微生物合成5-羥基色氨酸的研究進(jìn)展

翁可欣，張明亮，李 力

（福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福州 350117）

5-羥基色氨酸（5-Hydroxytryptophan，5-HTP）是一種色氨酸衍生物，由色氨酸羥化酶催化，使色氨酸苯環(huán)上5′位氫原子被羥基取代[1]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，5-HTP可脫羧轉(zhuǎn)化為5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT），也稱為血清素，參與調(diào)節(jié)情緒、認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶、睡眠和其他生理過程[2]。5-HT可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為褪黑素（Melatonin，MT），該激素由松果體釋放，具有調(diào)節(jié)睡眠的作用[3-4]。5-HTP是5-HT和MT的重要前體，在抗抑郁、減肥、治療失眠和頭痛等方面有重要作用。但是，攝入過量的5-HTP可能導(dǎo)致血清素綜合征，產(chǎn)生一定的副作用，例如躁動(dòng)、神志不清、心動(dòng)過速、出汗和血壓波動(dòng)等[5]。

5-HTP主要來源是從非洲豆科植物加納（Griffonia simplicifolia）種子中提取，但是植物的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，并受季節(jié)和地域的限制，產(chǎn)率低，不適合工業(yè)化應(yīng)用[6]。化學(xué)合成方法的周期長(zhǎng)、耗資大，需在高溫高壓環(huán)境下合成，易造成環(huán)境污染，且色氨酸區(qū)域選擇性羥基化較難實(shí)現(xiàn)，同樣不適用于大規(guī)模合成[7-8]。微生物合成具有生產(chǎn)周期短、成本低、產(chǎn)量高和易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，具有巨大的應(yīng)用前景。筆者著重闡述定向進(jìn)化提高芳香族氨基酸羥化酶的羥化活性、輔酶因子合成和再生途徑的引入和代謝工程優(yōu)化5-HTP合成效率等方面闡述了微生物合成5-HTP的進(jìn)展，旨在為5-HTP的規(guī)?；a(chǎn)研究提供資料。

1 5-HTP的生物合成途徑

在生物體內(nèi)，5-HTP由色氨酸羥化酶（Tryptophan hydroxylase，TPH）催化L-色氨酸（LTryptophan，L-Trp）和O2合成，此過程需要四氫生物蝶呤 ( Tetrahydrobiopterin，BH4)和Fe2+作為輔助因子[9]。TPH是芳香族氨基酸羥化酶（Aromatic amino acid hydroxylases，AAAH）家族的一員，它是單加氧酶，催化時(shí)將O2中一個(gè)氧原子與底物結(jié)合，并將另一個(gè)氧原子還原為H2O，還原為H2O所需的2個(gè)電子由BH4提供[10]。在這個(gè)過程中，輔助因子BH4至關(guān)重要。BH4合成從GTP開始，GTP被GTP環(huán)化水解酶Ⅰ（GTP CyclohydrolaseⅠ，GCHI）催化生成7,8-三磷酸二氫新蝶呤(7,8-Dihydroneopterin triphosphate，H2NTP)，再在6-丙酮四氫蝶呤合成酶(6-Pyruvoyl Tetrahydropterin Synthase，PTPS)的作用下生成6-丙酮-5,6,7,8-四氫蝶呤（6-Pyruvoyl-5,6,7,8-tetrahydropterin，PTP），最后由墨蝶呤還原酶(Sepiapterin Reductase，SPR)催化，轉(zhuǎn)化成終產(chǎn)物BH4[11]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，BH4作為輔酶被消耗后，會(huì)轉(zhuǎn)化成蝶呤-4α-甲醇胺(BH4-4α-carbinolamine，4α-OH-BH4)，在蝶呤-4α-甲醇胺脫水酶（Pterin-4α-carbinolamine dehydratase，PCD)的作用下生成醌型雙氧蝶呤(Quinonoid Dihydrobiopterin,qBH2)，在雙氫蝶啶還原酶（Dihydropteridine Reductase，DHPR）的催化下再生成BH4，完成BH4循環(huán)（圖1）[12]。

圖1 大腸桿菌內(nèi)構(gòu)建5-HTP 生物合成途徑

2 大腸桿菌異源表達(dá)生產(chǎn)5-HTP

在大腸桿菌內(nèi)構(gòu)建5-HTP生物合成途徑需要3個(gè)模塊，分別為色氨酸羥化酶模塊、BH4從頭合成模塊和BH4循環(huán)模塊（圖2）。

圖2 原核生物PAH催化途徑（灰色部分為MH4循環(huán)）

2.1 芳香族氨基酸羥化酶的異源表達(dá)AAAH是非血紅素亞鐵和BH4依賴的單加氧酶，它們包括色氨酸羥化酶（Tryptophan hydroxylase，TPH）、苯丙氨酸羥化酶（Phenylalanine hydroxylase，PAH）和酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）。這3種酶都使用BH4和O2為輔助因子，分別催化色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸轉(zhuǎn)化為5-HTP、酪氨酸和左旋多巴[13]。其中，人類TPH有2種亞型，由2個(gè)不同的基因編碼。最早被發(fā)現(xiàn)且研究最多的是TPH1，主要存在于松果體和腸道系統(tǒng)，而TPH2主要存在于神經(jīng)細(xì)胞[14]。

Moran等[15]首先在大腸桿菌中表達(dá)了野生型兔源色氨酸羥化酶（TRH）以及該酶2種截短的突變蛋白，發(fā)現(xiàn)野生型兔源色氨酸羥化酶表達(dá)水平較低，且刪除N端調(diào)節(jié)域101個(gè)氨基酸的突變蛋白主要以包涵體的形式存在，但同時(shí)刪除N端101個(gè)氨基酸與C端28個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)TRH102-416表達(dá)量為細(xì)胞總蛋白的30%。其結(jié)果表明，兔源TRH102-416是一種穩(wěn)定、高活性的TRH形式，可在大腸桿菌中高水平表達(dá)。MCKINNEY等[16]在大腸桿菌中表達(dá)了全長(zhǎng)的人TPH，將其與麥芽糖結(jié)合蛋白（Maltose binding protein，MBP）結(jié)合（MBP-TPH），使TPH迅速而有效地折疊成天然結(jié)構(gòu)，促進(jìn)TPH的可溶性表達(dá)，與6×His-TPH融合蛋白相比，MBP-TPH比酶活高出3倍。WINDAHL等[17]對(duì)雞的色氨酸羥化酶晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)與色氨酸結(jié)合的疏水性口袋由殘基Tyr236、Thr266、Pro269、His273、Phe314、Phe319和Ile367等組成，且其中Fe2+配位結(jié)構(gòu)是非血紅素依賴的配位結(jié)構(gòu)，與人類TPH1的結(jié)構(gòu)相比，其整體結(jié)構(gòu)更緊湊，在活性位點(diǎn)周圍有兩個(gè)閉合環(huán)。

由于真核生物酶的低溶解性、低穩(wěn)定性以及特定的翻譯后修飾，真核生物的AAAH難以在大腸桿菌中以可溶的和穩(wěn)定的形式表達(dá)[16,18]。雖然使用截短的蛋白或融合蛋白可獲得可溶性和有活性的酶，但這類AAAH在大腸桿菌中羥化活性仍然較低[18]。相反，細(xì)菌AAAH在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)更穩(wěn)定，更有利于提高芳香族氨基酸的羥化活性。KINO等[19]利用紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)PAH（CviPAH）的晶體結(jié)構(gòu)信息，對(duì)CviPAH的第101位亮氨酸（L101）和第180位色氨酸（W180）進(jìn)行飽和突變后發(fā)現(xiàn)，第101位亮氨酸突變?yōu)槔野彼幔↙101Y）和第180位色氨酸突變?yōu)楸奖彼幔╓180F）后，L-色氨酸羥化活性提高至5.2倍。

2.2 輔酶因子供應(yīng)系統(tǒng)

2.2.1 BH4的合成與再生色氨酸羥化酶催化過程需要BH4作為輔助因子，但大腸桿菌不含內(nèi)源性BH4，因而BH4合成與再生途徑的構(gòu)建是色氨酸羥化酶途徑的重點(diǎn)。Yamamoto等[20]在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)GCHI、PTPS和SPR等3個(gè)酶基因，在大腸桿菌內(nèi)成功構(gòu)建BH4合成途徑，并進(jìn)一步提高BH4產(chǎn)能，最大產(chǎn)率達(dá)到約4.0 g·L-1。Ryotaro等[19,21]在2009年研究的基礎(chǔ)上，在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)CviPAH的突變體（CviPAH.L101YW180F），敲除宿主內(nèi)降解L-Trp和5-HTP的色氨酸酶基因（ΔtnaA），并導(dǎo)入BH4輔酶因子的再生系統(tǒng)（PCD，DHPR）和NADH再 生系 統(tǒng)，促進(jìn)5-HTP的合成。通過添加BH4和L-Trp，并優(yōu)化反應(yīng)條件，最終5-HTP產(chǎn)率為2.5 mmol·L-1，實(shí)現(xiàn)了BH4再生系統(tǒng)的應(yīng)用，提高了BH4的利用率。但該研究仍需添加BH4和L-Trp作為底物，并不是微生物合成5-HTP的最佳方法。一項(xiàng)專利[22]在大腸桿菌中表達(dá)截短的兔源TPH1，同時(shí)導(dǎo)入BH4的生物合成途徑和再生系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了GTP從頭合成BH4以及再生BH4。該專利在大腸桿菌(ΔtnaA)內(nèi)共表達(dá)6個(gè)酶（TPH1、GCHI、PTPS、SPR、PCD、DHPR），在不添加BH4以及L-色氨酸的培養(yǎng)基中生 產(chǎn) 了0.9 mmol·L-1(相 當(dāng) 于198 mg·L-1)的5-HTP。Wang等[23]在大腸桿菌(ΔtnaA)內(nèi)異源表達(dá)曼氏血吸蟲（Schistosoma mansoni）TPH（SmTPH）以及BH4從頭合成和循環(huán)途徑，在含有2 g·L-1的L-Trp的培養(yǎng)基中發(fā)酵60 h生成0.93 g·L-1的5-HTP。

2.2.2 不同輔酶因子—MH4真核生物AAAH在大腸桿菌中常以包涵體的形式表達(dá)，而原核生物AAAHL-色氨酸羥化活性非常低。但據(jù)報(bào)道，當(dāng)紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)PAH突變時(shí)將提高L-色氨酸羥化活性[19]。同時(shí)有實(shí)驗(yàn)表明[24-25]，部分細(xì)菌PAH可利用四氫蘇式新蝶呤(Tetrahydromonapterin，MH4)代替BH4作為輔酶進(jìn)行羥化反應(yīng)，MH4參與反應(yīng)后可轉(zhuǎn)變?yōu)?α-羥基四氫喋呤（4α-Hydroxytetrahydropterin，4α-MH4），再經(jīng)PCD催化為二氫單氫蝶呤(Dihydromonapterin，MH2)，MH2可以進(jìn)一步還原為MH4，完成MH4循環(huán)。大腸桿菌含有內(nèi)源性MH4，但缺少M(fèi)H4循環(huán)系統(tǒng)，MH4是大腸桿菌中蝶呤的主要存在形式（圖2）。

Lin等[26]比對(duì)5個(gè)微生物PAH后發(fā)現(xiàn)，野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris）PAH(XcPAH)對(duì)苯丙氨酸和色氨酸的活性較高，在其預(yù)測(cè)的晶體結(jié)構(gòu)中，W179位于活性口袋內(nèi)，將其突變可改變XcPAH的底物偏好，結(jié)果表明，XcPAH-W179F突變體色氨酸羥化活性是野生型的17.4倍，同時(shí)突變體苯丙氨酸羥化活性降低了約20%。XcPAHW179F可以利用大腸桿菌內(nèi)源MH4作為輔酶，因此，研究人員共表達(dá)XcPAH-W179F、PCD和DHMR成功構(gòu)建色氨酸羥化途徑和MH4循環(huán)系統(tǒng)。將該系統(tǒng)轉(zhuǎn)入大腸桿菌內(nèi)，同時(shí)添加2 g·L-1的LTrp作為底物，在30℃培養(yǎng)16 h可合成1.1 g·L-15-HTP，但不添加L-Trp時(shí)，僅可生成152.9 mg·L-15-HTP。由于在大腸桿菌中已實(shí)現(xiàn)了L-Trp的高水平生產(chǎn)（高達(dá)48.7 g·L-1）[27]，將該系統(tǒng)導(dǎo)入色氨酸高產(chǎn)菌株并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化有望獲得5-HTP高效生產(chǎn)菌株。

Mora-Villalobos等[28]比較了10種細(xì)菌AAAH對(duì)色氨酸的親和性，發(fā)現(xiàn)臺(tái)灣銅綠假單胞菌（Cupriavidus taiwanensis）AAAH（CtAAAH）對(duì)色氨酸親和性較高，通過與色氨酸偏好的酶進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)CtAAAH-W192與L-Trp的吲哚環(huán)的結(jié)合有關(guān)，對(duì)該位點(diǎn)突變可改變其底物偏好。與野生型相比，突變體CtAAAH-W192F的色氨酸羥化活性提高了5.5倍，苯丙氨酸羥化活性降低了約10%。將該突變體轉(zhuǎn)入大腸桿菌（ΔtnaA）內(nèi)，同時(shí)表達(dá)MH4循環(huán)系統(tǒng)，在添加5 mmol·L-1L-Trp的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，可合成2.5 mmol·L-1的 5-HTP。

2.2.3 通過代謝工程優(yōu)化5-HTP合成利用代謝工程平衡細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)，可進(jìn)一步提高5-HTP產(chǎn)量。細(xì)胞內(nèi)L-色氨酸的合成起始于3-脫氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸( 3-Deoxy-Darabino-heptulosonic acid 7-phosphate，DAHP)。磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)與赤蘚糖-4-磷酸（Erythrose-4-phosphate，E4P）經(jīng)aroH基因編碼的DAHP合成酶（DAHP synthase）催化合成 DAHP，再經(jīng)分支酸途徑合成分支酸(Chorismate，CHA），CHA在色氨酸操縱子的催化下合成L-色氨酸（圖3）[29]。這一過程中，aroH與trpE基因的表達(dá)與蛋白活性都受到色氨酸的反饋抑制。點(diǎn)突變與啟動(dòng)子替換可以解除色氨酸對(duì)AroH 與TrpE的反饋抑制，將代謝流向有利于色氨酸合成的方向，增加色氨酸在宿主細(xì)胞內(nèi)的累積量，以提高5-HTP的合成[30]。

圖3 大腸桿菌中 L-色氨酸合成途徑相關(guān)調(diào)控

大腸桿菌trpR基因編碼一種阻遏蛋白TrpR，它能夠控制色氨酸操縱子的表達(dá)，當(dāng)有高濃度的L-Trp存在時(shí)，TrpR可與L-Trp形成二聚體，與色氨酸操縱子結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄，L-Trp的生物合成途徑停止。當(dāng)L-Trp含量低時(shí)，TrpR處于失活狀態(tài)，色氨酸操縱子可正常轉(zhuǎn)錄[31]。在大腸桿菌內(nèi)敲除trpR基因可實(shí)現(xiàn)L-Trp的累積，有利于5-HTP的合成。

Mora-Villalobos等[32]在2017年研究的基礎(chǔ)上對(duì)CtAAAH再次進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建了雙突變體CtAAAH-F197L/E219C(CtAAAH-LC)，與 單 突 變體CtAAAH-W192F相比，CtAAAH-LC的Km值更 低(0.95 mmol·L-1)，反 應(yīng) 速 度 更 快(Vmax=1.9 mmol·L-1·s-1）。同時(shí)，構(gòu)建了菌株TrpD-Pl，該菌株以LIN等[30]人的色氨酸高產(chǎn)菌株S028為出發(fā)菌株，敲除了基因trpR，并含有人MH4再生系統(tǒng)(PCD，DHMR)。將CtAAAH-LC轉(zhuǎn)入菌株TrpDPl 中進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，60 h后，色氨酸含量達(dá)（23.4±1.4）g·L-1，5-HTP產(chǎn)量為（962±58）mg·L-1。

Wang等[33]進(jìn)一步對(duì)L-色氨酸生產(chǎn)模塊、色氨酸羥基酶模塊和BH4模塊進(jìn)行優(yōu)化。作者在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)人源TPH，將BH4的合成與再生系統(tǒng)同時(shí)導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi)，并解除色氨酸對(duì)TrpE和AroH的反饋抑制（aroHfbr和trpEfbr），在未添加LTrp和BH4的搖瓶中發(fā)酵116 h，可合成3.97 g·L-1的L-Trp和314.8 mg·L-1的5-HTP。再經(jīng)代謝工程調(diào)控，對(duì)L-色氨酸模塊、色氨酸羥基酶模塊和BH4模塊優(yōu)化。研究表明，截短的TPH在大腸桿菌中可溶性和穩(wěn)定性將提高[34,35]，將截短的TPH145(TPH2 NΔ145/CΔ24)代替TPH進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，最終合成424.7 mg·L-1的5-HTP，產(chǎn)率提高34.9%。前期的實(shí)驗(yàn)表明，L-Trp在宿主內(nèi)大量累積卻未轉(zhuǎn)化成5-HTP，推測(cè)合成L-Trp將消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不利于5-HTP的合成。用低拷貝質(zhì)粒表達(dá)aroHfbr和trpEfbr，L-Trp產(chǎn)量顯著降低（207.9 mg·L-1），同時(shí)，5-HTP的產(chǎn)量增加至532.6 mg·L-1。再經(jīng)啟動(dòng)子優(yōu)化，降低BH4合成和循環(huán)途徑過度表達(dá)的負(fù)擔(dān)，最終5-HTP和L-色氨酸產(chǎn)量顯著增加，搖瓶發(fā)酵分別為1.3 g·L-1和1.7 g·L-1。在以甘油為碳源的補(bǔ)料分批發(fā)酵罐中發(fā)酵，5-HTP最終產(chǎn)量為5.1 g·L-1。由于多質(zhì)粒表達(dá)在發(fā)酵后期穩(wěn)定性較差，為了增加羥化途徑的穩(wěn)定性，將aroHfbr和trpEfbr整合到大腸桿菌基因組中，同時(shí)降低了色氨酸羥化質(zhì)?？截悢?shù)和aroHfbr啟動(dòng)子的強(qiáng)度，以重新平衡和優(yōu)化代謝途徑，最終5-HTP搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為1.61 g·L-1，提高了24.8%，LTrp產(chǎn)量為0.20 g·L-1，降低了88%[36]。

除了大腸桿菌異源表達(dá)生產(chǎn)5-HTP外，Zhang等[37]首次在釀酒酵母BY4741內(nèi)成功合成了5-HTP，通過異源表達(dá)原核PAH或真核色氨酸3/5-羥化酶，以MH4或BH4兩種輔助因子增強(qiáng)合成5-HTP。此外，釀酒酵母中天然基因DFR1與大腸桿菌中的folM基因具有相似的功能，經(jīng)過基因DFR1敲除，證實(shí)在釀酒酵母中DFR1基因通過再生MH4對(duì)5-HTP的合成起著關(guān)鍵作用，為利用代謝工程促進(jìn)酵母生產(chǎn)5-HTP奠定了基礎(chǔ)（表1）。

表1 微生物異源合成5-HTP

3 展 望

在微生物內(nèi)合成5-HTP需要芳香族氨基酸羥化酶、輔酶因子合成系統(tǒng)和輔酶因子再生系統(tǒng)3個(gè)模塊。前期研究表明對(duì)TPH進(jìn)行突變、截短或融合標(biāo)簽可提高該酶在宿主內(nèi)羥化活性，將BH4合成系統(tǒng)和再生系統(tǒng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞與TPH共表達(dá)，可成功構(gòu)建色氨酸羥化途徑[34-35]。部分細(xì)菌PAH可利用MH4代替BH4作為輔酶進(jìn)行羥化反應(yīng)，提高PAH色氨酸羥化活性、表達(dá)MH4循環(huán)系統(tǒng)，亦可構(gòu)建色氨酸羥化途徑[24-25]。經(jīng)代謝工程調(diào)控增加L-Trp在宿主內(nèi)的積累量可進(jìn)一步提高5-HTP的產(chǎn)率。目前，微生物發(fā)酵生產(chǎn)5-HTP最高產(chǎn)量為5.1 g·L-1，但仍無法大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，今后的研究重點(diǎn)可集中在以下幾個(gè)方面：（1）5-HTP合成與宿主細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)，高強(qiáng)度表達(dá)將影響細(xì)胞生長(zhǎng)，無法高效合成5-HTP[36]。因此，代謝途徑的優(yōu)化與平衡更為重要，可集中研究3個(gè)模塊和L-Trp代謝工程調(diào)控中不同表達(dá)強(qiáng)度對(duì)5-HTP合成的影響，提高5-HTP合成率，降低LTrp在宿主細(xì)胞內(nèi)的殘留量；（2）需進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基組成以及發(fā)酵過程中溫度、pH、溶氧等參數(shù)對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)L-Trp轉(zhuǎn)化率和5-HTP積累量的影響，確定最優(yōu)發(fā)酵工藝條件；（3）仍需研究5-HTP分離純化技術(shù)，探索發(fā)酵液固液分離和脫色等工藝流程，結(jié)合納濾膜和微濾膜等新興技術(shù)提高回收率、獲得高純度產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)微生物合成5-HTP商業(yè)化生產(chǎn)。在生物活性方面，已有研究表明過量攝入5-HTP將產(chǎn)生一定副作用，仍需深入探索藥理毒理機(jī)制，為臨床使用5-HTP提供數(shù)據(jù)支持。此外，釀酒酵母被認(rèn)為是安全無毒的模式生物[38]，在釀酒酵母內(nèi)合成5-HTP研究較少，可通過基因組挖掘進(jìn)一步研究不同芳香族氨基酸羥化酶在釀酒酵母內(nèi)的高活性表達(dá)以及兩種輔酶因子合成與再生途徑的構(gòu)建，同時(shí)需改造釀酒酵母內(nèi)L-Trp的代謝通量和協(xié)調(diào)代謝平衡，為研究釀酒酵母合成5-HTP提供新的技術(shù)支持。