能在體外通過AMPK途徑抑制SZ95皮脂細胞的脂質(zhì)合成和炎癥反應(yīng)。

2.3 角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)模型 體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細胞多用于篩選抗炎藥物和研究炎癥發(fā)生機制。將人角質(zhì)形成細胞與痤瘡丙酸桿菌共培養(yǎng)，測定上清液中細胞因子的濃度，證明痤瘡丙酸桿菌刺激炎癥因子的產(chǎn)生。

Geyfman等[31]在角質(zhì)形成細胞中添加未滅活的痤瘡丙酸桿菌，結(jié)果顯示痤瘡丙酸桿菌能顯著誘導IL-1α和IL-8的產(chǎn)生，而氨苯砜能顯著降低這兩種細胞因子的水平。體外角質(zhì)形成細胞不易獲得，因此也有人使用永生化角質(zhì)形成細胞(HaCaT)進行研究。用熱滅活的痤瘡丙酸桿菌與HaCaT細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)何首烏I通過下調(diào)CD36/NOX1/ROS/NLRP3/IL-1β通路來抑制痤瘡丙酸桿菌誘導HaCaT細胞分泌IL-8[32]。

2.4 單核/巨噬細胞培養(yǎng)模型 單核/巨噬細胞是人體重要的免疫細胞，對于機體的免疫、代謝和維持內(nèi)環(huán)境平衡具有重要作用。利用人急性單核細胞THP-1或小鼠巨噬細胞RAW264.7作為模型，和痤瘡丙酸桿菌共培養(yǎng)，或用LPS誘導，研究其相關(guān)炎癥因子，評價抗痤瘡藥物抗炎的效果。

Lim等[33]在體外評價了槲皮素對痤瘡丙酸桿菌刺激THP-1和RAW 264.7細胞產(chǎn)生炎性細胞因子的影響，發(fā)現(xiàn)槲皮素能顯著抑制IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生。

2.5 全層人體皮膚培養(yǎng)模型 全層人體皮膚培養(yǎng)模型具有生理復雜性，與細胞培養(yǎng)模型相比，具有完全功能的屏障功能，可以作為評估局部應(yīng)用藥物效果的體外模型。

Gillbro等[34]用0.05%維A酸乳膏(RA)處理全層人體皮膚組織24 h，采用基因芯片技術(shù)研究RA治療后的完整基因表達，建立了一種體外全層人體皮膚組織培養(yǎng)的模型。這一模型允許直接定量和定性評估皮膚活性成分的局部治療作用，是研究RA對皮膚影響的一個有價值的臨床前模型。

2.6 3D皮膚皮脂腺模型 3D皮膚皮脂腺模型是用于皮膚生理病理及藥物評價的體外模型[35]，能更好地維持表皮的完整性和生物學活性[36]。

李昕等[37]應(yīng)用人皮膚和SZ95皮脂腺細胞共培養(yǎng)的3D離體皮膚模型，加入PAMPs共培養(yǎng)7天，發(fā)現(xiàn)PAMPs具有體外促進表皮細胞的增殖與分化的作用。

3 小結(jié)

痤瘡作為常見的皮膚病，發(fā)病率高，影響人們正常生活。而痤瘡模型在探討其發(fā)病機制和藥物與化妝品研發(fā)方面有著重要的作用?，F(xiàn)有的痤瘡模型涉及抗炎、免疫、雄激素分泌、抗菌等多方面機制，選擇合適的痤瘡模型有助于推動痤瘡治療藥物與化妝品的研發(fā)。因此對現(xiàn)有痤瘡模型進行分析，根據(jù)研究需要將體內(nèi)外藥理模型相互配合，使其更接近臨床痤瘡患者的真實情況，建立完善的痤瘡模型，并應(yīng)用于活性篩選，將為治療痤瘡的藥物和化妝品研發(fā)提供更好的服務(wù)。