火龍果HpGST基因克隆及表達(dá)分析

屠凱，文曉鵬，張惠敏，申洛男

貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）是一種普遍存在的參與多種細(xì)胞功能的蛋白，參與植物花青苷運(yùn)輸與定位?；ㄇ嗨氐倪\(yùn)輸需要與GSH結(jié)合才能運(yùn)輸?shù)揭号葜?，而谷胱甘肽泵能夠識(shí)別與GSH結(jié)合標(biāo)記的內(nèi)源底物并將它們定位到合適部位［1］。在蘋果中，MdGSTF3基因的表達(dá)與果實(shí)不同組織花青苷的積累和分布密切相關(guān)［2］。在葡萄中，葡萄果皮和果肉花青苷的積累與GST相關(guān)［3］，GST參與小泡運(yùn)輸花青苷［4］，并且在葡萄中，葡萄ATP結(jié)合蛋白ABCC1運(yùn)輸花青苷依賴于谷胱甘肽的含量［5］。

火龍果（Hylocereus）為仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereusundatus）果樹(shù)，因其富含甜菜素而具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，被貴州省列為重點(diǎn)支持的特色產(chǎn)業(yè)［6］。研究表明，甜菜素是以酪氨酸為起始底物，經(jīng)眾多酶促反應(yīng)和自發(fā)反應(yīng)合成，其關(guān)鍵酶是酪氨酸羥化酶和4，5-多巴雙加氧酶［7］。雖然甜菜素合成通路日漸清晰，對(duì)于甜菜素合成后的運(yùn)輸機(jī)制尚不清楚?；瘕埞闹饕厥翘鸩怂囟皇腔ㄇ嗨?，鑒于GST在植物中參與花青苷運(yùn)輸與定位的重要作用，火龍果GST是否參與甜菜素的運(yùn)輸與定位？為探究這一科學(xué)問(wèn)題，本研究克隆火龍果HpGST基因的cDNA全長(zhǎng)序列，分析HpGST在火龍果不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，測(cè)定相應(yīng)時(shí)期和組織中甜菜素含量，進(jìn)而對(duì)該基因表達(dá)與甜菜素含量間的相關(guān)性進(jìn)行分析，旨在全面認(rèn)識(shí)HpGST基因在火龍果甜菜素代謝過(guò)程中的分子機(jī)制， 為通過(guò)基因工程手段對(duì)果實(shí)色澤性狀進(jìn)行定向改良提供新信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取貴州省羅甸縣火龍果種植基地紫肉（紫紅龍）、粉肉（粉紅龍）、白肉（晶紅龍）類型適齡植株掛牌標(biāo)記，每種色澤類型品種選3株，采集開(kāi)花后10、20、25、26、27、30 d果實(shí)，并分別標(biāo)記為S1（10 DAF）、S2（20 DAF）、S3（25 DAF）、S4（26 DAF）、S5（27 DAF）、S6（30 DAF）。每個(gè)采樣時(shí)期從3株植株各采1果，經(jīng)清水洗凈后液氮速凍，并置于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

取約0.2 g樣品經(jīng)液氮速凍充分研磨后，采用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（張家口賽諾生物科技有限公司），根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作步驟提取果實(shí)總RNA，利用全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的濃度和質(zhì)量；利用TaKa?Ra公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMTR reagent Kit with gDNA Eraser）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第1鏈。

1.3 基因克隆

根據(jù)HpGST基因序列，使用Prism 5.0本地軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。利用 PrimeSTAR HS DNA Polymerase （TaKaRa， 大連）高保真酶進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：98 ℃變性10 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增采用10 μL體系，包括5 μL PrimerSTAR Buffer、3.5 μL ddH2O、0.5 μL正 向 引物、0.5 μL反向引物、0.5 μL cDNA模板。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，目的片段膠回收后與Blunt克隆載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)中，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

表1 火龍果HpGST基因克隆的相關(guān)引物。Table 1 Primers used for HpGST gene cloning in pitaya fruit

1.4 基因生物信息學(xué)分析

利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Cen?ter for Biotechnology Information，NCBI）進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域分析；使用MEGA 8.0 軟 件構(gòu) 建 系統(tǒng) 發(fā) 育樹(shù)；使 用Expasy（https：//www.expasy.org/resources/protparam）在線分析軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和親疏水性；TMHMM Serv?er2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）在線軟件分析蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域；使用Cell-PLoc 2（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bio?inf/Cell-PLoc-2/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，GOR4（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 RT-PCR分析

根據(jù)筆者所在課題組前期獲得的火龍果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［8］中的HpGST基因序列，設(shè)計(jì)熒光定量引物，qHpGST-F和qHpGST-R（表1），以ACTION-2為內(nèi)參，分別設(shè)計(jì)其特異性引物ACTION-2-F、ACTION2-R（表1），采用2-△△Ct法分析相對(duì)表達(dá)量。

1.6 甜菜素提取和測(cè)定

參考曾燦彬［9］的方法并進(jìn)行改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取不同色澤類型品種及不同發(fā)育時(shí)期火龍果果肉0.2 g，經(jīng)液氮研磨，利用80%乙醇提取甜菜素，在紫外分光光度計(jì)上分別于波長(zhǎng)538、470 nm處測(cè)定甜菜紅素和甜菜黃素吸光度并計(jì)算其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HpGST基因克隆與生物信息學(xué)分析

將提取的火龍果總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得火龍cDNA，以火龍果cDNA為模板，利用引物HPGST-F和HPGST-R（表1）擴(kuò)增得到1條500～900 bp的特異性條帶。利用ExPaSy-Protparam預(yù)測(cè)HpGST蛋白分子質(zhì)量為2.5 ku，理論等電點(diǎn)為7.02。編碼氨基酸包含了20種常見(jiàn)氨基酸。其中賴氨酸含量最高，達(dá)到10%。分子式為C1193H1834N304O326S7。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為44.46，屬于不穩(wěn)定蛋白。利用TMHMM-2.0分析跨膜結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其在膜外發(fā)揮作用。利用在線分析軟件Cell-PLoc 2.0分析蛋白的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)該基因主要定位于細(xì)胞質(zhì)。利用ExPASy的ProtScale程序分析火龍果HpGST編碼蛋白疏水性和親水性，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)屬于親水性蛋白。通過(guò)GOR 4在線分析軟件對(duì)HpGST蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，其中α-螺旋占該蛋白的比例最高為33.94%，不規(guī)則卷曲所占比例為46.15%，延伸鏈所占比例為19.91%（圖1）。

使用NCBI的CDD在線分析軟件對(duì)HpGST進(jìn)行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖2）顯示，該基因編碼蛋白含有GST_N_Tau和GST_C_Tau的保守結(jié)構(gòu)域，第1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域由第6～80個(gè)氨基酸之間的74個(gè)氨基酸組成，第2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域由第91～214個(gè)氨基酸之間的123個(gè)氨基酸組成，并將該編碼蛋白命名為HpGST。

圖 2 火龍果HpGST保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 2 Conserved domain analysis of HpGST in pitaya

使用NCBI的BlastP在線分析軟件進(jìn)行在線比對(duì)，在蛋白質(zhì)序列庫(kù)中對(duì)HpGST進(jìn)行同源性檢索和比對(duì)分析。獲取來(lái)自藜麥（Chenopodium quinoa）、甜菜亞種（Beta vulgarissubsp.vulgaris）、菠菜（Spina?cia oleracea）、阿爾巴尼亞牧豆（Prosopis alba）等8種植物的15個(gè)蛋白氨基酸序列。利用MEGA7.0軟件將HpGST蛋白與這15個(gè)GST蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。結(jié)果顯示：火龍果HpGST蛋 白 與 藜 麥（XP_021720754.1、XP_021715456.1、XP_021746029.1、XP_021715455.1），甜菜亞種（XP_010594823.1），菠菜（XP_021839481.1，XP_021866921.1）親緣關(guān)系最近，與阿爾巴尼亞牧豆（XP_028752413.1、XP_028752382.1、XP_028752391.1、XP_0288045421.1）親 緣 關(guān) 系較遠(yuǎn)。

使用DNAMAN8.0將HpGST的氨基酸序列與親緣性較近的幾個(gè)物種的GST氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)（圖4），結(jié)果顯示，HpGST蛋白與其他物種的GST蛋白的氨基酸序列同源性比較高，其中與藜麥（XP_021720754.1、XP_021715456.1、XP_021746029.1、XP_021715455.1）相 似 性 分 別 為81%、81.02%、79.64%、76.50%，與甜菜亞種（XP_010594823.1）相似性 為77.98%，與 菠 菜（XP_021839481.1、XP_021866921.1）相似性為71.15%和71.61%。

2.2 HpGST的表達(dá)分析

利用qRT-PCR分析HpGST在火龍果不同色澤類型品種、不同發(fā)育期果肉中的表達(dá)情況，表達(dá)結(jié)果（圖5A）顯示，在有色果肉中S3期開(kāi)始表達(dá)量明顯上升，紫肉S3期表達(dá)量是S2期表達(dá)量的9.96倍，粉肉中則是5.54倍。而白肉中直到S4期表達(dá)量才顯著上升，且表達(dá)量整體上較低。此外，紫肉火龍果中基因表達(dá)量變化早于粉肉火龍果；紫肉火龍果S4期表達(dá)量是S3期表達(dá)量的3.32倍且兩者差異明顯，S5期表達(dá)量是S4期表達(dá)量的3.80倍且兩者差異明顯。而粉肉火龍果中S4期表達(dá)量是S3期表達(dá)量的1.37倍，兩者差異不明顯，S5期表達(dá)量是S4期表達(dá)量的12.0倍且2個(gè)時(shí)期差異顯著。而對(duì)應(yīng)時(shí)期白肉中表達(dá)量則分別是0.99和0.48且表達(dá)量較低。

圖 3 HpGST與其他物種GST氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig. 3 The phylogenetic tree analysis of GST amino acid sequences of HpGST and that of other species

分析HpGST在火龍果不同發(fā)育期、不同色澤類型品種果肉中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖5B）顯示，在S1-S2期，HpGST在3個(gè)色澤類型品種果肉表達(dá)量無(wú)明顯差異。而從S3期開(kāi)始，在有色果肉中表達(dá)量明顯高于白肉；在紫肉中表達(dá)量是白肉的8.12倍，差異顯著，而在粉肉中表達(dá)量是白肉的4.49倍，差異顯著。S4期在紫肉中表達(dá)量遠(yuǎn)高于在粉肉和白肉中的表達(dá)且均差異顯著，分別是粉肉的4.11倍、白肉的6.82倍。而在該時(shí)期HpGST在粉肉中的表達(dá)量是白肉的1.66倍。此后的S5期和S6期，HpGST在有色果肉表達(dá)量無(wú)顯著差異但都遠(yuǎn)高于白肉中的表達(dá)量且差異明顯，S5期HpGST在紫肉中表達(dá)量是白肉中表達(dá)量的26.09倍，在粉肉中的表達(dá)量是白肉中的17.36倍，而S6期對(duì)應(yīng)的分別為20.02倍和21.45倍。

上述結(jié)果表明，HpGST基因在不同色澤類型品種果肉中均有表達(dá)，但表達(dá)特性不同。HpGST在有色素累積的果肉中表達(dá)量明顯遠(yuǎn)高于無(wú)色素累積的白肉火龍果，且整體上呈現(xiàn)紫肉>粉肉>白肉，發(fā)育時(shí)期上呈現(xiàn)出隨時(shí)間的延長(zhǎng)而先上升后下降的趨勢(shì)，其中在紫肉和粉肉類型的S5期（27 DAF）相對(duì)表達(dá)量最高，而白肉類型S4期（26 DAF）表達(dá)量最高。

2.3 火龍果發(fā)育過(guò)程中甜菜素含量的變化

甜菜紅素在不同發(fā)育時(shí)期果肉中的含量變化結(jié)果（圖6A）顯示，紫肉火龍果中甜菜紅素含量整體呈現(xiàn)隨發(fā)育時(shí)期的延長(zhǎng)而不斷上升的趨勢(shì)，從S3期開(kāi)始急速升高，S3-S6期甜菜素含量均與S1、S2期含量有顯著差異。而在粉肉火龍果中，S1-S4期甜菜紅素含量均無(wú)顯著差異，S5-S6期差異顯著，但整體含量較低。而甜菜紅素含量在白肉火龍果中全時(shí)期均含量極低且無(wú)顯著差異。

甜菜紅素在不同色澤類型品種火龍果果肉中的含量變化（圖6B）顯示，S1-S2期在不同色澤類型品種火龍果果肉中雖有差異，但整體含量較低不進(jìn)行討論。比較S3-S6期不同色澤類型品種果肉甜菜紅素含量差異；S3期紫肉中含量是粉肉的7.50倍，是白肉的9.68倍、而S4期對(duì)應(yīng)的差異分別是16.47倍和20.29倍、S5期對(duì)應(yīng)的差異分別是17.52倍和24.82倍、S6期對(duì)應(yīng)的差異分別是15.04倍和34.00倍。即從S3期開(kāi)始，不同色澤類型品種火龍果中甜菜紅素含量開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異，不同色澤類型品種間甜菜紅素含量從高到低分別為紫肉>粉肉>白肉。

甜菜黃素在火龍果不同發(fā)育時(shí)期果肉中的含量變化（圖7A）顯示，甜菜黃素與甜菜紅素具有相同的累積趨勢(shì)即在不同色澤類型品種火龍果中甜菜黃素含量隨發(fā)育時(shí)期的增加色素含量不斷上升但含量都較低。

圖 4 火龍果HpGST和其他植物GSTs蛋白序列比對(duì)Fig. 4 Alignment of HpGST protein sequences of Hylocereus and GSTs protein sequences of other plants

甜菜黃素在不同色澤類型品種火龍果果肉中的含量變化結(jié)果（圖7B）顯示，紫肉中甜菜黃素含量變化最大，而粉肉和白肉變化較小。對(duì)比紫肉與粉肉、白肉類型的甜菜黃素含量發(fā)現(xiàn)，紫肉的含量均比粉肉高，S2-S6期 依 次高出1.16倍、2.20倍、2.68倍、2.78倍、2.88倍；而紫肉的甜菜黃素含量更顯著高于白肉類型，S1-S6期依次高出1.86倍、2.06倍、3.30倍、3.46倍、3.71倍、3.39倍。甜菜黃素含量在不同色澤類型品種間表現(xiàn)為紫肉>粉肉>白肉，雖然與甜菜紅素趨勢(shì)相同但整體含量較低（P<0.05）。

圖 5 火龍果果肉HpGST基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 Relative expression level of HpGST gene in Hylocereus

圖 6 不同色澤類型品種火龍果不同發(fā)育時(shí)期甜菜紅素含量變化Fig. 6 Variation of betacyanin content in different Hylocereus cultivars at different development stages

圖 7 不同色澤類型品種火龍果不同發(fā)育時(shí)期甜菜黃素含量變化Fig.7 Variation of betaxanthin content in different varieties of Hylocereus at different development stages

2.4 甜菜素含量與HpGST基因表達(dá)的相關(guān)性分析

比較HpGST基因在火龍果中的表達(dá)與甜菜素的含量變化，發(fā)現(xiàn)在火龍果發(fā)育時(shí)期，HpGST基因的表達(dá)與色素累積呈現(xiàn)相同趨勢(shì)（不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)量和色素含量趨勢(shì)相同，且在不同色澤類型品種表達(dá)量和甜菜素含量也呈現(xiàn)出顯著的同一性），而成熟期甜菜素累積到一定程度會(huì)抑制HpGST基因的表達(dá)。對(duì)比不同色澤類型品種火龍果中Hp?GST基因的表達(dá)與甜菜素的含量變化發(fā)現(xiàn)，在S1-S2期HpGST基因表達(dá)量及甜菜素含量都極低，且都是從S3期開(kāi)始，不同色澤類型品種間基因表達(dá)量及甜菜素含量都呈現(xiàn)出紫肉>粉肉>白肉的趨勢(shì)。即HpGST基因表達(dá)與甜菜素含量變化具有高度統(tǒng)一的時(shí)空性。

3 討論

甜菜素作為一種重要的天然色素，應(yīng)用前景廣闊，消費(fèi)市場(chǎng)潛力巨大，然而有關(guān)甜菜素的研究多集中在合成通路上，而對(duì)于甜菜素合成后運(yùn)輸與定位的研究卻鮮有報(bào)道。

谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GSTs）在植物中具有對(duì)花青素的運(yùn)輸標(biāo)記功能，因GST具有特殊的親和性，能將花青苷和谷胱甘肽形成偶聯(lián)連物［10-11］，GST作為載體標(biāo)記運(yùn)輸?shù)揭号葜袕亩Ｗo(hù)細(xì)胞［11］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，甜菜素在植物中的功能同花青素類似［12］。然而甜菜素在自然界中僅僅在石竹目植物中發(fā)現(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)同一植物中同時(shí)存在甜菜素和花青素2種色素［13］。此外，甜菜素起始底物酪氨酸和花青素合成前體物質(zhì)——對(duì)香豆酰CoA都來(lái)源于苯丙氨酸［14］。二者都作為一類水溶性色素，同樣合成于細(xì)胞質(zhì)中，儲(chǔ)存于液泡［15-16］。此外，二者在植物中的功能相同，合成底物同源，合成部位和最后運(yùn)輸?shù)降募?xì)胞器相同，推測(cè)2種色素在細(xì)胞質(zhì)中合成后運(yùn)輸?shù)揭号莸姆绞酱嬖谙嗤目赡堋?/p>

本研究對(duì)比火龍果中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因（HpGST）編碼蛋白定位部位和蛋白類型都與花青素來(lái)源植物中的GSTs編碼蛋白相似，對(duì)HpGST在火龍果中的表達(dá)與甜菜素含量進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，火龍果中甜菜素（包括甜菜紅素和甜菜黃素）含量的變化隨發(fā)育時(shí)期的延長(zhǎng)而不斷增加，并且與HpGST基因表達(dá)量具有相同趨勢(shì)。且甜菜素（包括甜菜紅素和甜菜黃素）含量在不同色澤類型品種火龍果中的含量與HpGST基因的表達(dá)量表現(xiàn)出高度一致的趨勢(shì)即紫肉>粉肉>白肉。推測(cè)HpGST基因與火龍果果肉中甜菜素的累積和分布有著緊密聯(lián)系。

本研究通過(guò)對(duì)比不同色澤類型品種、不同發(fā)育時(shí)期火龍果中HpGST基因的表達(dá)和甜菜素的含量變化，對(duì)參與色素運(yùn)輸?shù)墓入赘孰腟-轉(zhuǎn)移酶基因（GST）在火龍果中的作用進(jìn)行了初步研究。鑒于GST在花青苷運(yùn)輸與定位的重要作用，推測(cè)HpGST基因?qū)瘕埞刑鸩怂氐倪\(yùn)輸、積累和儲(chǔ)存起到重要調(diào)控作用，其具體的分子作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究，為火龍果果實(shí)中甜菜素累積與運(yùn)輸?shù)纳钊胙芯刻峁┮粋€(gè)新的視角，進(jìn)而為解析甜菜素的合成代謝調(diào)控提供科學(xué)根據(jù)。