調(diào)節(jié)性T細胞介導的免疫檢查點抑制劑獲得性耐藥機制研究進展①

袁文麗 鄧德耀（云南大學附屬醫(yī)院，云南省第二人民醫(yī)院，云南省眼科醫(yī)院檢驗科，昆明 650021）

免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibi‐tors，ICIs）在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用越來越廣泛，ICIs具有廣譜的抗腫瘤效應(yīng)、治療腫瘤精準化、適用癥不斷擴大等特點［1-2］。然而，與腫瘤靶向治療一樣，ICIs治療也不可避免地出現(xiàn)耐藥［3-4］。獲得性耐藥的產(chǎn)生是ICIs治療失敗和腫瘤復發(fā)的重要原因。近年，研究結(jié)果顯示調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）可能參與了ICIs的獲得性耐藥［5-6］。Treg是CD4+T細胞的免疫抑制子集，通過抑制T效應(yīng)細胞（effective T cell，Teff）促進腫瘤的進展。本文就Treg生長發(fā)育、生物功能特性、介導ICI獲得性耐藥機制以及治療策略進行綜述，為克服ICIs抗藥性研究提供理論依據(jù)。

1 Treg的免疫學分類

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Treg亞群有多種，其中研究較多的是CD4+CD25+Treg。由于其在免疫調(diào)節(jié)中的重要作用，文獻中Treg多特指CD4+CD25+Treg。Treg可分為天然型Treg（nTreg）和誘導型Treg（iTreg）。其中，nTreg是由胸腺產(chǎn)生的，在外周血中受TGF-β調(diào)節(jié)維持其活性；iTreg是由幼稚的CD4+T細胞的前體細胞誘導而成，是靜息T細胞在TGF-β、IL-10、IFN-α，或低劑量抗原誘導下分化而成。

根據(jù)T細胞標記CD45RA、CD25和FOXP3的表達水平，人類FOXP3+CD25+CD4+T細胞可分為3類（表1）：原始Treg（CD45RA+FOXP3loCD25loCD4+）、效應(yīng)Treg（eTreg）（CD45RA?FOXP3hiCD25hiCD4+）和 非Treg（CD45RA?FOXP3loCD25loCD4+）。原始的Treg是從胸腺中分離出來的細胞，但尚未在周圍被激活，免疫抑制活性較弱。在T細胞受體（T cell receptor，TCR）刺激下，原始Treg迅速增殖，分化為高度免疫抑制的效應(yīng)Treg。相比之下，F(xiàn)OXP3+非Treg不是免疫抑制細胞，而是免疫刺激細胞，并產(chǎn)生炎癥細胞因子，如IFN-γ和IL-17。正常情況下，Treg數(shù)量較少（占CD4+T細胞的5%~10%），并在維持體內(nèi)免疫系統(tǒng)平衡中發(fā)揮重要作用。在絕大多數(shù)腫瘤中，脂肪酸代謝及CCL22等趨化因子等作用下的Treg募集，伴隨著TGF-β等細胞因子誘導下Treg的分化，使Treg的數(shù)量大大增加［7］。腫瘤微環(huán)境中的Treg通過分泌IL-10、IL-2或細胞毒性作用介導Teff的死亡。另一方面，Treg還能通過共抑制信號或CD39、Nrp-1分子，抑制抗原提呈細胞（antigen presentation cell，APC）的成熟及抗原提呈能力，進而發(fā)揮其腫瘤免疫逃逸作用。

2 免疫檢查點及其抑制劑對Treg的影響

2.1 程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）/細胞毒性T淋巴細胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）CTLA-4和PD-1的表達與不同癌癥患者的總生存率呈負相關(guān)，在Treg表面組成性表達，并在Teff上誘導激活［1-2］。PD-1廣泛表達于活化的T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞、肥大細胞和髓樣樹突狀細胞，與局限于APC表面CTLA-4配體不同，其配體程序性死亡配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）廣泛表達于腫瘤細胞、免疫細胞、非淋巴和非造血細胞。已有大量的研究證實PD-1、CTLA-4通過不同機制在T細胞活化過程中發(fā)揮重要作用［8］。Treg上的CTLA-4與APCs上的B7配體（B7-1和B7-2，又稱CD80和CD86）結(jié)合，且比T細胞上的CD28親和力更強。誘導了一個抑制T細胞啟動的信號（啟動期），CTLA-4A通過與B7形成復合物發(fā)生Treg內(nèi)化，導致APCs-B7表達下調(diào)。此外，Treg上的CTLA-4A-B7復合體通過調(diào)控APCs抑制Teff的增殖和活化，促進Treg擴增。與CTLA-4相同的是，PD-1抑制Teffs在腫瘤部位（效應(yīng)期）內(nèi)增殖和活化。PD-1在Treg上的功能尚不清楚，但是，證據(jù)表明PD-1通過增加FOXP3表達以提高Treg的穩(wěn)定性［9］。

2.2 ICIs選擇性抑制Treg單克隆CTLA-4抗體對腫瘤微環(huán)境中的CTLA-4+Treg細胞有耗竭作用，但這種耗竭是具有選擇性的，可能與依賴來自于巨噬細胞表面受體FcγRⅣ有關(guān)。SELBY等［10］發(fā)現(xiàn)在CT26和MC38荷瘤小鼠（結(jié)腸癌模型）中靶向CTLA-4治療會選擇性耗竭腫瘤內(nèi)Treg，而不影響血液和繼發(fā)性淋巴器官中Treg數(shù)量，這種現(xiàn)象可能與腫瘤微環(huán)境中的Treg CTLA-4表達水平高于其他組織有關(guān)。KAVANAGH等［11］的研究則認為CTLA-4 mAb治療不會影響前列腺癌患者循環(huán)Treg細胞的數(shù)量，而是增加了激活的Teff的數(shù)量。

PD-1抗體與CTLA-4 mAb一樣，其介導的抗腫瘤免疫應(yīng)答也與腫瘤內(nèi)Teff/Treg比例提高和Teff功能增強相關(guān)。但PD-1 mAb作用機制與CTLA-4 mAb不同。當PD-1與PD-L1結(jié)合后，通過去磷酸化TCR信號通路，從而抑制Teff的增殖和活化。PD-1/PD-L1可能通過Notch信號通路、天冬酰胺基內(nèi)肽酶途徑影響Treg增殖和抑制表型［12-13］。目前，PD-1在外周血Treg中的作用存在爭議。研究顯示，PD-1 mAb能夠增加黑色素瘤患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中Teff的增殖活化以及下調(diào)Treg中的FOXP3表達，并認為PD-1治療可能對Treg有影響［14］。但是另一項乳腺癌的研究顯示：PD-1 mAb治療對乳腺癌患者PBMC中FOXP3+Treg沒有影響［15］。在腫瘤微環(huán)境中，RIBAS等［16］觀察到抗PD-1治療并不影響腫瘤微環(huán)境內(nèi)Treg的數(shù)量，而是增加CD8+細胞毒性T細胞反應(yīng)性，并增強其在腫瘤中的積累。也有研究認為，PD-1抗體通過mTOR、MAPK及STAT1信號通路抑制Tregs細胞的誘導分化［17］。與之相反，有研究表明PD-1mAb治療增加Treg細胞的增殖能力，同時還促進Treg介導的腫瘤免疫抑制作用［18］。

3 Treg介導的ICIs獲得性耐藥機制

在臨床應(yīng)用ICIs治療癌癥過程中，有限的治療響應(yīng)性（優(yōu)勢人群）和獲得性耐藥是ICIs治療的兩大挑戰(zhàn)。ICIs治療優(yōu)勢人群的篩選可能多涉及腫瘤固有耐藥（原發(fā)性耐藥）范疇；獲得性耐藥往往發(fā)生在腫瘤治療中，由于腫瘤微環(huán)境中出現(xiàn)了代償途徑以逃避ICIs誘導的抗腫瘤反應(yīng)，這可能是腫瘤內(nèi)在因素的結(jié)果，如腫瘤細胞上免疫調(diào)節(jié)分子的表達改變，或腫瘤微環(huán)境內(nèi)的細胞因子/生長因子/趨化因子環(huán)境、腫瘤浸潤免疫細胞分子表達、腫瘤浸潤淋巴細胞組成等外源性因素（圖1）。

圖1 Tregs介導的ICIs獲得性耐藥機制［5］Fig.1 Tregs-mediated acquired resistance to ICIs［5］

3.1 Treg其他檢查點的表達升高抑制Teff活化除CTLA-4和PD-1外，腫瘤微環(huán)境內(nèi)的Treg其他免疫檢查點/共抑制受體，如細胞免疫球蛋白黏蛋白-3（T cell immunoglobulin and mucin domain 3，TIM-3）、淋巴細胞活化基因-3（lymphocyte-activation gene 3，LAG-3）、含Ig及ITIM結(jié)構(gòu)域的T細胞免疫受體（T cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domains，TIGIT）和T細胞活化的V區(qū)免疫球蛋白抑制劑（V-domain immunoglobulin suppressor of T cell activation，VISTA），在ICIs治療后表現(xiàn)出代償性表達上調(diào)。Treg上這些分子的上調(diào)水平阻斷了Teff的激活，增加Tregs積累并促發(fā)腫瘤。

3.1.1 TIM-3 TIM-3最初認為是由CD4+IFN-γ?Th1細胞選擇性表達，且其作用僅限于調(diào)節(jié)Teff功能和細胞因子的產(chǎn)生，近年來，在肺癌、宮頸癌、卵巢肝癌、結(jié)腸癌和小鼠腫瘤組織中均檢測到大量TIM-3+Treg。此外，從黑色素瘤和結(jié)腸癌小鼠模型的腫瘤組織中釋放的IL-10、顆粒酶和穿孔素的水平結(jié)果可得出，TIM-3+Tregs比TIM-3?Tregs顯示出更強的抑制活性。OWEIDA等［19］研究發(fā)現(xiàn)，TIM-3分子在CD8+T細胞和Treg中補償性上調(diào)以對抗PD-L1 mAb聯(lián)合放療的治療，并導致腫瘤復發(fā)、降低頭頸部生存率；抗TIM-3和抗PD-L1聯(lián)合治療可以增加CD8+T/Treg比率，并延遲腫瘤生長。以上研究表明TIM-3+Tregs高表達參與了腫瘤的復發(fā)和進展，從而對抗PD-1/PD-L1治療產(chǎn)生耐藥性。

3.1.2 LAG-3免疫檢查點LAG-3廣泛表達于活化的Treg、Teff、B淋巴細胞、NK細胞和樹突狀細胞表面，以高于CD4的親和力與APC上的MHCⅡ結(jié)合，引起抗原特異性CD4+Teff反應(yīng)和細胞因子的表達下調(diào)。有研究表明，LAG-3還有另一種配體，即腫瘤細胞表達半乳凝素-3（galectin-3），兩者結(jié)合后通過抑制細胞毒性T細胞的活化來消除腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫［20］。LAG-3+Treg表現(xiàn)出更強的增殖和免疫逃逸能力，而抗PD-1治療能夠上調(diào)CD4+T細胞表面LAG-3的表達，這或許是乳腺癌對PD-1抗體治療獲得性耐藥的一個原因［21］。

3.1.3 TIGIT TIGIT在活化的CD4+T細胞、CD8+T細胞、Tregs和NK細胞表面表達。TIGIT在T細胞表面與CD226競爭，在樹突狀細胞表面與CD112和CD155配體競爭，導致Teff激活受到抑制。ZHANG等［22］研究發(fā)現(xiàn)，抗TIGIT治療可以促進PD-1抗體的抗腫瘤效應(yīng)，這也提示，Treg表面TIGIT的表達上調(diào)可能與ICIs的耐藥有關(guān)。

3.1.4 VISTA VISTA屬 于CD28-B7家 族，在Tregs、Teffs、NK細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞表面表達。VISTA與其配體V-Set和VSIG-3結(jié)合，阻止Teff增殖，并降低其細胞因子的釋放，同時還作用于幼稚T細胞并誘導其分化為Treg。阻斷VISTA可以增強Teff在小鼠腫瘤中的聚集和激活，減少Treg和髓系源性抑制細胞數(shù)目，從而誘導抗腫瘤免疫應(yīng)答。與上述分子一樣，PD-1抗體治療也會引起VISTA+T細胞的表達上調(diào)，進而參與ICIs治療的獲得性耐藥［23］。

3.2 Treg誘導的TGF-β的激活和產(chǎn)生Treg誘導的TGF-β激活（膜結(jié)合形式）和可溶性形式的釋放可能是Treg促進腫瘤生長/進展和抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)的一個機制。腫瘤微環(huán)境中，免疫抑制性腫瘤內(nèi)Treg細胞的特點是分泌高水平的TGF-β。TGF-β反過來又是誘導FOXP3表達、Treg分化和穩(wěn)定性以及Treg抑制活性的關(guān)鍵因子，同時，TGF-β還能抑制腫瘤微環(huán)境CD8+淋巴細胞的浸潤［24］。另一方面，ICI治療還能激活腫瘤細胞TGF-β/Smad3信號通路［25］。簡而言之，Treg誘導的TGF-β的激活和產(chǎn)生可能參與了ICIs治療的獲得性耐藥。

3.3 其他ICIs治療使腫瘤微環(huán)境中Treg細胞發(fā)生凋亡，而凋亡的Treg細胞則通過腺苷代謝途徑，進一步增加自身的腫瘤免疫逃逸作用，進而參與ICIs的獲得性耐藥［26］。

4 治療策略

綜上，ICIs獲得性耐藥與腫瘤微環(huán)境中Tregs密切相關(guān)，靶向Tregs治療是消除ICIs耐藥性的有效手段。在未來的研究中，可以從Tregs表面免疫檢查點蛋白、GITR、TGF-β信號等尋找靶點，特別是采用聯(lián)合治療的策略以增強腫瘤患者對ICIs治療的響應(yīng)。免疫共刺激分子和共抑制分子，特別是腫瘤壞死因子受體超家族的一些免疫檢查點分子，如OX40、誘導T細胞共刺激分子（inducible T cell co-stimulator，ICOS）和糖皮質(zhì)激素誘導的TNFR家族相關(guān)基因（glucocorticoid-induced TNFR family related gene，GITR）也被用作Treg靶向治療。GITR單克隆抗體DTA-1亦被證實能夠下調(diào)腫瘤浸潤組織中Treg FOXP3的表達，GITR抗體聯(lián)合ICIs治療還能夠進一步增加Teff細胞的腫瘤殺傷效應(yīng)［27-28］。在Treg中，靶向TGF-β可能是抗腫瘤治療的另一種方法。如RAVI等［29］研究發(fā)現(xiàn)，CTLA-4或PD-L1抗體治療聯(lián)合抑制TGF-β信號，能夠顯著降低腫瘤組織浸潤的Treg細胞數(shù)量，促進黑色素瘤小鼠模型的抗腫瘤細胞毒性作用。

5 結(jié)論與展望

對ICIs的反應(yīng)完全取決于腫瘤微環(huán)境中分子和細胞網(wǎng)絡(luò)的類型。腫瘤組織若存在較高的腫瘤突變負荷、大量高免疫抑制性免疫細胞，如表達高水平CTLA-4和PD-1的Treg，則采用單一或聯(lián)合免疫檢查點抑制劑治療較為有效。隨著時間的推移，腫瘤細胞在治療壓力選擇下，通過產(chǎn)生更多的自身抗原來增強Treg功能，并通過尋找代償途徑來逃避抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而降低腫瘤的免疫原性并產(chǎn)生了獲得性耐藥。為了克服這種耐藥性并提高抗腫瘤免疫反應(yīng)，新的ICIs、聯(lián)合其他ICIs或小分子抑制劑（如代謝抑制劑、表觀遺傳修飾劑和免疫刺激劑）的研究也是非常有益的嘗試。另一方面，在治療期間及治療之后，測定外周血和腫瘤組織中Treg的水平/表型對于判斷與Treg介導的ICIs獲得性耐藥的生物標志物亦至關(guān)重要。這些研究將有助于確定最適合癌癥患者的治療方法，并最大限度地提高治療效果。