基于miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)篩選與驗(yàn)證參與Graves病B細(xì)胞增殖的關(guān)鍵基因①

王 瑋 楊 倩 王 凱 鐘惠敏 潘凡凡 查兵兵

（復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海200240）

Graves?。℅raves'disease，GD）是甲狀腺功能亢進(jìn)癥的最常見類型，發(fā)病率為1.0%~1.5%，且逐年上升［1］。體液免疫與GD發(fā)病緊密相關(guān)，促甲狀腺激素受體抗體（thyrotropin receptor antibody，TRAb）與甲狀腺上皮細(xì)胞表面的促甲狀腺激素受體（thyrotropin receptor，TSHR）結(jié)合，刺激甲狀腺上皮細(xì)胞過度增生，使甲狀腺激素分泌失控，導(dǎo)致疾病發(fā)生［2］。

B細(xì)胞是體液免疫重要的執(zhí)行者，與GD的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。B細(xì)胞不僅可以分化為漿細(xì)胞分泌致病性抗體TRAb，還能作為抗原提呈細(xì)胞將TSHR的抗原表位呈遞給T細(xì)胞。盡管B細(xì)胞在GD的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，但GD中B細(xì)胞的基因表達(dá)譜尚不清楚，對(duì)其表達(dá)譜的研究有望為治療GD病提供新靶點(diǎn)。

miRNA是一種長(zhǎng)度為18~25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，能夠靶向識(shí)別mRNA的3'端非編碼區(qū)的特異性結(jié)合位點(diǎn)，直接降解mRNA或抑制其翻譯，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［3］。miRNA在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，如自身免疫性甲狀腺疾?。╝utoimmune thyroid disease，AITD）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等［4-6］。多項(xiàng)數(shù)據(jù)表明GD中miRNA的表達(dá)異?？赡軈⑴c疾病的發(fā)生發(fā)展［7-9］。LIU等［7］發(fā)現(xiàn)初發(fā)GD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中miR-154、miR-376b和miR-431表達(dá)下調(diào)。YAMADA等［8］發(fā)現(xiàn)GD患者血清中miR-16、miR-22、miR-375和miR-451表達(dá)上調(diào)。QIN等［9］通過對(duì)GD患者和健康對(duì)照組的甲狀腺組織進(jìn)行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)GD患者的甲狀腺組織中共有23種miRNA異常表達(dá)，導(dǎo)致超過2 000種mRNAs表達(dá)失調(diào)。miRNA與GD的研究是目前的研究熱點(diǎn)，但對(duì)miRNA與GD患者外周血B細(xì)胞的研究比較少見。

因此，本項(xiàng)研究采用微陣列技術(shù)比較初發(fā)GD患者和健康受試者外周血B細(xì)胞中miRNA和mRNA表達(dá)譜的差異，揭示其異常表達(dá)與GD之間的關(guān)系，并通過qRT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)mRNA和蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證。研究發(fā)現(xiàn)GD患者外周血B細(xì)胞中hsa-miR-146b-5p的下調(diào)可能是其發(fā)病的潛在機(jī)制，下調(diào)的hsa-miR-146b-5p可能通過上調(diào)CD79B促進(jìn)B細(xì)胞活化與增殖從而促進(jìn)GD的發(fā)生發(fā)展。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料41例初次發(fā)病且未經(jīng)治療的GD患者外周血取自2016年至2022年上海市第五人民醫(yī)院內(nèi)分泌科。GD患者入組標(biāo)準(zhǔn)：①高代謝癥候群；②促甲狀腺激素（thyroid stimulating hor‐mone，TSH）水平降低，游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）和游離甲狀腺素（free thyrox‐ine，F(xiàn)T4）水平正常/升高；③甲狀腺彌漫性腫大；④甲狀腺吸碘率升高。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期接受免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素者；②應(yīng)激狀態(tài)；③妊娠期或哺乳期婦女；④合并心腦血管疾病、肝腎功能衰竭者；⑤合并嚴(yán)重感染及其他自身免疫性疾病者。41例健康受試者外周血取自上海市第五人民醫(yī)院體檢中心2016年至2022年既往無甲狀腺疾病、年齡和性別相匹配的健康受試者。所有試驗(yàn)對(duì)象均自愿參加本研究并簽署知情同意書。本研究經(jīng)上海市第五人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫審批件號(hào)：2017-

029。

1.1.2 試劑 甲狀腺功能和甲狀腺抗體試劑購自Roche Diagnostics公司；人淋巴細(xì)胞分離液Lympho‐prepTM購自Axis-Shield公司；Human BD Fc BlockTM購自BD Biosciences公司；流式抗體購自Biolegend公司；人B細(xì)胞分選試劑盒購自Miltenyi Biotec公司；RNAsimple總RNA提取 試劑盒、miRNA提取 試 劑盒、miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA試劑盒購自TIAN‐GEN公司；PrimeScriptTMRT reagent試劑盒、PCR試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 甲狀腺功能和甲狀腺抗體檢測(cè) 所有試驗(yàn)對(duì)象檢測(cè)前禁食12 h，于第2天清晨6：00抽血送檢，無抗凝劑樣本采集后，靜置1 h離心、分離血清，檢測(cè)指標(biāo)包括FT3（參考范圍：3.10~6.80 pmol/L）、FT4（參考范圍：12.0~22.0 pmol/L）、TSH（參考范圍：0.27~4.20 mU/L）、抗甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）（參考范圍：0~34.0 U/ml）、抗甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TGAb，參考范圍：0~115.0 U/ml）和TRAb（參考范圍：<1.75 U/L）。甲狀腺功能和甲狀腺抗體經(jīng)電化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定。

1.2.2 PBMC分離 生理鹽水等體積稀釋人外周血，將稀釋后血緩慢滴入人淋巴細(xì)胞分離液Lym‐phoprepTM上層，根據(jù)密度梯度離心法提取PBMC。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)法 向PBMC中加入Human BD Fc BlockTM，室溫孵育10 min，使其與細(xì)胞表面Fc受體結(jié)合，以阻斷流式抗體Fc段與細(xì)胞表面Fc受體的非特異性結(jié)合；加入anti-human CD19抗體或anti-human CD19抗 體 和anti-human CD79B抗體進(jìn)行表面染色，4℃避光孵育30 min，隨后加入適量PBS離心洗去除未與細(xì)胞結(jié)合的流式抗體，加入500 μl PBS重懸細(xì)胞。使用Beckman counter CyAn流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)CD19+B細(xì)胞比例和CD19+B細(xì)胞表面CD79B細(xì)胞熒光強(qiáng)度。使用FlowJo V10軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 B細(xì)胞純化和RNA提取 向健康受試者和GD患者外周血的PBMC中加入PE-conjugated anti-CD19抗體和anti-PE微珠陽性分選得到CD19+B細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證其純化效率>90%。使用RNA‐simple總RNA提取試劑盒提取獲得CD19+B細(xì)胞總RNA；使用miRNA提取試劑盒提取獲得CD19+B細(xì)胞miRNA。

1.2.5 差異表達(dá)miRNA與mRNA篩選 取健康受試者和GD患者外周血各3份，根據(jù)密度梯度離心法提取PBMC，隨后進(jìn)行B細(xì)胞純化和RNA提取。使用Affymetrix WT PLUS Reagent Kit對(duì)總RNA進(jìn)行擴(kuò)增、標(biāo)記和純化以獲得cRNA，GeneChip Kit對(duì)生物素標(biāo)記的cRNA進(jìn)行雜交和洗滌。使用Affymetrix GeneChip Scanner 3000對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行掃描，Com‐mand Console Software 3.1軟件讀取原始數(shù)據(jù)以及歸一化處理，所用算法為Gene level_SST_RMA，Transcriptome Analysis Console軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。以|log2（fold change）|≥2.0且P<0.05為條件篩選差異表達(dá)的miRNA和mRNA。

1.2.6 差異miRNA靶基因預(yù)測(cè) 利用TargetScan（http://www.targetscan.org/）、miRBase（http://www.mirbase.org/）等數(shù)據(jù)庫對(duì)差異miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.7 靶基因的選取、miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及靶基因蛋白互作分析 將1.2.6得到的差異miRNA靶基因與1.2.5得到的差異mRNA取交集，篩選出miRNA的靶基因。將靶基因與對(duì)應(yīng)的差異miRNA以及差異表達(dá)倍數(shù)等導(dǎo)入Cytoscape軟件中構(gòu)建miRNA-mRNA差異表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。通過geneMA‐NIA數(shù)據(jù)庫對(duì)靶基因進(jìn)行蛋白互作分析。

1.2.8 GO富集分析 采用R包c(diǎn)luster profiler對(duì)miRNA的靶基因交集進(jìn)行GO富集分析。

1.2.9 qRT-PCR使用PrimeScriptTMRT reagent試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；使用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA試劑盒將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用qRT-PCR試劑盒驗(yàn)證GD病患者外周血B細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA和mRNA。應(yīng)用ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。所有引物由上海生工生物有限公司合成和純化，引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件和GraphPad Prism 8.0軟件分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GD患者和健康受試者臨床資料 本研究共納入GD患者和健康受試者各41例。GD患者中女性28例，男性13例，中位年齡36歲，臨床指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 臨床資料Tab.2 Clinical features

2.2 GD患者外周血CD19+B細(xì)胞比例升高 與健康受試者相比，GD患者外周血中CD19+B細(xì)胞比例顯著升高（3.46%vs7.77%，P<0.000 1，圖1）。

圖1 GD患者PBMCs CD19+B細(xì)胞比例升高Fig.1 Percentages of CD19+B in PBMCs was increased in GD patients

2.3 GD患者外周血B細(xì)胞中miRNA和mRNA差異表達(dá)譜 為揭示GD中B細(xì)胞異常增加的機(jī)制，對(duì)3例GD患者和3例健康受試者外周血CD19+B細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA和mRNA進(jìn)行分析。以|log2（fold change）|≥2.0且P<0.05作為差異miRNA和mRNA的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出119個(gè)差異miRNA，其中73個(gè)在GD組上調(diào)，46個(gè)在GD組下調(diào)（圖2A）；共篩選出572個(gè)差異mRNAs，其中399個(gè)在GD組上調(diào)，包括CD3D、CD5、CD2、CD79B、IL2RA等，173個(gè)在GD組下調(diào)（圖2B）。

圖2 GD患者和健康受試者外周血B細(xì)胞miRNA和mRNA差異表達(dá)譜Fig.2 Differential miRNA and mRNA expression profiles in B cells between healthy individuals and GD pa?tients

2.4 差異miRNA潛在靶基因預(yù)測(cè)及其功能富集分析 利用TargetScan等多個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)119個(gè)差異miRNA進(jìn)行潛在靶基因預(yù)測(cè)，并與2.3所述的差異mRNAs取交集，獲得152個(gè)靶基因。篩選獲得的靶基因包括CD79B、CD3D、CDR2以及IL2RA等。對(duì)靶基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示靶基因的生物學(xué)過程主要富集于免疫反應(yīng)及其調(diào)控中（圖3A），包括免疫應(yīng)答、細(xì)胞因子分泌以及粒細(xì)胞遷移等。進(jìn)一步對(duì)上調(diào)靶基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示上調(diào)靶基因的生物學(xué)過程主要富集于免疫系統(tǒng)的調(diào)控（圖3B），主要包括免疫系統(tǒng)調(diào)控、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及免疫系統(tǒng)正向調(diào)控等。對(duì)富集最為集中的幾個(gè)生物學(xué)過程進(jìn)行回溯分析，發(fā)現(xiàn)這些生物學(xué)過程均與CD79B、IL2RA以及FOSB等基因緊密相關(guān)。

圖3 差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

2.5 GD患者外周血B細(xì)胞中差異表達(dá)mRNA驗(yàn)證及蛋白互作分析 對(duì)篩選得到的152個(gè)靶基因進(jìn)行B細(xì)胞增殖相關(guān)基因的篩選，結(jié)果顯示mRNA表達(dá)譜中CD79B水平顯著上調(diào)。同時(shí)，將152個(gè)靶基因進(jìn)行蛋白互作分析，發(fā)現(xiàn)包括CD4、CD79B以及CD44等29個(gè)上調(diào)的靶基因出現(xiàn)于網(wǎng)絡(luò)核心位置中（圖4A）。因此推測(cè)CD79B可能是B細(xì)胞發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子。通過qRT-PCR對(duì)7例GD患者和7例健康受試者外周血B細(xì)胞中CD79B mRNA進(jìn)行驗(yàn)證；通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)13例GD患者和13例健康受試者外周血CD19+B細(xì)胞中CD79B進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示與健康受試者相比，GD患者外周血CD19+B細(xì)胞中CD79B mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01，圖4B），且CD79B熒光強(qiáng)度顯著上調(diào)（P<0.01，圖4C）。對(duì)GD患者外周血CD19+B細(xì)胞中CD79B蛋白水平與其甲狀腺功能（FT3、FT4）和自身抗體（TPOAb、TGAb、TRAb）進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示CD79B與FT3（r=0.51，P>0.05）、FT4（r=0.58，P>0.05）、TPOAb（r=0.38，P>0.05）、TGAb（r=0.11，P>0.05）和TRAb（r=?0.13，P>0.05）均無相關(guān)性。

圖4 qRT-PCR和FACS驗(yàn)證mRNAFig.4 mRNA was verified by qRT-PCR and FACS

2.6 GD患者外周血B細(xì)胞中差異表達(dá)miRNA驗(yàn)證 探究靶向CD79B的關(guān)鍵miRNA，對(duì)CD79B靶miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié) 果 顯 示：9個(gè)miRNAs可調(diào)控CD79B，分別為hsa-miR-4726-5p、hsa-miR-650、hsamiR-6085、hsa-miR-4430、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-378i、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-378a-3p和hsa-miR-31-5p（圖5A）。根據(jù)表達(dá)量高低對(duì)這9個(gè)miRNAs進(jìn)行排序，并選取表達(dá)量最高的4個(gè)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，即hsa-miR-6085、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-146b-5p和hsa-miR-378a-3p（圖5B）。通過qRT-PCR對(duì)7例GD患者和7例健康受試者外周血B細(xì)胞中miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與健康受試者相比，GD患者外周血CD19+B細(xì)胞中hsa-miR-146b-5p表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.001，圖5C），而hsa-miR-6085、hsamiR-146a-5p和hsa-miR-378a-3p表達(dá)無明顯差異（P>0.05，圖5C）。對(duì)GD患者外周血CD19+B細(xì)胞中hsa-miR-146b-5p與其甲狀腺功能和自身抗體進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：hsa-miR-146b-5p與FT3（r=0.11，P>0.05）、FT4（r=0.25，P>0.05）、TPOAb（r=?0.39，P>0.05）、TGAb（r=?0.11，P>0.05）和TRAb（r=?0.14，P>0.05）均無相關(guān)性。利用Tar‐getScan數(shù)據(jù)庫對(duì)miRNA調(diào)控CD79B的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-146b-5p可靶向CD79B mRNA的3'端非編碼區(qū)211~217號(hào)位點(diǎn)，即UCAAGAG與AGUUCUC互補(bǔ)，提示CD79B是hsa-miR-146b-5p的潛在靶點(diǎn)（圖5D）。因此推測(cè)hsa-miR-146b-5p可能通過靶向CD79B調(diào)控B細(xì)胞的功能。

圖5 qRT-PCR驗(yàn)證miRNAFig.5 miRNA was verified by qRT-PCR

3 討論

GD是體液免疫介導(dǎo)的AITD，伴隨B細(xì)胞的數(shù)量和功能異常［10］。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比，GD患者甲狀腺組織中CD20+B細(xì)胞浸潤(rùn)顯著升高［11］。本研究與健康受試者相比，初發(fā)GD患者外周血CD19+B細(xì)胞的比例顯著升高。早在20世紀(jì)80年代，MORI等［12］研究發(fā)現(xiàn)與健康受試者相比，GD患者外周血B細(xì)胞比例和計(jì)數(shù)均明顯提高；而經(jīng)藥物治療后甲狀腺功能正常的GD患者外周血B細(xì)胞的比例和計(jì)數(shù)無顯著差異。以上數(shù)據(jù)證實(shí)了GD中B細(xì)胞異?；钴S。雖然GD的研究越來越多，但導(dǎo)致B細(xì)胞異常的分子機(jī)制并未明確。

近年關(guān)于miRNA和GD的生物信息學(xué)研究越來越多，多數(shù)是對(duì)PBMC、T細(xì)胞、血清、血漿和甲狀腺組織的研究，很少對(duì)外周血純化的B細(xì)胞進(jìn)行研究［7-8，13-15］。本研究通過微陣列分析初發(fā)GD患者和健康受試者外周血B細(xì)胞中miRNA和mRNA的差異表達(dá)譜，鑒定出GD患者外周血B細(xì)胞中有119個(gè)差異表達(dá)的miRNAs和572個(gè)差異表達(dá)的mRNAs，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-146b-5p可能通過靶向CD79B調(diào)控B細(xì)胞的功能進(jìn)而影響疾病進(jìn)展，hsa-miR-146b-5p和CD79B與初發(fā)GD的疾病狀態(tài)無相關(guān)性。

過去幾十年里，常規(guī)GD方案一直未變，且不能滿足臨床需求。近些年來，隨著科研工作者對(duì)GD的深入研究，使用針對(duì)B細(xì)胞的單克隆抗體治療GD已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)并取得了一定成果，如抗CD20單抗和抗CD40單抗［16-17］。這些臨床試驗(yàn)的開展表明針對(duì)B細(xì)胞的免疫療法是目前治療GD的熱點(diǎn)。CD79B（Igβ）是 一 種35~40 kD的 跨 膜 蛋 白，與CD79A（Igα）形成異二聚體，CD79A/CD79B（Igα/Igβ）異二聚體與膜表面免疫球蛋白相聯(lián)，形成B細(xì)胞受體（B cell receptor，BCR）復(fù)合物［18］。BCR復(fù)合物識(shí)別特定抗原并傳遞第一信號(hào)，參與B細(xì)胞活化，活化的B細(xì)胞在抗原的刺激下增殖，進(jìn)一步分化為漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞發(fā)揮體液免疫效應(yīng)［18-19］。因此推測(cè)CD79B的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)B活化，最終促進(jìn)GD患者外周血B細(xì)胞異常增殖。利用CD79B靶向藥物治療彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤已進(jìn)入臨床試驗(yàn)，2019年首款CD79B靶向抗體偶聯(lián)物Polatuzumab Vedotin治療彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤已在美國上市［20-21］。以上臨床進(jìn)展表明通過阻斷CD79B抑制B細(xì)胞功能從而治療疾病的前景光明。不久的將來，CD79B也可能成為治療GD的新靶點(diǎn)。

miR-146家族包括miR-146a和miR-146b，參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和與自身免疫性疾病的發(fā)生［22］。有研究報(bào)道，miR-146在自身免疫性甲狀腺炎小鼠的甲狀腺和脾臟CD4+T細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)；miR-146a在GD眼病的血清中表達(dá)下調(diào)；而在橋本甲狀腺炎的甲狀腺組織中表達(dá)上調(diào)［23-25］。通過對(duì)CD79B對(duì)應(yīng)miRNA的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)GD患者外周血B細(xì)胞中hsa-miR-146b-5p表 達(dá) 下 調(diào)，CD79B是hsa-miR-146b-5p的潛在靶點(diǎn)，兩者的靶向關(guān)系需要Lucifer‐ase進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，本課題組推測(cè)hsa-miR-146b-5p的下調(diào)可能促進(jìn)CD79B水平上調(diào)，引起B(yǎng)細(xì)胞活化，最終使GD外周血B細(xì)胞異常增殖。

綜上所述，本研究通過微陣列對(duì)GD患者外周血miRNA和mRNA異常表達(dá)譜分析和驗(yàn)證得出，hsa-miR-146b-5p和CD79B在GD患者外周血中異常表達(dá)。hsa-miR-146b-5p可能通過上調(diào)CD79B促進(jìn)GD外周血B細(xì)胞的活化，CD79B可能成為GD新的生物標(biāo)志物和治療的潛在靶點(diǎn)。但本研究也存在不足之處，后續(xù)需要通過luciferase確定hsa-miR-146b-5p是否直接調(diào)控CD79B。