枸杞多糖保護人臍帶間充質(zhì)干細胞對抗氧化損傷研究

王程，韓發(fā)彬

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250300；2.山東省聊城市人民醫(yī)院組織工程與再生醫(yī)學(xué)實驗室，山東 聊城 252000）

近年來，干細胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病逐漸成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，在神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)與再生的研究中得到廣泛的應(yīng)用，隨著醫(yī)學(xué)及科學(xué)技術(shù)的不斷進步，對干細胞療法研究日益深入，關(guān)于干細胞療法的作用機制不斷被發(fā)掘，并逐步走向臨床［1?2］。人臍帶間充質(zhì)干細 胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC－MSCs）取材于人的臍帶，是一種成體干細胞，與其他來源的干細胞相比，具有免疫原性低、非侵入性收獲、易于體外擴增、采集過程方便和自我更新速度快等優(yōu)點［3］，且不存在倫理問題，是組織修復(fù)的重要來源。因此，HUC－MSCs 是一種非常有前途的治療候選細胞，在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景［4］。研究表明，神經(jīng)組織中含有大量易被氧化的不飽和脂肪酸以及低水平的抗氧化物質(zhì)，使HUC－MSCs易受到活性氧的損傷，導(dǎo)致HUC－MSCs 移植后出現(xiàn)HUC－MSCs 凋亡，存活率降低，限制了HUC－MSCs 移植的治療潛能［5］。因此，如何提高HUC－MSCs 存活率，降低凋亡的發(fā)生是HUC－MSCs移植療法亟待解決的關(guān)鍵問題之一。

枸杞多糖（LBP）是枸杞子中主要活性成分之一，具有抗氧化［6］和神經(jīng)保護［7］等多種生物活性。LBP 可以通過增加巨噬細胞的NO 和酸性磷酸酶產(chǎn)生，增強巨噬細胞吞噬能力，并在體外產(chǎn)生明顯的抗氧化活性；LBP 還能有效降低CoCl2誘導(dǎo)的低氧RGCs 細胞模型發(fā)生，且能減少RGCs 細胞的凋亡，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和減少線粒體膜的電位差，從而對細胞產(chǎn)生抗氧化保護作用［8］。但LBP 能否提高HUC－MSCs 抵抗氧化損傷的能力仍需進一步驗證。因此，本實驗通過過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo) HUC－MSCs 凋亡，探討LBP 對HUCMSCs氧化應(yīng)激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物與試劑

人臍帶間充質(zhì)干細胞（HUC－MSCs）由聊城市人民醫(yī)院干細胞再生實驗室提供（已鑒定并發(fā)表）。枸杞多糖（LBP）（UV ≥ 90%，北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，批號：615C021）；DMEM/F12 培養(yǎng)基（美國 Thermo Fisher 公司，批號：8121468）；胎牛血清（FBS，美國 Thermo Fisher 公司，批號：2233788CP）；胰蛋白酶溶液（美國 Thermo Fisher 公司，批號：2276862）；CCK－8 試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：073120201102）；雙抗（美國 Thermo Fisher 公司，批號：1881451）；H2O2（Sigma－aldrich，批號：MKCL7140）；RNAiso Plus 試劑［寶生物工程（大連）有限公司，批號：AL31609A］；SYBP Green PCR Master Mix（美國 Thermo Fisher 公司，批號：2106532）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司，批號：AL50948A］；活性氧檢測試劑盒（含DCFH－DA 探針，碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：101221220429）。

1.2 實驗儀器

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（美國 Thermo Fisher 公司）；倒置顯微鏡（日本 Olympus 公司）；酶標儀（美國 Bio－Rad 公司）；熒光定量基因擴增儀（新加坡ABI 公司）；低溫高速離心機（德國艾本德股份公司）；渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；水浴鍋（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)及處理

將HUC－MSCs 細胞復(fù)蘇后接種于含87% DMEM/F12 培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液+1%谷氨酸+1%非必需氨基酸培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。待細胞基本長滿培養(yǎng)瓶底時，用胰蛋白酶消化細胞使其脫壁離散，制成細胞懸液后進行傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

1.4 細胞分組及藥物溶液配制

將體外培養(yǎng)的 HUC－MSCs 隨機分為正常對照組（Normal Control group，NC）、H2O2處理的模型組（Model group，M）、VC 處理的陽性藥對照組（Positive control group，PC）、枸杞多糖低劑量組（Lycium barbarum polysaccharide low－dose group，LBP－L）、枸杞多糖中劑量組（Lycium barbarum polysaccharide medium－dose group，LBP－M）和枸杞多糖高劑量組（Lycium barbarum polysaccharide high－dose group，LBP－H）。其中M 組采用200 μmol/L H2O2孵育 6 h；PC 組在M 組基礎(chǔ)上加100 mg/L VC；LBP 各組在M 組基礎(chǔ)上，加入200、400、800 mg/L枸杞多糖溶液。

1.5 檢測指標

1.5.1 細胞活力的檢測

鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，選取對數(shù)生長期的細胞，待細胞基本長滿后，去除舊培養(yǎng)液，加入 PBS 緩沖液洗滌1～2 次，加入胰酶消化，常規(guī)1 000 r/min 離心5 min。去除上清液，加入完全培養(yǎng)基混勻，細胞計數(shù)將HUC－MSCs 細胞密度調(diào)整到5 × 103/mL，接種在 96 孔培養(yǎng)板中，每孔添加100 μL 細胞懸液。置于 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按實驗分組加入藥物，每孔加入10 μL CCK－8 工作液，繼續(xù)孵育2 h，在酶標儀中，450 nm 波長下檢測各孔吸光度（OD）。

細胞存活率（%）=OD 值處理組/OD 值對照組 × 100%

1.5.2 活性氧（ROS）水平的檢測

①收集細胞后裝載探針：按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH－DA，使終濃度為10 μmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH－DA 中，細胞濃度為1.0 × 107個/mL，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min 顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH－DA。直接用H2O2刺激細胞，通常H2O2在刺激細胞20～30 min 后可以顯著提高活性氧水平。

②熒光分光光度計檢測：參數(shù)設(shè)置使用488 nm 激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，檢測刺激后熒光的強弱。

1.5.3 凋亡相關(guān)基因的檢測

取對數(shù)期生長的HUC－MSCs 細胞，匯合度達到90%，消化，計數(shù)，按1.0 × 105個/孔鋪6 孔板。Trizol 法提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說明進行操作分析。

實驗結(jié)果計算：根據(jù)所測得的CT 值，目的基因的CT 值減去GAPDH 的CT 值，計算出?CT 值，再使用實驗組的?CT 值減對照組的?CT 值，計算出??CT 值，最后，2－??CT值即為所檢測目的基因的相對含量?；蛞镉缮虾Ｉど锟萍加邢薰驹O(shè)計并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù) ± 標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)狀態(tài)

復(fù)蘇后的HUC－MSCs 鏡下觀察可見細胞呈圓形或橢圓形，懸浮于完全培養(yǎng)基中，透亮度高。過夜培養(yǎng)后可見細胞完全貼壁，2 d后可見細胞呈放射狀集落改變，多數(shù)細胞成梭樣改變；4 d左右細胞呈集落生長，排列緊湊，融合面積達 90%，細胞呈平行或螺旋狀排列，表明細胞狀態(tài)良好，可用于后續(xù)實驗。結(jié)果見圖1。

圖1 HUC－MSCs的形態(tài)觀察（× 4）

2.2 各組HUC－MSCs細胞增殖及細胞活力的比較

CCK－8 結(jié)果表明，與M 組相比，LBP 能顯著提高HUC－MSCs 細胞的生長和增殖能力（P＜ 0.05），并且呈濃度與時間依賴效應(yīng)。結(jié)果見圖2和表2。

圖2 各組HUC－MSCs細胞及形態(tài)觀察（× 4）

表2 各組細胞存活率的比較（±s）

表2 各組細胞存活率的比較（±s）

注：與NC組比較，△△P ＜ 0.01；與M組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

2.3 各組HUC－MSCs細胞ROS水平的比較

200 μmol/L H2O2處理6 h 后，與NC 組比較，M 組ROS 水平明顯上升（P＜ 0.01）。與M 組比較，LBP－M組和LBP－H 組ROS 水平均明顯降低（P＜ 0.01），LBP－L 組有效果但無統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果表明，LBP 能顯著抑制由 H2O2誘導(dǎo)的ROS 的生成，降低細胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果見圖3和表3。

表3 各組細胞ROS水平的比較（±s）

表3 各組細胞ROS水平的比較（±s）

注：與NC組比較，△△P ＜ 0.01；與M組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

圖3 各組細胞熒光強度比較

2.4 LBP對氧化損傷HUC－MSCs內(nèi)凋亡相關(guān)基因的影響

與M 組比較，LBP－L、LBP－M、LBP－H 組Bax、Caspase－9 和Caspase－3 mRNA 的表達均顯著下降（P＜ 0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組細胞Caspase－3、Caspase－9、Bax mRNA相對表達量比較（±s）

表4 各組細胞Caspase－3、Caspase－9、Bax mRNA相對表達量比較（±s）

注：與NC組比較，△△P ＜ 0.01；與M組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

3 討論

研究表明，神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等發(fā)病率逐年升高，嚴重影響人類健康和生活質(zhì)量。這些疾病的主要特征是大腦特定疾病區(qū)域的病理變化和不同神經(jīng)元的退化。人臍帶間充質(zhì)干細胞治療神經(jīng)退行性疾病在近年的研究中取得突破進展，如JIA 等［9］采 用AD 的衰老加速小鼠模探索臨床級HUC－MSCs對認知能力恢復(fù)的影響，發(fā)現(xiàn)HUC－MSCs分泌的核心功能因子HGF能通過下調(diào)過度磷酸化Tau、改善NFT、逆轉(zhuǎn)脊柱損傷和促進突觸可塑性，其機制可能與HGF 激活 cMet/Akt/GSK3β 信號通路有關(guān)，表明HUC－MSCs療法是一種有效的神經(jīng)保護候選策略，可預(yù)防 AD 和其他進行性與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。另有研究發(fā)現(xiàn)，甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的PD 小鼠模型中，HUC－MSCs 的鼻內(nèi)給藥明顯減輕了運動障礙并拯救了多巴胺能神經(jīng)元。此外，HUC－MSC能改變腸道微生物群的組成，并調(diào)節(jié)紋狀體中的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺和結(jié)腸中的5－羥色胺水平。結(jié)果說明，HUC?MSCs 能通過改善MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠大腦和腸道之間的聯(lián)系發(fā)揮神經(jīng)保護作用［10］。但由于氧化應(yīng)激可使HUC－MSCs 在神經(jīng)組織中存活率較低，導(dǎo)致HUC－MSCs移植治療效率仍不理想。

枸杞子作為一種藥食同源的中藥，所含成分復(fù)雜，其中多糖類是重要的活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，枸杞多糖可以清除體內(nèi)氧自由基，保護細胞免受自由基產(chǎn)生的過度氧化作用的影響［11?12］，具有顯著的抗氧化、抗衰老的作用。由此，筆者推測枸杞多糖（LBP）可保護HUC－MSCs對抗氧化損傷，并通過實驗探討LBP保護HUC－MSCs對抗其氧化損傷的具體機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，LBP 能夠促進氧化應(yīng)激狀態(tài)下HUC－MSCs 的存活能力，并探討了不同濃度LBP 對HUC－MSCs 細胞活力的保護作用，LBP 濃度越高，細胞存活率越高，并能降低細胞內(nèi)ROS 生成水平，降低了凋亡相關(guān)基因的表達。

綜上所述，LBP 能夠改善氧化損傷狀態(tài)下HUCMSCs 的生存能力，提高HUC－MSCs 存活率。本實驗的結(jié)果初步表明 LBP 可保護 HUC－MSCs對抗氧化損傷，其具體作用機制有待進一步研究。