小花異裂菊根際與非根際微生物功能多樣性比較

王 博，覃 芳，史艷財(cái),秦惠珍，鄧麗麗，韋記青

(1.桂林理工大學(xué) 旅游與風(fēng)景園林學(xué)院，廣西 桂林 541006; 2. 廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006；3. 廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006)

小花異裂菊HeteroplexismicrocephalaY. L. Chen.為菊科Asteraceae異裂菊屬HeteroplexisChang多年生灌木植物，可用于治療消化不良、脾虛、浮腫等癥[1]，對(duì)菊科的分類、系統(tǒng)演化等研究具有極為重要的科學(xué)價(jià)值，已被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物[2]。小花異裂菊在石灰?guī)r山地的特有化發(fā)展十分顯著，僅分布在廣西陽(yáng)朔、融安等縣石山區(qū)的中上部，該區(qū)域具有典型的喀斯特環(huán)境特點(diǎn)：干濕頻繁交替，土層淺薄，土被不連續(xù)，土壤富鈣、鹽分高、養(yǎng)分含量低等[3]。典型的石山特有種以及分布地具有典型的喀斯特生態(tài)特征使小花異裂菊成為研究喀斯特生境特有植物生態(tài)適應(yīng)機(jī)制的理想物種。

目前，關(guān)于小花異裂菊的研究主要集中在核型[4]、化學(xué)成分[1]、遺傳多樣性[5]等方面。根際是植物—土壤—微生物相互作用最為活躍的場(chǎng)所，根系通過(guò)調(diào)整根際分泌物(可溶性糖、氨基酸等)的組分和數(shù)量選擇性地提高或降低某些微生物豐度，形成具有特定結(jié)構(gòu)與功能的根際微生物群落[6]。根際微生物可影響植物營(yíng)養(yǎng)吸收、植物抗性等過(guò)程[7]，尤其是在貧瘠、鹽分脅迫等逆境條件下[8]。近年來(lái)，根際微生物研究多數(shù)集中在農(nóng)田、草原以及沙漠等生境的植物，對(duì)喀斯特地區(qū)植物根際微生物的研究還較為薄弱[9-11]。相關(guān)研究顯示根際微生物在提高小花異裂菊適應(yīng)性方面起著重要作用，但具體機(jī)制尚不清楚[12]。

基于上述研究現(xiàn)狀，本研究以5個(gè)代表性分布點(diǎn)小花異裂菊的根際與非根際土壤微生物為研究對(duì)象，采用Biolog-ECO微平板法對(duì)其功能多樣性進(jìn)行測(cè)定，將微生物功能多樣性與主要土壤理化因子結(jié)合起來(lái)綜合分析，以期闡明小花異裂菊根際和非根際微生物功能多樣性差異及影響因子，為揭示小花異裂菊及其他喀斯特石山特有植物生態(tài)適應(yīng)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣地概況

采樣地為廣西桂林市陽(yáng)朔縣。陽(yáng)朔縣位于廣西壯族自治區(qū)東北部，桂林市南面，地處東經(jīng)110°13′～110°40′，北緯24°38′～25°04′，年平均氣溫19 ℃，年平均日照時(shí)數(shù)1 465 h，年平均降雨量1 640 mm，年平均無(wú)霜期302 d。

1.2 采樣方法

2019年8月分別在5個(gè)分布地(具體信息見(jiàn)表1)采樣。每個(gè)采樣點(diǎn)選擇3株年齡、株高、長(zhǎng)勢(shì)等基本一致的植株，植株之間距離20 m以上。具體采樣方法：挖出完整的植株根系，抖去根部大塊土壤，采集附著在根系上的土壤，裝入無(wú)菌封口袋中，作為根際土(R)；采集距離根系10～20 cm土壤，裝于無(wú)菌袋中，作為非根際土壤(N)。土壤采集完后立即置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。一份用于Biolog-ECO微平板試驗(yàn)，另一份室內(nèi)自然風(fēng)干，用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定。

表1 采樣地信息Tab. 1 Geographic locality of sample

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 土壤養(yǎng)分含量測(cè)定

全氮含量測(cè)定采用高氯酸-硫酸消化法[11]，全磷、速效磷含量測(cè)定采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法[11]，全鉀含量測(cè)定采用氫氟酸-高氯酸消煮法[11]，速效鉀含量測(cè)定用NH4OAc浸提-火焰光度法[11]，交換性鈉含量測(cè)定采用乙酸銨交換-火焰光度法[11]，交換性鈣和鎂含量測(cè)定采用乙酸銨-原子吸收分光光度法[11]。土壤pH采用pH計(jì)(上海雷磁pHs-3c型)測(cè)定；電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率儀(上海雷磁DDB-303A)測(cè)定。

1.3.2 群落功能多樣性測(cè)定

稱取相當(dāng)于10 g風(fēng)干土壤量的鮮土加入到250 mL三角瓶中，加入90 mL滅菌水，混合均勻，封口后放置于200 r/min搖床中，振蕩30 min；取出后靜置于超凈無(wú)菌工作臺(tái)40～60 s；取3 mL上清液轉(zhuǎn)移至裝有27 mL滅菌水的試管中，渦旋震蕩均勻，重復(fù)3次，將土壤溶液最終稀釋至1 000倍。用八孔加樣器吸取150 μL稀釋后的土壤菌液加入生態(tài)板中，每個(gè)樣品重復(fù)3次。將Biolog-ECO板放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用多功能熒光酶標(biāo)儀(SP-Max 3500 FL)在波長(zhǎng)590 nm處測(cè)量吸收光值，每隔24 h測(cè)量1次，連續(xù)測(cè)量10 d。

白酒品評(píng)是判斷酒質(zhì)優(yōu)劣的重要檢測(cè)技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，到目前為止，還不能被分析儀器所替代[6]。由公司的2名國(guó)家評(píng)委和4名省評(píng)委組成原酒質(zhì)量鑒評(píng)小組，對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的118個(gè)酒樣進(jìn)行品評(píng)分析，品評(píng)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，使用清潔稻殼所產(chǎn)原酒具有醇厚干凈，糠味、土腥味、澀味、霉味等異雜味小的共性特點(diǎn)，其質(zhì)量普遍優(yōu)于對(duì)照酒樣，實(shí)驗(yàn)組原酒質(zhì)量評(píng)分比對(duì)照組高11.64%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Biolog-ECO法測(cè)定的數(shù)據(jù)采用以下公式計(jì)算分析：

(1)平均顏色變化率(AWCD)

式中：Ci是指第i個(gè)非對(duì)照微孔的吸光度，R是對(duì)照微孔的吸光度，N是培養(yǎng)基中碳源種類的數(shù)量。

(2)多樣性指數(shù)

H=-∑(Pi×lnPi)，

式中Pi是第i個(gè)非對(duì)照微孔的吸光度與所有非對(duì)照微孔的吸光度之和的比值。

(3)豐富度指數(shù)

D=1-∑Pi2。

(4)均勻度指數(shù)

(5)碳源的相對(duì)利用率——以第7 天對(duì)應(yīng)碳源反應(yīng)孔的AWCD值之和為相對(duì)利用率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

由圖1可知，5個(gè)采樣點(diǎn)中，高海拔(XP)采樣點(diǎn)小花異裂菊根際與非根際土壤全氮、全鉀、堿解氮、速效鉀、交換性鈉的含量以及電導(dǎo)率較低；低海拔(GJ)采樣點(diǎn)小花異裂菊根際與非根際土壤堿解氮、速效鉀、交換性鈉、交換性鎂的含量、電導(dǎo)率以及pH值較高。5個(gè)采樣點(diǎn)中，根際土壤全磷、全鉀、堿解氮、速效鉀、交換性鈉、交換性鎂的含量、電導(dǎo)率以及pH值均大于相應(yīng)的非根際土壤，而且根際土壤與非根際土壤在全鉀、堿解氮、速效磷的含量及pH值之間有顯著差異(P<0.05)。

R為根際，N為非根際，*表示同一采樣點(diǎn)在根際與非根際土壤理化性質(zhì)差異顯著(P<0.05)，數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差圖1 小花異裂菊根際與非根際土壤理化性質(zhì) Fig. 1 Physical and chemical properties of soil between rhizosphere and non-rhizosphere soils of H. microcephala

對(duì)11個(gè)土壤理化因子進(jìn)行pearson相關(guān)分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表可見(jiàn)，土壤理化因子之間存在較高的相關(guān)性，全氮與堿解氮、有效磷，速效鉀、交換性鎂以及電導(dǎo)率這6個(gè)變量之間極顯著正相關(guān)(P<0.01)，交換性鈣與交換性鎂之間極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；全氮與速效鉀、堿解氮與電導(dǎo)率、交換性鈉與pH之間均表現(xiàn)出顯著正相關(guān)(P<0.05)；而全磷、全鉀與其他的9個(gè)土壤理化因子的相關(guān)性并不顯著(P>0.05)。

表2 土壤理化因子之間相關(guān)性Tab. 2 Correlation between soil physical and chemical factors

2.2 土壤微生物代謝活性

圖2為小花異裂菊根際與非根際土壤微生物AWCD變化情況，由圖可知：微生物平均顏色變化率(AWCD值)在0～1 d無(wú)明顯變化，說(shuō)明這時(shí)碳源被利用程度低；2～7 d開(kāi)始急劇上升，表明微生物開(kāi)始大量利用碳源；AWCD值在7 d后趨于穩(wěn)定，微生物代謝活性基本穩(wěn)定。5個(gè)采樣點(diǎn)小花異裂菊根際土壤微生物對(duì)碳源的利用率均大于相應(yīng)的非根際土壤微生物。高海拔采樣點(diǎn)(XP和PY)的根際土壤微生物代謝活性相對(duì)較低。

圖2 小花異裂菊根際與非根際土壤微生物AWCD變化情況Fig. 2 Average well color development (AWCD) between rhizosphere and non-rhizosphere soils of H. microcephala

2.3 土壤微生物功能多樣性指數(shù)

由表3可知，采樣點(diǎn)GJ、BS的根際與非根際土壤微生物在多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)以及均勻度指數(shù)值基本相同，而采樣點(diǎn)PY、XP的根際土壤微生物多樣性指數(shù)、豐富度度指數(shù)以及均勻度指數(shù)值均大于非根際。

表3 小花異裂菊根際與非根際土壤微生物功能多樣性指數(shù)Tab. 3 Diversity indices about soil microbial community of rhizosphere and non-rhizosphere of H. microcephala

2.4 土壤微生物利用碳源的類型

6類碳源的相對(duì)利用情況見(jiàn)圖3。由圖可知，小花異裂菊根際土壤微生物與非根際土壤微生物對(duì)糖類、羧酸類及氨基酸類碳源的相對(duì)利用率最高，對(duì)胺類碳源的相對(duì)利用率最低，其碳源相對(duì)利用率由大到小依次為：羧酸類、糖類、氨基酸類、聚合物類、代謝產(chǎn)物類、胺類。除BS之外，其他4個(gè)采樣點(diǎn)小花異裂菊根際土壤微生物的6類碳源相對(duì)利用率均大于非根際土壤微生物。此外，5個(gè)采樣點(diǎn)中，低海拔采樣點(diǎn)(GJ和GY)對(duì)6類碳源利用能力較高，而高海拔采樣地(XP)的利用能力較低。

圖3 小花異裂菊根際與非根際土壤微生物對(duì)6類碳源的相對(duì)利用率Fig. 3 Relative utilization ratio in six groups of carbon sources by rhizosphere and non-rhizosphere microbial of H. mcrocephala

2.5 土壤微生物碳源利用多樣性的主成分分析

小花異裂菊根際、非根際土壤碳源利用多樣性的主成分分析如圖4所示。第一和第二主成分分別解釋變量方差的56.64%和13.69%，兩者累積貢獻(xiàn)率達(dá)70.33%，變異主要來(lái)源于第一和第二主成分，因此將前2個(gè)主成分得分作圖來(lái)表征微生物群落碳源代謝特征。N-乙?；?D葡萄胺(糖類碳源)與第一主成分相關(guān)性最強(qiáng)，呈正相關(guān)。苯乙基胺(胺類碳源)與第二主成分相關(guān)性最強(qiáng)，呈正相關(guān)。在第一主成分上，可將5個(gè)采樣點(diǎn)根際、非根際利用碳源的能力分開(kāi)，也可將高海拔和低海拔采樣點(diǎn)區(qū)分開(kāi)，表明糖類化合物是區(qū)分小花異裂菊根際和非根際碳源代謝差異的主要碳源。第二主成分上，5個(gè)采樣點(diǎn)根際、非根際利用碳源的能力區(qū)別也較為明顯。

A2：β-甲基-D葡萄糖苷；A3：D-半乳糖內(nèi)酯；A4：L-精氨酸；B1：丙酮酸甲脂；B2：D-木糖；B3：D-半乳糖醛酸；B4：L-d冬酰胺酸e；C1：吐溫40；C2：I-赤藻糖醇；C3：2-羥基苯甲酸；C4：L-苯基丙氨酸；D1：吐溫80；D2：D-甘露醇；D3：4-羥基苯甲酸；D4：L-絲氨酸；E1：α-環(huán)式糊精；E2：N-乙?；?D葡萄胺；E3：γ-羥基丁酸；E4：L-蘇氨酸；F1：肝糖；F2：D-葡萄胺酸；F3：衣康酸；F4：甘氨酰-L-谷氨酸；G1：D-纖維二糖；G2：葡萄糖-1-磷酸鹽；G3：α-丁酮酸；G4：苯乙基胺；H1：α-D-乳糖；H2：D，L-α-甘油；H3：D-蘋(píng)果酸；H4：腐胺圖4 小花異裂菊根際與非根際土壤微生物群落碳源利用主成分分析Fig. 4 Principal component analysis of carbon utilization for rhizosphere and non-rhizosphere of H. microcephala

2.6 土壤微生物碳源利用與土壤理化性質(zhì)的冗余分析

不同采樣點(diǎn)小花異裂菊根際與非根際土壤微生物碳源利用與土壤理化性質(zhì)的冗余分析如圖5所示。圖5中，箭頭的長(zhǎng)度表示差異大小，土壤理化因子箭頭越長(zhǎng)，表示對(duì)碳源影響越大；實(shí)線箭頭表示碳源，虛線箭頭表示土壤理化因子，實(shí)線箭頭和虛線箭頭的夾角表示碳源與土壤理化因子的相關(guān)性，夾角小于90°表示正相關(guān)，大于90°表示負(fù)相關(guān)，夾角越小表明相關(guān)性越高，反之，則越低。在所測(cè)土壤理化因子中，全鉀、交換性鈣和交換性鎂對(duì)土壤利用碳源模式的影響最大，其次是堿解氮、速效鉀和交換性鈉。速效鉀、交換性鈉、交換性鎂、電導(dǎo)率以及pH與大多數(shù)碳源的夾角小于90°，呈正相關(guān)，而全磷、速效磷、交換性鈣與碳源利用為負(fù)相關(guān)。

Z1：全氮；Z2：全磷；Z3：全鉀；Z4：堿解氮；Z5：速效磷；Z6：速效鉀；Z7：交換性鈉；Z8：交換性鈣；Z9：交換性鎂；Z10：電導(dǎo)率；Z11：pH圖5 小花異裂菊根際和非根際土壤理化因子與31種碳源的冗余分析Fig. 5 Rudundancy analysis of 31 sole-carbon sources and soil nutrients of rhizosphere and non-rhizosphere of H. microcephala

3 討論

根際是植物—土壤—微生物與其環(huán)境條件相互作用最為活躍的場(chǎng)所，根際微生物可通過(guò)促進(jìn)礦物礦化、催化土壤生物化學(xué)過(guò)程等方式，提高土壤中植物可利用形態(tài)營(yíng)養(yǎng)元素的含量和植物對(duì)逆境的適應(yīng)性。近年來(lái)，已有學(xué)者對(duì)根際微生物對(duì)石山適生或特有植物生態(tài)適性的影響進(jìn)行了探討，例如，王新洲等[13]研究表明白櫟、園果化香等植物具有十分顯著的根際效應(yīng)。本文中，根際土壤的全氮、全磷、全鉀、堿解氮、交換性鈉以及交換性鎂含量均大于相應(yīng)的非根際土壤，表明根際富集了較多的營(yíng)養(yǎng)成分，有利于促進(jìn)小花異裂菊的生長(zhǎng)發(fā)育以及提高其抵御環(huán)境脅迫的能力[14-15]。這與何滕兵等[16]的研究結(jié)果一致。

通過(guò)檢測(cè)微生物碳源利用程度可有效反映土壤微生物群落多樣性的動(dòng)態(tài)變化。本文中，5個(gè)分布地小花異裂菊的根際微生物AWCD值均大于非根際土壤，其根際土壤微生物多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)總體上均高于非根際土壤，呈現(xiàn)出明顯的根際聚集現(xiàn)象，可見(jiàn)根際微生物代謝能力增強(qiáng)有利于小花異裂菊對(duì)喀斯特石山逆境的適應(yīng)能力。這與文獻(xiàn)[12-13]的研究結(jié)果一致。

Biolog-ECO平板中的碳源分為6類：糖類、氨基酸類、羧酸類、胺類、聚合物類以及代謝產(chǎn)物類[17]。糖類是自然界較豐富且微生物較容易利用的碳源；氨基酸是土壤有機(jī)氮的重要組成部分；羧酸類能夠酸化土壤環(huán)境，降低pH值；胺類大多具有堿性，能與酸結(jié)合成鹽；聚合物類與代謝產(chǎn)物類是聚糖的重要構(gòu)件分子或參與糖代謝的中間體[18]。在6類碳源中，小花異裂菊根際微生物對(duì)羧酸類與糖類的利用率最大，表明小花異裂菊根際微生物對(duì)于羧酸類和糖類最為敏感。這可能是由于小花異裂菊所在的喀斯特石山區(qū)土壤偏堿性，過(guò)高的pH值會(huì)抑制植物生長(zhǎng)、降低土壤中微量元素以及土壤微生物活性，而根際分泌的羧酸類化合物(例如α-丁酮酸、2-羥基苯甲酸以及4-羥基苯甲酸等)攜帶的酸性基團(tuán)對(duì)土壤具有明顯的酸化作用[19]，能夠使根際pH有所降低。糖類具有吸水、親水和保水的作用，對(duì)土壤團(tuán)聚體的比例和結(jié)構(gòu)具有重要影響[20]。小花異裂菊分布地的土層較薄，巖石裸露、土被發(fā)育不連續(xù)，水分滲透快，保水保肥能力差，糖類物質(zhì)的增加有利于提高根際土壤保水保肥能力。與此同時(shí)，糖類、羧酸類化合物是植物根系分泌物的主要成分，也是微生物代謝利用最廣的碳源，土壤微生物對(duì)糖類、羧酸類碳源利用的提高有利于土壤有效養(yǎng)分轉(zhuǎn)化[21-22]。受這2類碳源數(shù)量增加的影響，小花異裂菊根際能夠利用羧酸類和糖類碳源的微生物豐度也因此得到提高。這一結(jié)果與異裂菊屬其他4個(gè)物種根際微生物碳源利用類型相[12]一致，表明羧酸類和糖類化合物可能是喀斯特石山中上部分布的植物根際廣泛存在且能被微生物利用的主要碳源。主成分分析中，糖類碳源清楚地區(qū)分了小花異裂菊各個(gè)居群的根際與非根際土壤，也揭示了根際土壤中的糖類碳源分解代謝更高。

冗余分析結(jié)果顯示，全鉀、交換性鈣是影響小花異裂菊碳源利用模式的重要因子，全鉀含量與碳源利用呈正相關(guān)，交換性鈣與碳源利用呈負(fù)相關(guān)。這可能是由于全鉀是根際微生物生長(zhǎng)活動(dòng)的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而土壤鉀元素主要來(lái)源于石灰?guī)r的風(fēng)化，小花異裂菊分布的石山中上部的巖石裸露嚴(yán)重、生物活性低，巖石風(fēng)化以物理風(fēng)化為主，致使礦化速率較慢以及土壤中鉀含量較低，全鉀因此成為根際土壤中微生物生長(zhǎng)繁殖的限制因素[23]?？λ固氐貐^(qū)土壤中鈣離子含量極為豐富，可達(dá)酸性土壤的3倍以上。高濃度的鈣離子可干擾依賴鈣離子的信號(hào)系統(tǒng)，造成以磷酸為基礎(chǔ)的能量代謝紊亂，影響微骨架動(dòng)力學(xué)等，導(dǎo)致微生物代謝功能紊亂或死亡[24-25]。

諸多研究表明，海拔高度會(huì)影響土壤微生物群落多樣性和代謝活性，海拔越高，土壤微生物多樣性越低[26]。本文研究結(jié)果表明，小花異裂菊高海拔分布地的條件相對(duì)更為惡劣，養(yǎng)分含量相對(duì)于低海拔地區(qū)更低。與此同時(shí)，小花異裂菊高海拔分布地的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相似，微生物多樣性和代謝活性較低，小花異裂菊根際分泌物對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性和代謝活性的影響更為明顯。由此可知，相對(duì)于低海拔地區(qū)，高海拔地區(qū)根際微生物在提高小花異裂菊抗逆性過(guò)程中起著更為重要的作用。

4 結(jié)論

本文采用土壤養(yǎng)分分析常規(guī)方法和Biolog-ECO微平板法，對(duì)小花異裂菊5個(gè)典型分布地的根際和非根際土壤養(yǎng)分和微生物代謝功能多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明：

1)小花異裂菊根際土壤速效鉀、全鉀、pH顯著高于非根際(P<0.05)，根際土壤的全氮、全磷、堿解氮、交換性鈉以及交換性鎂等均高于非根際，但差異不顯著(P>0.05)；

2)小花異裂菊根際與非根際微生物平均顏色變化率均表現(xiàn)為根際大于非根際；

3)小花異裂菊根際與非根際土壤微生物的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)均高于相應(yīng)的非根際，而根際土壤微生物均勻度指數(shù)與非根際相差不大；

4)小花異裂菊根際與非根際土壤微生物主要利用的碳源類型為糖類和羧酸類；

5)冗余分析顯示，土壤養(yǎng)分因子對(duì)小花異裂菊根際微生物的碳源利用模式有明顯影響，其中，影響較大的有全鉀、交換性鈣和交換性鎂；全磷、速效磷、交換性鈣對(duì)碳源利用影響為負(fù)相關(guān)。