基于STAT1信號通路探討疏風(fēng)通絡(luò)方對支氣管哮喘小鼠Th1/Th2失衡的影響①

鐘新春 朱振剛 劉超武 喬亞珍 熊 桅

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381）

支氣管哮喘是人體內(nèi)多種細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等）及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，通常伴有氣道高反應(yīng)性，出現(xiàn)廣泛多變的可逆性氣流受限，并可引起反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，常在夜間和清晨發(fā)作、加劇，多數(shù)患者可自行緩解或經(jīng)治療后緩解［1-4］。目前，哮喘是世界上較為常見的慢性病之一，且其患病率逐年升高，給患者的生活質(zhì)量和身體健康帶來很大影響［5-7］。相關(guān)研究指出，哮喘是一種免疫性疾病，輔助性T淋巴細(xì)胞亞群中Th1/Th2失衡是哮喘免疫學(xué)發(fā)病的基礎(chǔ)［7］。部分研究認(rèn)為，哮喘發(fā)病過程中Th1型免疫反應(yīng)減弱而Th2型免疫反應(yīng)異常增強(qiáng)，Th1型細(xì)胞因子IL-12、IFN-γ等分泌減少，而Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等細(xì)胞因子增多［8-9］。本研究旨在通過實驗分析疏風(fēng)通絡(luò)方對支氣管哮喘小鼠模型的干預(yù)作用，研究疏風(fēng)通絡(luò)方在STAT1、IL-27通路中的作用，初步分析疏風(fēng)通絡(luò)方調(diào)控STAT1信號通路緩解Th1/Th2免疫平衡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 實驗小鼠30只，體質(zhì)量（150±20）g，購自河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK（豫）2017-0001，于普通環(huán)境的動物房飼養(yǎng)，鼠籠安靜整潔，室內(nèi)溫度保持在15~25℃，空氣流通干燥。

1.1.2 藥物 疏風(fēng)通絡(luò)方方劑由炙麻黃、荊芥、厚樸、甘草各6 g、僵蠶、地龍、杏仁、黃芩、半夏各10 g、丹參30 g熬制而成。選擇小鼠與人等效劑量的倍數(shù)為5.98。處方總劑量200 g，如給體質(zhì)量60 kg的成人每日服用1劑，則成人劑量為3.33 g/（kg·d），小鼠等效劑量為19.93 g/（kg·d），約為20 g/（kg·d）。

1.1.3 試劑及儀器 卵蛋白（OVA）購自Sigma公司；氫氧化鋁佐劑購自美國賽默飛世爾科技公司；重組人IL-27購自美國eBioscience公司；特異性STAT1抑制劑購自美國Selleck公司；β-actin抗體、IFN-γ ELISA試劑盒、IL-4 ELISA試劑盒購自Abcam公司；IFN-γ抗體、pSTAT1抗體、STAT1抗體、IL-4抗體購自美國BioLegend公司；化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自中國北京索萊寶公司；PVDF膜購自瑞士羅氏公司；霧化器購自北京九州晟欣科技有限公司（中國）；煙熏箱購自Teague Enterprises公司；切片機(jī)購自德國徠卡有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模30只實驗級小鼠按照隨機(jī)分配原則分為對照組、模型組、IL-27組、疏風(fēng)通絡(luò)方組和疏風(fēng)通絡(luò)方+STAT1抑制劑組，每組6只。模型組小鼠在實驗第1天和第7天腹腔注射OVA（100 mg）、氫氧化鋁（100 mg）混合液1 ml致敏，第15天開始每天1%OVA滴鼻激發(fā)，持續(xù)7 d，末次激發(fā)后次日處死小鼠。IL-27組小鼠在實驗前7 d及開始實驗后7 d于麻醉狀態(tài)下鼻腔滴入IL-27溶液，早晚各1次，200 ng/次，剩余步驟同模型組。疏風(fēng)通絡(luò)方組小鼠在實驗第15天開始，于激發(fā)前1 h給藥［20 g/（kg·d）］，1次/d，連續(xù)7 d，剩余步驟同模型組。疏風(fēng)通絡(luò)方+STAT1抑制劑組小鼠在實驗第15天開始于激發(fā)前1 h給藥，同時腹腔注射80 mg/kg Fludarabine（抑制劑），1次/d，連續(xù)7 d，剩余步驟同模型組。正常組小鼠用等劑量生理鹽水致敏和激發(fā)，剩余步驟同模型組。

1.2.2 造模過程小鼠的一般情況 觀察造模全過程各組小鼠行為學(xué)變化，包括呼吸情況、精神狀態(tài)、運動情況等。

1.2.3 咳嗽敏感性測定 最后一次給藥后靜置30 min，將各組小鼠轉(zhuǎn)移至密閉燒杯，采用辣椒素溶液進(jìn)行霧化，濃度為1×10?4mol/L，持續(xù)4 min，霧化停止后靜置4 min，記錄8 min內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù)。

1.2.4 血清及支氣管肺泡灌洗液中IL-4及IFN-γ表達(dá)5組小鼠剖腹后，分離腹主動脈取血，37℃水浴15 min至凝，1 500 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，分離血清，?80℃冰箱保存。分離取出完整的氣管、支氣管和肺組織，結(jié)扎左側(cè)主支氣管，于右肺進(jìn)行氣管插管肺泡灌洗，每次注入2 ml生理鹽水，抽吸3次后收集液體，重復(fù)3次，1 500 r/min離心10 min，離心半徑13.5 cm，上清液于?80℃冰箱保存。根據(jù)試劑盒說明書檢測IL-4和IFN-γ表達(dá)水平。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測 無菌取出脾臟，置于含RPMI1640培養(yǎng)基的EP管中制備單細(xì)胞懸浮液，接種于96孔板，每孔200 μl，與乙酸肉豆蔻佛波醇（PMA，50 ng/ml）和離子霉素（1 g/L）在5%CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h。以抗小鼠CD3和CD4抗體4℃下標(biāo)記細(xì)胞30 min。將細(xì)胞固定于Perm/Wash緩沖液中，在黑暗中透化20 min，加入IFN-γ和IL-4抗體，4℃孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞。

1.2.6 HE染色觀察小鼠肺組織炎癥情況 分別取右側(cè)支氣管肺組織，常規(guī)石蠟包埋、制片、按照HE染色試劑盒說明操作，顯微鏡下觀察肺內(nèi)氣道炎癥變化。

1.2.7 Western blot檢測pSTAT1和STAT1蛋白水平 蛋白上清液測總蛋白含量，加入緩沖液煮沸5 min，取50 mg蛋白上樣，10%凝膠電泳分離總蛋白并電轉(zhuǎn)至PVDF膜；脫脂奶粉封閉，1∶1 000稀釋的pSTAT1、STAT1和GAPDH抗體雜交，TBST反復(fù)清洗3次后，1∶5 000稀釋的羊抗IgG雜交，清洗3次，超敏ECL化學(xué)發(fā)光顯像，凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描各蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參蛋白。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 收集的所有實驗數(shù)據(jù)均采用例數(shù)（n）或±s形式記錄，數(shù)據(jù)分析用F檢驗。所有統(tǒng)計學(xué)分析均采用SPSS23.0軟件完成，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模過程中五組小鼠一般情況 對照組小鼠呼吸平穩(wěn)、無喘息，精神狀況正常，運動良好，毛發(fā)顏色正常。模型組小鼠出現(xiàn)呼吸困難、喘息、咳嗽、腹肌痙攣等情況，精神不振，運動大幅減少，毛發(fā)暗淡，出現(xiàn)點頭運動并伴隨前肢縮抬，身體消瘦等。IL-27組小鼠造模后表現(xiàn)同模型組，使用IL-27鼻腔滴注后小鼠喘息、咳嗽得到一定程度緩解，精神恢復(fù)，小鼠毛發(fā)顏色逐漸恢復(fù)正常。疏風(fēng)通絡(luò)方組造模后表現(xiàn)同模型組，用藥后呼吸平穩(wěn)，精神恢復(fù)，運動自如，體質(zhì)量逐漸增加。疏風(fēng)通絡(luò)方+STAT1抑制劑組小鼠造模后同模型組，用藥后未見明顯改變。

2.2 各組小鼠咳嗽情況 與對照組相比，模型組小鼠咳嗽次數(shù)增加(P<0.05)；與模型組相比，IL-27組和疏風(fēng)通絡(luò)方組小鼠咳嗽次數(shù)減少(P<0.05)；與IL-27組和疏風(fēng)通絡(luò)方組相比，疏風(fēng)通絡(luò)方+STAT1抑制劑組小鼠咳嗽次數(shù)增加(P<0.05)，見表1、圖1。

圖1 各組小鼠咳嗽情況Fig.1 Cough situation of mice in each group

表1 各組小鼠咳嗽次數(shù)（±s，n=6）Tab.1 Cough times of mice in each group（±s，n=6）

表1 各組小鼠咳嗽次數(shù)（±s，n=6）Tab.1 Cough times of mice in each group（±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with Shufeng Tongluo prescription+STAT1 inhibitor group，3）P<0.05.

Groups Control Model IL-27 Shufeng Tongluo prescription Shufeng Tongluo prescription+STAT1 inhibitor FP Cough 1.31±0.26 12.55±3.211）5.89±1.271）2）3）4.76±1.331）2）3）9.13±1.251）2）36.024 0.000

2.3 血清及支氣管肺泡灌洗液中IL-4及IFN-γ的表達(dá) 與對照組相比，模型組小鼠血清及支氣管肺泡灌洗液中IL-4水平提高，IFN-γ水平降低(P<0.05)；與模型組相比，IL-27組和疏風(fēng)通絡(luò)方組小鼠IL-4水平降低，IFN-γ水平升高(P<0.05)；與IL-27組和疏風(fēng)通絡(luò)方組相比，疏風(fēng)通絡(luò)方+STAT1抑制劑組小鼠IL-4水平升高(P<0.05)；與疏風(fēng)通絡(luò)方組相比，疏風(fēng)通絡(luò)方+STAT1抑制劑組小鼠IFN-γ水平降低(P<0.05)，見表2、圖2。

表2 血清及支氣管肺泡灌洗液中IL-4及IFN-γ的表達(dá)（±s，n=6）Tab.2 Expressions of IL-4 and IFN-γ in serum and bronchoalveolar lavage fluid（±s，n=6）

表2 血清及支氣管肺泡灌洗液中IL-4及IFN-γ的表達(dá)（±s，n=6）Tab.2 Expressions of IL-4 and IFN-γ in serum and bronchoalveolar lavage fluid（±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with Shufeng Tongluo prescription+STAT1 inhibitor group，3）P<0.05.

Groups Control Model IL-27 Shufeng Tongluo prescription Shufeng Tongluo prescription+STAT1 inhibitor F P IL-4 Serum 10.12±0.91 29.98±6.351）11.23±2.562）3）12.96±2.582）3）20.56±4.321）2）28.566 0.000 Bronchoalveolar lavage fluid 1.35±0.67 16.59±4.491）1.15±0.522）3）2.21±1.612）3）12.68±3.561）2）44.240 0.000 IFN-γ Serum 21.35±4.73 12.39±4.311）17.09±2.351）2）18.63±1.352）3）13.55±2.911）7.136 0.001 Bronchoalveolar lavage fluid 32.56±4.51 14.36±3.961）20.15±2.291）2）26.56±3.391）2）3）17.84±4.421）21.882 0.000

圖2 血清及支氣管肺泡灌洗液中IL-4及IFN-γ表達(dá)Fig.2 Expressions of IL-4 and IFN-γ in serum and bron?choalveolar lavage fluid

2.4 Th1和Th2細(xì)胞比例比較 與對照組相比，模型組小鼠Th1/Th2降低(P<0.05)；與模型組相比，IL-27組和疏風(fēng)通絡(luò)方組小鼠Th1/Th2升高(P<0.05)；與IL-27組和疏風(fēng)通絡(luò)方組相比，疏風(fēng)通絡(luò)方+STAT1抑制劑組小鼠Th1/Th2降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠脾臟CD4+IFN-γ+、CD4+IL-4+及Th1/Th2比較（±s，n=6，%）Tab.3 Comparison of CD4+IFN-γ+，CD4+IL-4+and Th1/Th2 in spleen of mice in each group（±s，n=6，%）

表3 各組小鼠脾臟CD4+IFN-γ+、CD4+IL-4+及Th1/Th2比較（±s，n=6，%）Tab.3 Comparison of CD4+IFN-γ+，CD4+IL-4+and Th1/Th2 in spleen of mice in each group（±s，n=6，%）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with Shufeng Tongluo prescription+STAT1 inhibitor group，3）P<0.05.

Groups Control Model IL-27 Shufeng Tongluo prescription Shufeng Tongluo prescription+STAT1 inhibitor F P CD4+IFN-γ+28.79±4.31 14.56±3.211）19.25±3.691）2）3）24.36±4.021）2）3）15.29±3.431）15.720 0.000 CD4+IL-4+10.65±1.23 30.25±4.291）13.21±2.022）3）18.06±2.961）2）3）24.43±3.681）2）42.036 0.000 Th1/Th2 1.15±0.18 0.20±0.031）0.62±0.041）2）3）0.67±0.021）2）3）0.32±0.011）2）114.135 0.000

2.5 小鼠肺組織炎癥情況HE染色可見對照組小鼠肺泡及支氣管結(jié)構(gòu)正常，無明顯炎癥現(xiàn)象。模型組小鼠肺泡間隙變大，部分?jǐn)嚅_，炎癥反應(yīng)明顯，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，各級支氣管出現(xiàn)上皮細(xì)胞脫落及炎癥性滲出物。與模型組相比，IL-27組和疏風(fēng)通絡(luò)方組小鼠肺泡間隙減小，炎癥反應(yīng)減弱，支氣管上皮細(xì)胞腫脹、脫落減少。與疏風(fēng)通絡(luò)方組相比，疏風(fēng)通絡(luò)方+STAT1抑制劑組小鼠肺泡間隙增大，炎癥反應(yīng)增加，支氣管上皮細(xì)胞腫脹脫落增加（圖3）。

圖3 小鼠肺組織炎癥情況Fig.3 Inflammation of lung tissue in mice

2.6 pSTAT1和STAT1蛋白水平 五組小鼠肺組織內(nèi)STAT1蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與對照組相比，模型組小鼠pSTAT1蛋白水平降低(P<0.05)；與模型組相比，IL-27組和疏風(fēng)通絡(luò)方組小鼠pSTAT1蛋白水平表達(dá)升高(P<0.05)；與IL-27組和疏風(fēng)通絡(luò)方組相比，疏風(fēng)通絡(luò)方+STAT1抑制劑組小鼠pSTAT1蛋白水平表達(dá)降低(P<0.05，表4、圖4)。

表4 pSTAT1和STAT1蛋白水平（±s，n=6）Tab.4 pSTAT1 and STAT1 protein levels（±s，n=6）

表4 pSTAT1和STAT1蛋白水平（±s，n=6）Tab.4 pSTAT1 and STAT1 protein levels（±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with Shufeng Tongluo prescription+STAT1 inhibitor group，3）P<0.05.

Groups Control Model IL-27 Shufeng Tongluo prescription Shufeng Tongluo prescription+STAT1 inhibitor FP pSTAT1 1.25±0.47 0.19±0.041）0.47±0.081）2）3）0.63±0.111）2）3）0.17±0.031）2）24.377 0.000 STAT1 0.39±0.01 0.40±0.03 0.38±0.01 0.38±0.02 0.39±0.02 0.833 0.489

圖4 pSTAT1和STAT1蛋白水平Fig.4 pSTAT1 and STAT1 protein levels

3 討論

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，伴有氣道高反應(yīng)性及可逆性氣流受限，引起反復(fù)性喘息、氣急、胸悶或咳嗽，以夜間清晨發(fā)作為主。支氣管哮喘的發(fā)病原因復(fù)雜，目前尚未明確。受學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)同的一種說法是“衛(wèi)生假說”，以該學(xué)說的免疫學(xué)機(jī)制為根本，認(rèn)為Th1/Th2失衡及Th2免疫優(yōu)勢是哮喘發(fā)病的重要基礎(chǔ)［10］?，F(xiàn)有文獻(xiàn)記載，誘導(dǎo)Th1相關(guān)細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)可刺激IL-12、IFN-γ生成，從而抑制Th2相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生，緩解Th1/Th2失衡，最終達(dá)到抑制哮喘發(fā)生的目的［9］。疏風(fēng)通絡(luò)方對哮喘的預(yù)防和治療具有良好效果，已有研究證實，該方劑還具有改善氣道炎癥、調(diào)節(jié)肺功能、糾正患者缺氧狀態(tài)作用［11］。本研究采用辣椒素誘咳實驗測定小鼠咳嗽敏感性，發(fā)現(xiàn)疏風(fēng)通絡(luò)方可降低小鼠咳嗽次數(shù)，證實了其臨床療效。因此，本文旨在通過實驗分析疏風(fēng)通絡(luò)方對支氣管哮喘小鼠模型的干預(yù)作用，研究其在STAT1通路中的作用，并初步分析其調(diào)控STAT1信號通路緩解Th1/Th2免疫平衡的作用機(jī)制。

Th1及Th2相關(guān)細(xì)胞分泌的多種抑炎和促炎細(xì)胞因子在人體內(nèi)發(fā)揮重要作用，這些細(xì)胞因子的存在使得Th1、Th2相互制衡，達(dá)到一個穩(wěn)定狀態(tài)。IFN-γ由Th1分泌，在人體內(nèi)發(fā)揮促炎功效，同時也能促使免疫負(fù)向調(diào)節(jié)［12］。Th1/Th2相互制衡狀態(tài)下，IFN-γ結(jié)合并活化其受體，從而激活JAK-STAT信號通路，達(dá)到上調(diào)T-bet、促進(jìn)Th1細(xì)胞分化目的。IL-4由Th2分泌而來，是T細(xì)胞炎癥反應(yīng)的初始開啟因素，經(jīng)相關(guān)類別蛋白水平的提高，達(dá)到聚集、活化呼吸道炎癥細(xì)胞、增加支氣管哮喘發(fā)作次數(shù)的效果［13］。IFN-γ及IL-4與支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展及病情嚴(yán)重程度緊密相關(guān)［14］。本實驗發(fā)現(xiàn)，疏風(fēng)通絡(luò)方能夠上調(diào)血清及灌洗液中IFN-γ水平、下調(diào)IL-4水平，提示疏風(fēng)通絡(luò)方可改善支氣管哮喘患者Th1/Th2失衡。IL-27是新發(fā)現(xiàn)的IL-12家族細(xì)胞因子，對Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答具有促進(jìn)作用，對Th2細(xì)胞應(yīng)答具有抑制作用［15］。實驗發(fā)現(xiàn)，IL-27組血清及灌洗液中IL-4水平降低，提示哮喘小鼠體內(nèi)Th2水平受到抑制。SU等［16］的研究也指出，提前使用IL-27治療支氣管哮喘模型小鼠可降低其體內(nèi)IL-5及IL-13表達(dá)，可能與其對Th2的抑制有關(guān)。本文中疏風(fēng)通絡(luò)方組哮喘小鼠體內(nèi)IL-4與IFN-γ水平同IL-27組。為觀察兩組改善Th1/Th2失衡的效果，文章還檢測了IL-27對Th2水平代表因子IL-4及Th1水平特征性因子IFN-γ的影響，發(fā)現(xiàn)疏風(fēng)通絡(luò)方及IL-27組均可提高哮喘小鼠體內(nèi)IFN-γ和Th1水平。由此猜測疏風(fēng)通絡(luò)方抑制哮喘的機(jī)制可能與IL-27抑制哮喘的機(jī)制相類似。有研究表明，IL-27誘導(dǎo)Th細(xì)胞向Th1方向分化并分泌IFN-γ，Th細(xì)胞表面分布的IL-27受體與IL-27結(jié)合后可激活STAT1通路，由受體上的pg130亞基招募JAK1或JAK2，JAK發(fā)生自身磷酸化后再進(jìn)一步磷酸化和二聚化STATs分子，而二聚化的pSTATs轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合于特定的靶基因序列，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用［17］。相關(guān)研究記載，IL-27能夠上調(diào)小鼠Th細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)Th1分化和IFN-γ分泌；IL-27和JAK/STATs通路除了可促進(jìn)Th1胞分化外，也可通過上調(diào)IL-12Rβ2表達(dá)間接抑制Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3表達(dá)，但阻斷STAT1磷酸化水平可減弱IL-27對Th2的抑制作用，證明IL-27通過STAT1磷酸化抑制Th2分化［18］。STAT1磷酸化對IL-27生物學(xué)功能的正常發(fā)揮極為重要，文獻(xiàn)表明，高水平IL-4的哮喘患者存在IL-27治療耐受現(xiàn)象，IL-27無法抑制Th2細(xì)胞分化，隨后發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象可能與IL-4誘導(dǎo)Th細(xì)胞抑制STAT1磷酸化相關(guān)［19］。研究表明，支氣管哮喘氣道中STAT1磷酸化障礙可引起IL-27抑制Th2細(xì)胞功能受損，導(dǎo)致Th1/Th2平衡失調(diào)，誘發(fā)、加重哮喘［20］。因此，提高STAT1磷酸化水平，增強(qiáng)IL-27通路對Th2的抑制作用，恢復(fù)哮喘患者氣道內(nèi)Th1/Th2免疫平衡，為哮喘治療提供了新的通路及靶點。

本研究表明，疏風(fēng)通絡(luò)方可明顯改善Th1/Th2失衡，但添加STAT1抑制劑后，其對哮喘的抑制和治療作用大幅降低，提示STAT1磷酸化對疏風(fēng)通絡(luò)方緩解Th1/Th2失衡具有重要意義。Western blot實驗證實疏風(fēng)通絡(luò)方及IL-27可提高pSTAT1水平，促進(jìn)STAT1通路磷酸化，但加入STAT1抑制劑后，疏風(fēng)通絡(luò)方逆轉(zhuǎn)pSTAT1表達(dá)下降的作用被阻礙，證實疏風(fēng)通絡(luò)方的治療作用與STAT1通路的磷酸化相關(guān)。

綜上所述，疏風(fēng)通絡(luò)方能夠緩解支氣管哮喘小鼠喘息、氣急、咳嗽等癥狀，可能與疏風(fēng)通絡(luò)方調(diào)節(jié)STAT1信號通路，改善Th1/Th2失衡密切相關(guān)。但該信號通路的其他分子機(jī)制尚不明確，仍需深入研究發(fā)掘。