流感病毒繼發(fā)細菌感染加重的免疫學機制研究進展①

胡子琪 張須龍（首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學系，北京 100069）

流感病毒是造成全球季節(jié)性呼吸道疾病的重要病原體，是一種具有高度傳染性的RNA病毒。雖然多數(shù)感染患者能自愈，但部分患者會出現(xiàn)急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征或繼發(fā)細菌性肺炎而致死［1］。流感大流行和季節(jié)性流行期間，流感病毒繼發(fā)細菌感染導(dǎo)致的細菌性肺炎是導(dǎo)致患者死亡的首要原因［2-4］。流感病毒感染可損傷呼吸道上皮細胞，易繼發(fā)細菌感染，導(dǎo)致重癥肺臟免疫損傷、呼吸窘迫，甚至死亡。流感病毒繼發(fā)細菌感染急性加重性肺炎已得到廣泛研究，其加重的機制，涉及宿主、病毒和細菌等多因素［5-6］。本文就流感病毒繼發(fā)細菌感染的流行病學和易感機制的研究進展進行綜述。

1 流行病學研究

據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心估計，在2017?2018年的流感季，美國共有4 880萬人發(fā)生感染，7.94萬人因流感死亡，是自2009年流感大流行以來的最高發(fā)病率和病死率，而全球估計每年有29.1~64.5萬人死于流感相關(guān)的呼吸道感染［7-8］。歷史上共有4次流感大流行，在1918年流感大流行期間，超過5 000萬人死亡，而95%以上的重癥和死亡是由于流感病毒繼發(fā)細菌（主要是肺炎鏈球菌）感染［9］。1957?1958年大流行期間，即使存在抗生素，繼發(fā)細菌性肺炎造成的死亡比例仍高達44%，且75%的死亡病例有金黃色葡萄球菌感染的細菌學證據(jù)［10］。1968?1969年大流行期間，肺炎的發(fā)病率與1957年相當，肺炎鏈球菌再次成為主要病原體［11］。2009年大流行期間，患者病死率與季節(jié)性流感相似，住院患者中約有一半出現(xiàn)細菌性肺炎，死亡病例以年輕人居多，且繼發(fā)細菌感染的比例為25%~50%，肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌感染是最常見的病因［12-15］。因此，流感病毒繼發(fā)細菌感染是流感流行期間致死的重要原因。

2 易感機制

流感病毒和細菌共感染是否導(dǎo)致高病死率首先取決于兩種病原體的感染順序和時間［16］。在患者和小鼠的感染模型中，肺部流感病毒的滴度于感染后3~5 d達到峰值，第6天肺組織損傷最嚴重，在10~12 d病毒被清除。而繼發(fā)細菌感染的最高易感時間從流感病毒感染后的第7天左右開始，持續(xù)約1周，說明此易感性是由于機體先天性免疫功能受損所引起，而非適應(yīng)性免疫應(yīng)答［17-19］。此外，由于宿主與病原體相互作用的復(fù)雜性，使免疫機制在聯(lián)合感染的發(fā)展中起關(guān)鍵作用，其中抗病毒免疫雖然對病毒清除至關(guān)重要，但也可能增加繼發(fā)細菌感染的易感性，如流感病毒感染誘導(dǎo)過度炎癥反應(yīng)損傷肺上皮細胞，從而破壞肺臟上皮屏障，增加細菌結(jié)合位點；流感病毒感染晚期肺臟固有免疫應(yīng)答被抑制，導(dǎo)致抗菌水平降低，這些都被認為是促進細菌共感染的原因［17］。而最近的研究更多集中在流感病毒感染誘導(dǎo)的抗細菌先天免疫功能受損（圖1），本文將對肺臟天然免疫細胞和細胞因子在流感病毒繼發(fā)細菌感染中的作用及所誘導(dǎo)的細菌性肺炎的機制進行歸納和總結(jié)。

2.1 天然免疫細胞

2.1.1 巨噬細胞 肺臟巨噬細胞主要為駐留在肺泡內(nèi)的肺泡巨噬細胞（alveolar macrophage，AM），還有少量駐留在肺實質(zhì)的間質(zhì)巨噬細胞（interstitial macrophage，IM）。而AM是肺臟首先接觸流感病毒和細菌的免疫細胞，構(gòu)成抵御細菌入侵的第一道防線［20-22］。

在天然免疫應(yīng)答方面，一些研究認為流感病毒感染過程中肺臟AM數(shù)量基本不變，但誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子抑制了AM的抗菌免疫能力，繼而增加宿主對繼發(fā)細菌感染的易感性。如SUN等［18］發(fā)現(xiàn)流感病毒感染小鼠T細胞產(chǎn)生的IFN-γ可通過下調(diào)AM的A類清道夫受體MARCO表達抑制其吞噬功能。而WU等［22］研究發(fā)現(xiàn)通過靶向Nrf2信號或Akt-TFEBMARCO途徑可增加MARCO表達，可能是流感病毒繼發(fā)細菌性肺炎的有效治療方法。還有研究揭示流感病毒繼發(fā)細菌感染后，STAT2信號通路通過調(diào)節(jié)C型凝集素受體（C-type lectin receptors，CLRs）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide syn‐thase，iNOS）表達，抑制巨噬細胞活化，導(dǎo)致機體對細菌的殺傷和清除不足［23］（圖1）。

圖1 天然免疫細胞和細胞因子在流感病毒繼發(fā)細菌感染中的免疫機制Fig.1 Immunological mechanism of innate immune cells and cytokines in secondary bacterial infection following influenza virus

但也有一些研究證明流感病毒在一定時期內(nèi)可通過誘導(dǎo)細胞凋亡介導(dǎo)AM耗竭，導(dǎo)致肺部清除細菌能力明顯不足［21，24-25］。而BANSAL等［26］發(fā)現(xiàn)IL-1信號通路可阻止AM的耗竭，在宿主抵抗流感病毒和肺炎球菌共感染中起關(guān)鍵作用。此外，重組粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）局部治療或在肺中過表達GM-CSF能在細菌感染早期適度增加AM和中性粒細胞浸潤，激活胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS），增強其抗菌能力并改善小鼠生存率［27-28］。

另外在宿主耐受性損傷方面，膜Ⅰ型基質(zhì)金屬蛋白酶（membrane typeⅠmatrix metalloprotease，MT1-MMP）是流感病毒感染中顯著升高的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）重構(gòu)膠原酶。病毒感染后肺部MT1-MMP主要來源于巨噬細胞，選擇性抑制MT1-MMP可保護組織免受感染相關(guān)的組織損傷，維持基底膜的完整性，阻止繼發(fā)細菌感染，預(yù)防敗血癥［29］。

綜上所述，流感病毒感染通過耗竭AM，或損傷AM的抗菌功能以及促進其產(chǎn)生MT1-MMP損傷基底膜，降低早期檢測和殺菌能力，增加宿主對細菌的易感性。

2.多音型過腔。如“昆南”中陰平聲字“驚”的唱調(diào)（《牡丹亭·游園》【醉扶歸】“沉魚落雁鳥驚喧”，706）。其中的過腔即為多音?！袄ケ薄敝嘘柸ヂ曌帧芭钡某{(diào)(《長生殿·絮閣》【喜遷鶯】“弄鬼裝妖”，777），其中的過腔即為多音型過腔。

2.1.2 單核細胞 外周血中單核細胞至少存在兩個主要亞群，一種是經(jīng)典的Ly6Chi單核細胞，也稱炎癥單核細胞、滲出性巨噬細胞（exudate macrophage，exMAC）、產(chǎn)生TNF-α/iNOS的樹突狀細胞（TNF-α/iNOS-producing DC，TipDC）或TRAIL+單核細胞，其特征是趨化因子受體2（CCR2）高表達，并在流感病毒繼發(fā)細菌感染中起重要作用［30-32］。另一種是非經(jīng)典的Ly6Clo單核細胞，為抗炎單核細胞，缺乏CCR2的表達，小鼠外周血中還含有Ly6Cint單核細胞，為單核細胞分化的中間產(chǎn)物［33-34］。

流感病毒感染可招募CCR2+炎癥單核細胞到肺臟，增強肺部炎癥、清除病毒，但也同時加重肺臟免疫損傷，敲除CCR2可顯著提高流感病毒感染后的生存率［30］。而在后續(xù)細菌感染加重機制中，ELLIS等［32］發(fā)現(xiàn)這些炎癥單核細胞通過一種依賴于腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosisinducing ligand，TRAIL）的機制，在流感病毒感染后損傷肺部屏障，有助于增加細菌定植，促使細菌侵襲全身。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)流感病毒募集的炎癥單核細胞可作為金黃色葡萄球菌胞內(nèi)存活的宿主，從而提高了金黃色葡萄球菌對抗生素的耐藥性［35］。以上結(jié)果表明炎癥單核細胞由于對病毒和細菌清除的相互沖突導(dǎo)致了聯(lián)合感染加重。

2.1.3 中性粒細胞 中性粒細胞是宿主清除細菌的關(guān)鍵細胞，而抑制中性粒細胞募集是流感病毒感染后易繼發(fā)細菌感染的關(guān)鍵致病機制，流感病毒誘導(dǎo)的Ⅰ型IFN（IFN-Ⅰ）及下游信號，可通過抑制IL-17介導(dǎo)免疫應(yīng)答抑制中性粒細胞的募集和功能［36-37］。在繼發(fā)肺炎鏈球菌中，IFN-Ⅰ選擇性地抑制中性粒細胞趨化因子KC/CXCL1和MIP-2/CXCL2的產(chǎn)生，導(dǎo)致抗細菌感染的早期階段中性粒細胞應(yīng)答低下［19］。流感病毒還可抑制粒細胞集落刺激因子（GCSF）分泌、降低髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性，造成中性粒細胞吞噬和清除細菌的功能障礙，引發(fā)細菌感染［38］。

中性粒細胞可能是肺臟金黃色葡萄球菌感染最重要的吞噬細胞亞群［39-40］。中性粒細胞內(nèi)NADPH氧化酶介導(dǎo)吞噬和殺菌過程中ROS的產(chǎn)生，稱為氧化爆發(fā)，而中性粒細胞具有比巨噬細胞更強的氧化爆發(fā)能力。NADPH氧化酶主要的功能亞基NADPH氧化酶2（nicotinamide adenine dinucle‐otide phosphate oxidase 2，Nox2）在吞噬細胞中的活性對清除金黃色葡萄球菌至關(guān)重要，而流感病毒感染抑制NADPH活性，減少吞噬細胞內(nèi)ROS水平，降低其細菌清除能力［41］。后續(xù)研究也發(fā)現(xiàn)Nox2不但介導(dǎo)抗菌反應(yīng)，而且也參與組織炎癥性損傷。在合并感染時，Nox2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激增加炎癥細胞的壞死死亡，對周圍組織造成致命損傷，聯(lián)合使用抗生素和NADPH氧化酶抑制劑可顯著提高存活率［42］。因此，Nox2的激活在共感染時具有雙刃劍作用，流感病毒感染破壞依賴于Nox2的抗菌免疫和炎癥之間的平衡，既增加細菌感染的易感性，又導(dǎo)致廣泛的肺損傷。

2.1.4 樹突狀細胞（dendritic cell，DC）DC是促炎細胞因子IL-12的主要來源，誘導(dǎo)Th1細胞分化并激活其他天然免疫細胞產(chǎn)生細胞因子，在調(diào)節(jié)天然和適應(yīng)性免疫反應(yīng)方面發(fā)揮核心作用。單核細胞來源的DC（monocyte-derived DC，moDC）是感染肺臟最常見的DC，可激活并誘導(dǎo)初始T細胞增殖分化，在宿主防御細菌性肺炎中起重要作用［30］。流感病毒感染的人moDC分泌IFN-Ⅰ和其他可溶性因子，繼而顯著上調(diào)周圍DC的TLR3表達，通過識別結(jié)合肺炎鏈球菌RNA增強IL-12分泌，是繼發(fā)肺炎鏈球菌感染誘導(dǎo)DC分泌IL-12的關(guān)鍵機制之一［43］。

與單核細胞相似，GURCZYNSKI等［44］發(fā)現(xiàn)流感病毒感染的ccr2-/-DC產(chǎn)生高水平的IL-6和IL-23，誘導(dǎo)Th17分化和IL-17產(chǎn)生，以及肺泡上皮細胞IL-17R上調(diào)，從而促進CXCL1/2產(chǎn)生，趨化更多中性粒細胞，靶向CCR2可能是調(diào)控流感病毒繼發(fā)細菌感染易感性的潛在治療策略。

2.1.5 自然殺傷（natural killer，NK）細胞NK細胞既能清除病毒感染細胞，又能分泌抗病毒細胞因子，是抑制流感病毒感染的重要細胞［45］。SMALL等［46］研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒感染抑制NK細胞分泌TNF-α的水平，并抑制繼發(fā)細菌感染中NK細胞的募集和活化信號，繼而抑制AM對金黃色葡萄球菌的吞噬作用。說明肺臟NK細胞分泌TNF-α的功能減弱不但降低自身殺傷功能，而且抑制AM的抗菌活性，是流感病毒繼發(fā)細菌感染的關(guān)鍵機制之一。

2.2 細胞因子 過度免疫應(yīng)答是重癥流感病毒感染高病死率的關(guān)鍵機制，而細胞因子是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并在機體流感病毒繼發(fā)細菌性肺炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)流感病毒誘導(dǎo)的多種細胞因子對繼發(fā)細菌性肺炎易感性有重要影響［47］。

流感病毒誘導(dǎo)的IFN-Ⅰ可通過抑制Th17型免疫、降低細菌清除能力而增加繼發(fā)感染易感性［1］。STAT1是IFN下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)IAV感染誘導(dǎo)的宿主炎癥反應(yīng)［48］。在流感病毒繼發(fā)MRSA感染中，LEE等［37］研究發(fā)現(xiàn)，stat1-/-小鼠的Th17型免疫極化增加，證明STAT1信號通路通過調(diào)控Th17型免疫極化，調(diào)節(jié)呼吸道細菌感染的關(guān)鍵細胞因子家族Th17相關(guān)細胞因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)流感病毒繼發(fā)細菌感染的易感性。

流感病毒感染誘導(dǎo)的IFN-γ激活單核細胞、NK細胞和巨噬細胞，增強組織炎癥反應(yīng)，但抑制中性粒細胞募集和活化，降低肺臟清除胞外細菌感染的能力［18，48］。與IFN-Ⅰ相似，流感病毒誘導(dǎo)的IL-13和IFN-γ之間也存在感染不同時間影響繼發(fā)細菌感染易感性，在流感病毒感染后3 d內(nèi)，IL-13通過抑制IFN-γ而增強細菌清除能力；而在病毒感染第7天，IL-13誘餌受體IL-13Rα2水平的增加抑制了IL-13信號傳導(dǎo)，進而促進IFN-γ信號，在一定程度上加重細菌性肺炎［49］。

Ⅲ型IFN（也稱IFN-λ、IL-28和IL-29）是呼吸道上皮細胞最早產(chǎn)生的主要IFN［50-51］。高表達的Ⅲ型IFN可導(dǎo)致上呼吸道微生物群的增加和重組，而敲除IFN-λ受體降低小鼠在MRSA單獨或聯(lián)合感染的細菌載量，其機制為增加IL-22及中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）等抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）表達［52］。IFN-λ還可通過抑制中性粒細胞的遷移和吞噬功能減少對細菌的攝?。?3］。

2.2.2 白介素（interleukin，IL）

2.2.2.1 IL-1 IL-1在重癥流感病毒感染時加重急性肺臟免疫病理反應(yīng)，但在抵御繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染中起保護作用。在共感染小鼠模型中，IL-1增強肺臟免疫細胞對細菌的清除能力，敲除IL1R1顯著增加細菌載量和死亡率［26］。

2.2.2.2 IL-6流感病毒感染以及繼發(fā)細菌感染后，IL-6的水平顯著升高，激活多種免疫細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［16，54］。繼發(fā)細菌感染后，IL-6誘導(dǎo)巨噬細胞表面MARCO表達增加，增強其吞噬能力，降低繼發(fā)肺炎鏈球菌感染的易感性，而IL-6敲除小鼠肺臟細菌載量增加，加重肺損傷并伴有高死亡率［55］。

2.2.2.3 IL-10 IL-10是流感病毒感染過程中產(chǎn)生的介導(dǎo)免疫抑制的重要抗炎因子，流感病毒感染后產(chǎn)生的過量IL-10抑制中性粒細胞的功能而易引發(fā)呼吸道肺炎鏈球菌感染，流感病毒誘導(dǎo)的肺臟IL-10也抑制moDC產(chǎn)生IL-12，抑制恒定自然殺傷T（invariant natural killer T，iNKT）細胞的激活，降低其抗細菌感染能力［56-57］。因此IL-10是流感病毒感染后促進細菌性肺炎發(fā)生的重要細胞因子。

2.2.2.4 IL-22流感病毒感染后誘導(dǎo)肺臟產(chǎn)生IL-22及相關(guān)細胞因子。在繼發(fā)細菌感染中，IL-22可通過增強呼吸道上皮完整性和誘導(dǎo)AMPs產(chǎn)生，促進肺臟抵御繼發(fā)細菌感染［58］?？扇苄哉T餌受體IL-22結(jié)合蛋白（IL-22-binding protein，IL-22BP）抑制IL-22功能或敲除IL-22的小鼠流感病毒感染模型中，因氣道上皮完整性降低而損害上皮屏障功能，加重繼發(fā)細菌感染誘導(dǎo)的肺損傷［59］。

2.2.2.5 IL-27流感病毒感染后通過IFNAR信號通路誘導(dǎo)IL-27產(chǎn)生。IL-27不但下調(diào)肺炎鏈球菌激活的DC分泌IL-23和IL-1β，而且通過STAT1調(diào)控γδT細胞活性、抑制其IL-17A的產(chǎn)生，抑制中性粒細胞的募集和其胞內(nèi)MPO的活性，降低對繼發(fā)肺炎鏈球菌的固有免疫應(yīng)答［36］。因此流感病毒誘導(dǎo)的IL-27信號促進了繼發(fā)細菌性肺炎的發(fā)展。

2.2.2.6 IL-33 IL-33具有促炎和抗炎的雙重作用。在感染和過敏性疾病模型中，IL-33通過誘導(dǎo)IL-5和IL-13等促進Ⅱ型免疫應(yīng)答［60-61］。而在流感病毒感染模型中，IL-33的分泌被抑制，減少了中性粒細胞向肺臟黏膜屏障募集，降低肺臟對繼發(fā)細菌感染的清除能力，因此IL-33在機體抗菌黏膜屏障免疫中起關(guān)鍵作用［40］。

3 總結(jié)與展望

肺臟固有免疫系統(tǒng)可通過協(xié)調(diào)多種免疫細胞和細胞因子的反應(yīng)，有效抵御肺臟細菌感染而維持免疫平衡。而先前的流感病毒通過多種機制影響AM的數(shù)量與功能，募集炎癥單核細胞，抑制中性粒細胞和NK細胞的趨化與活化，以及影響多種細胞因子間的相互作用，降低機體肺臟抗菌免疫應(yīng)答，損傷肺部屏障，利于繼發(fā)細菌的入侵和定植，導(dǎo)致嚴重的肺臟損傷。

目前臨床上鮮有治療流感繼發(fā)細菌感染的方法，主要是聯(lián)合抗流感藥物和多種抗生素用藥。但由于細菌多重耐藥性的逐漸增加，抗生素的效果越來越差，而接種細菌疫苗也不能很好地降低流感后細菌性肺炎的發(fā)生［53，62］。不過目前有研究發(fā)現(xiàn)一種依賴IFN的調(diào)節(jié)機制，在保護抗菌功能的同時防止過度免疫病理反應(yīng)，而當重新激活肺臟天然免疫應(yīng)答可顯著降低繼發(fā)細菌感染的易感性，可能是一種新的預(yù)防和治療流感病毒繼發(fā)細菌感染的免疫調(diào)節(jié)策略［48，28］。此外，如前所述無論是IFN-Ⅰ信號表達的差異，還是IL-13對IFN-γ的作用，在流感病毒感染的不同時間具有不同的作用，合適的干預(yù)時間和靶點是流感病毒繼發(fā)細菌感染誘發(fā)細菌肺炎免疫治療的關(guān)鍵因素，錯誤的干預(yù)時間反而可能增加細菌的易感性。另外，免疫細胞及相關(guān)分子在病毒感染和細菌感染中的作用也不同。因此，得當?shù)闹委煏r間和合適的治療靶點是流感病毒繼發(fā)細菌感染免疫治療的重要因素。

綜上所述，深入了解肺臟天然免疫細胞和細胞因子在流感病毒繼發(fā)細菌感染中的作用及機制，有助于發(fā)現(xiàn)新的病毒繼發(fā)細菌感染治療靶點、開發(fā)潛在的免疫療法治療途徑、降低病毒繼發(fā)細菌感染的發(fā)病率、提高病毒繼發(fā)細菌感染患者的存活率。