鹽酸藥根堿對HPV16 E6/E7－HaCaT細胞中NF－κB及C2TA蛋白的影響

戴任金銘，時晨，李秀，商婷婷，任青玲?

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210000；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科研究所，江蘇 南京 210000）

研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌的明確病因是高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的持續(xù)感染［1］，由HPV 感染導(dǎo)致的宮頸癌約占70%～80%［2］。盡管液基細胞學(xué)檢測等宮頸篩查手段以及HPV 疫苗的問世降低了疾病發(fā)生率及惡性進展率，但此類疾病發(fā)病率在我國仍然處于上升階段［3］。由于病毒E6/E7 蛋白介導(dǎo)的免疫逃逸現(xiàn)象，導(dǎo)致HPV 持續(xù)感染（HR－HPV）并進展成為宮頸鱗狀細胞癌的風(fēng)險大幅度增加［4］，目前臨床尚未有特異性治療宮頸HPV 感染的藥物。

HPV 是小型、無包膜DNA 病毒，通過多種途徑進行免疫逃逸，包括E6、E7 蛋白抑制細胞因子及趨化因子分泌，妨礙抗原提呈功能等。上皮細胞是病原體感染后的第一道防線，HPV 具有強烈的嗜上皮屬性，角質(zhì)形成細胞是其天然的宿主細胞［5］，作為表皮的主要成分，角質(zhì)形成細胞上表達多種模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRS），此類受體可以識別包括病毒、脂多糖、肽聚糖、鞭毛蛋白在內(nèi)的病原相關(guān)模式，導(dǎo)致產(chǎn)生促炎細胞因子和趨化因子，如IL－1β、IL－8 和CCL20 分泌，隨后將白細胞募集到損傷部位，發(fā)揮免疫殺傷作用［6?8］。角質(zhì)形成細胞上還存在主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ、Ⅱ類分子，識別處理抗原并分別將病毒抗原特異性呈遞給CD4+、CD8+T 細胞，激活效應(yīng)T細胞，產(chǎn)生大量促炎細胞因子［9?11］。然而HPV E6、E7 蛋白作為非分泌性蛋白在上皮細胞中低表達，借此逃避抗原提呈細胞的識別，使其能順利整合到宿主基因組以促進疾病惡性進展。目前關(guān)于宮頸HPV感染導(dǎo)致宮頸鱗狀細胞癌的機制研究主要集中于病毒E6、E7 蛋白，大量研究數(shù)據(jù)表明E6、E7 蛋白顯著抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB激活，IL－6、IL－1β等細胞因子的釋放，這些均使白細胞無法被正常募集到感染部位進行免疫應(yīng)答，最終幫助HPV 實現(xiàn)免疫逃逸［4，12］，為腫瘤的發(fā)展提供有益微環(huán)境。C2TA 作為NLRs 家族NLRA 的唯一成員，主要負責(zé)調(diào)控MHC Ⅱ類分子的表達，與CD4+CTL免疫殺傷機制密切相關(guān)。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸藥根堿是加味二妙顆粒君藥黃柏主要成分之一［13］，目前對其研究主要集中在抗菌及抗腫瘤等藥理學(xué)作用上［14］，但該藥物在治療人乳頭瘤病毒導(dǎo)致的宮頸鱗狀細胞癌中具體作用機制尚不明確。本研究通過生物信息學(xué)手段篩選宮頸鱗狀細胞癌組織與正常組織中C2TA 表達差異（C2TA 的低表達不利于宮頸鱗狀細胞癌患者生存），隨后通過體外實驗使用慢病毒構(gòu)建HaCaT－HPV16 E6/E7 穩(wěn)定表達細胞模型，旨在研究HPV16 E6/E7 蛋白引起的免疫逃逸過程中鹽酸藥根堿的藥理學(xué)作用以及與C2TA 及NF－κB通路相關(guān)的生物學(xué)機制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

細胞培養(yǎng)箱（美國，ThermoFisher）；高速冷凍離心機（德國，Eppendorf，5810R）；蛋白核酸分析儀（德國，Eppendorf，Bio Photometer）；垂直流超凈工作臺（德國，ESCO）；7500 實時 定量PCR 儀（美國，ABAppliedBiosystems，QUANTSTUDIO 7 FLEX QUANTSTUDIO）；多功能酶標(biāo)儀（瑞士，TECAN，M200 PRO）；電泳槽（美國，Bio－Rad，Mini PROTEAN Tera Cell）；濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀（美國，Bio－Rad）；蛋白印跡－多功能成像系統(tǒng)（美國，Bio－Rad，ChemiDoc MP）；轉(zhuǎn)移搖床（中國，海門市其林貝爾儀器有限公司）。

1.2 試劑

鹽酸藥根堿（南京良緯生物科技有限公司，批號：B21451）；DMEM 完全培養(yǎng)基（江蘇凱基生物有限公司，批號：KGM12500H－500）；0.25% 胰蛋白酶－EDTA酶（美國Gibico公司，批號：25200－056）；胎牛血清（美國Corning 公司，批號：35－081－CV）；CCK－8（上海翌圣生物科技有限公司，批號：40203ES60）；NF－κB、IKB－α（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：10745－1－AP、10268－1－AP）；C2TA（上海艾比瑪特生物醫(yī)藥公司，批號：TP71691）；p－NF－κB、羊抗鼠/兔二抗（美國CST 公司，批號：3033T、7074）；β－actin（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：66009－1－Igs）；SuperECLPlus 超敏發(fā)光液（上海天能公司，批號：180－501）；慢病毒載體pLenti－Ⅲ－HPV16E6－IRESE7Vector（Puro）（鎮(zhèn)江愛必夢生物科技有限公司，ABM）；Viral Plus Transduction Enhancer（鎮(zhèn)江愛必夢生物科技有限公司，批號：No.G698）；Polybrene（鎮(zhèn)江愛必夢生物科技有限公司，批號：No.G062）；HPV16 E6、E7 及GAPDH 引物（鎮(zhèn)江愛必夢生物科技有限公司，ABM）；RNA 抽提試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：RC－101）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：R312－01）；Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：Q712－02）；蛋白裂解液RIPA（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0013B）；BCA 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0010S）。

2 方法

2.1 數(shù)據(jù)庫及單基因生物信息學(xué)分析

Timer 數(shù)據(jù)庫是常用的癌癥免疫浸潤標(biāo)志物數(shù)據(jù)庫之一，使用基因模塊分析C2TA 表達水平與腫瘤組織中浸潤的B 細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和嗜中性粒細胞間的關(guān)系；利用GEPIA數(shù)據(jù)庫在相關(guān)性分析模塊中分析C2TA 表達在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達及其與臨床患者預(yù)后間的關(guān)系，以及免疫細胞標(biāo)志物間是否具有相關(guān)性。

2.2 細胞培養(yǎng)

HaCaT細胞在10%胎牛血清+DMEM 完全培養(yǎng)基條件下生長。HaCaT 購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，HEK293T細胞由ABM公司提供。

2.3 HaCaT 細胞系慢病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）值確定、Puromycin（Puro）篩選濃度摸索及內(nèi)源性E6/E7基因檢測

添加Viral Plus Transduction Enhancer 和Polybrene作為感染增強劑，慢病毒感染HaCaT 細胞72 h 記錄HaCaT 細胞圖片。設(shè)置MOI 梯度分別為0、5、10、20、50、100，pLenti－CMV－CBH－GFP－2A－Puro－BlankVector 慢病毒感染HEK293T 作為陽性對照組。HaCaT 細胞以20%密度培養(yǎng)在含Puromycin 的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72 h 后記錄HaCaT 細胞形態(tài)，Puromycin 濃度范圍為0～5 μg/mL。使用5XAll－In－OneRT Maste rmix with EXCellent CTLysis Kit 提取HaCaT 細 胞RNA并進行cDNA 合成，對cDNA 樣品分別使用人源HPV16 E6、E7和內(nèi)參GAPDH 的特異性引物進行RTPCR。Lenti－Ⅲ－HPV－16 E6/E7（Puro）載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T 細胞（293T－HPV）和野生型293T 細胞（293T－WT）為對照。

2.4 慢病毒包裝

適當(dāng)完全培養(yǎng)基平鋪細胞于10 cm2培養(yǎng)皿中，將細胞置于含5% CO2的37 ℃溫箱中孵育24 h后開始轉(zhuǎn)染。將pLenti－Ⅲ－HPV－16E6－IRES－E7Vector（Puro）和 Lenti－ComboPackingMix、lentifectin 共轉(zhuǎn)染 至HEK293T中，完成轉(zhuǎn)染后置于含5% CO2的37 ℃溫箱孵育。8 h 后吸去培養(yǎng)基，加入37 ℃預(yù)熱的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)將細胞放置溫箱孵育，72 h后收集細胞上清，此時為未純化的病毒液，濃縮純化處理以獲取高滴度慢病毒保存液，置于?80 ℃冰箱保存。所獲得的慢病毒定名為Lenti－Ⅲ－HPV－16E6－IRES－E7Virus（Puro）。

2.5 穩(wěn)定表達HPV16 E6/E7 基因HaCaT 細胞系的建立

在6 孔板中接種密度約為20%～30%的HaCaT 細胞，24 h 后用慢病毒感染HaCaT 細胞，在5%的CO2，37 ℃條件下孵育48 h，將感染后的HaCaT 細胞鋪板96 孔板進行穩(wěn)轉(zhuǎn)株抗性篩選，篩選培養(yǎng)基為添加終濃度0.2 μg/mL Puromycin 的完全培養(yǎng)基。篩選3 周后，選擇合適克隆進行擴增，RT－qPCR法篩選陽性克隆。

2.6 Cell Counting Kit?8（CCK－8）篩選最佳給藥濃度

將100 μL 各組細胞（5 × 104/mL）接種至96 孔板，每組設(shè)置6 個復(fù)孔，置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)，過 夜后分別 加入0.001、0.05、0.2、1、5 μmol/L 鹽酸藥根堿，接種后第24、48 h 分別終止培養(yǎng)。向各孔中加入10 μL 的CCK－8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測各組細胞的OD值。

2.7 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析轉(zhuǎn)錄水平變化

參照RNA抽提試劑盒說明書要求抽提總RNA。應(yīng)用紫外分光光度儀測定A260/A280 比值及濃度，A260/A280 比值在1.8～2.0 之間為符合純度要求。由上海生工生物科技有限公司依據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計原則設(shè)計并合成引物，引物序列見表1。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA產(chǎn)物，置于?20 ℃冰箱中保存。按照試劑盒說明書進行操作擴增。采用2?ΔΔCT法對RT－qPCR結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理。

表1 引物序列

2.8 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測C2TA 及NF－κB信號通路相關(guān)蛋白

Western blot 法檢測細胞中C2TA、NF－κB、p－NF－κB、IKB－α 蛋白表達。6 孔板中細胞每孔加入80 μL RIPA 裂解液，裂解液中按50∶1的比例加入蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑，冰上裂解，靜置10 min，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，BCA 蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度，再取適量蛋白加5 × Loading buffer 100 ℃加熱10 min，獲得樣品，?20 ℃保存。通過10% SDS－PAGE80V，30 min，110 V，60 min分離，使用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)400 mA，90 min 轉(zhuǎn)移到PDVF膜，1 × TBST洗滌3次，每次10 min，后封閉液封閉2 h。加入稀釋的一抗（稀釋倍數(shù)均為1∶1 000），搖床4 ℃ 孵育，次日1 × TBST 洗膜3 次，每次10 min。加入二抗（1∶5 000），搖床室溫孵育2 h。再用1 × TBST 洗膜3 次，每次10 min。使用超敏發(fā)光液試劑檢測。用Image Lab 軟件處理各條帶的灰度值，以目的蛋白與β－actin的灰度比值作為目的蛋白的相對含量。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用GraphPad Prism 9.00統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較，如符合正態(tài)分布且方差齊，用多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用多因素方差分析法，兩兩比較采用單因素方差分析；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊時則用非參數(shù)檢驗。P＜ 0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 C2TA表達水平與宮頸鱗狀細胞癌患者預(yù)后的相關(guān)性

在線數(shù)據(jù)庫GEPIA 對C2TA 進行相關(guān)生存分析，Kaplan－Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)C2TA 表達水平降低的宮頸鱗狀細胞癌患者OS較差。結(jié)果見圖1。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫中C2TA與宮頸鱗狀細胞癌患者預(yù)后不良的相關(guān)性

3.2 C2TA表達水平與宮頸鱗狀細胞癌免疫浸潤細胞及標(biāo)志物的相關(guān)性

C2TA 表達水平與宮頸鱗狀細胞癌純度、免疫B 細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和嗜中性粒細胞相關(guān)。結(jié)果見圖2。在此基礎(chǔ)上，探究 C2TA在宮頸鱗狀細胞癌免疫調(diào)節(jié)中的作用，進一步使用 GEPIA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)在宮頸鱗狀細胞癌組織中C2TA的表達水平與HLA－DMA，HLA－DOB、HLA－DPA1、HLA－DRA、HLA－DPB1、CD74、HLA－DOA、RP11－876、HLA－DQA1等相關(guān)。結(jié)果見表2。

圖2 C2TA表達水平與宮頸鱗狀細胞癌純度和免疫細胞的相關(guān)性

表2 TIMER數(shù)據(jù)庫中宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達水平與C2TA表達水平之間的相關(guān)性

3.3 HaCaT－HPV16 E6/E7過表達模型的建立

挑取HPV16 E6和E7基因及陰性對照慢病毒轉(zhuǎn)化后的陽性重組克隆，抽提質(zhì)粒DNA 后行酶切鑒定。結(jié)果顯示，pLenti－Ⅲ－HPV16E6－IRES－E7Vector（Puro）載體轉(zhuǎn)化菌落的酶切鑒定產(chǎn)物分別為487 bp和307 bp，片段大小和預(yù)期一致。所獲慢病毒載體重組克隆測序結(jié)果顯示HPV16 E6/E7基因序列與基因庫人編碼HPV16 E6/E7基因的序列完全吻合。在熒光顯微鏡下可觀察到在陽性對照慢病毒感染后HaCaT細胞中大量綠色熒光蛋白表達，提示慢病毒包裝成功，且MOI=20 感染效率80%～90%，細胞存活率80%（見圖3a），抗性篩選得知Puromycin濃度達到0.2 μg/mL時HaCaT 細胞死亡率為99%，以此濃度進行穩(wěn)轉(zhuǎn)株的抗性篩選（見圖3b）。RT－PCR 結(jié)果表明，實驗細胞HaCaT 中HPV16 E6、HPV16 E7 基因均無表達。經(jīng)過抗性篩選的HaCaT 穩(wěn)轉(zhuǎn)株RNA 經(jīng)RT－PCR 后條帶大小與預(yù)期符合，HPV16 E6/E7 基因經(jīng)慢病毒介導(dǎo)后成功整合至宿主細胞基因組且被成功轉(zhuǎn)錄成mRNA（見圖3c），表明穩(wěn)定表達HPV16 E6/E7 的HaCaT 細胞株建立。

圖3 慢病毒感染HaCaT細胞實驗

3.4 鹽酸藥根堿對HPV16 E6/E7 導(dǎo)致的促炎細胞因子的影響

研究使用CCK－8 確定給藥濃度，HaCaTHPV16 E6/E7 細胞經(jīng)鹽酸藥根堿給藥（0.001、0.05、0.2、1、5 μmol/L）后細胞活力均受影響（P＜ 0.05），且呈明顯的時間和劑量依賴關(guān)系，在給藥5 μmol/L 時細胞存活率約50%。結(jié)果見表3。因此，本試驗選定5 μmol/L 作用24 h 作為鹽酸藥根堿給藥組。C2TA、核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB 及IL－6、IL－8、IL－1β、TNF－α 等促炎細胞因子mRNA 水平明顯受到抑制，隨后給予鹽酸藥根堿后得到恢復(fù)，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表4。

表3 各組HaCaT－HPV16 E6/E7細胞活力的比較（±s，n =3）

表3 各組HaCaT－HPV16 E6/E7細胞活力的比較（±s，n =3）

注：與24 h存活率比較，1）P ＜ 0.05。

表4 各組HaCaT－HPV16 E6/E7細胞 NF－κB、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA表達的比較（±s，n =3）

表4 各組HaCaT－HPV16 E6/E7細胞 NF－κB、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA表達的比較（±s，n =3）

注：與對照組比較，1）P ＜ 0.05；與模型組比較，2）P ＜ 0.01。

3.5 鹽酸藥根堿對C2TA蛋白及NF－κB通路的影響

與模型組相比，鹽酸藥根堿處理組中C2TA的蛋白表達均呈上升趨勢（P＜ 0.01）。NF－κB、P－NF－κB、IKB－α是NF－κB通路中的關(guān)鍵蛋白，其激活促進細胞因子IL－6等表達，有利于將白細胞募集到受感染部位傳遞免疫信號，激活固有免疫應(yīng)答清除病原體。與對照組相比，NF－κB、P－NF－κB、IKB－α 表達明顯下降（P＜ 0.01），而鹽酸藥根堿干預(yù)后呈現(xiàn)回調(diào)趨勢，這說鹽酸藥根堿的作用機制可能與NF－κB通路以及C2TA蛋白有關(guān)，通過激活C2TA蛋白、NF－κB通路及細胞因子釋放提高上皮細胞識別HPV 癌蛋白E6/E7 的敏感性。結(jié)果見圖4和表5。

表5 各組HaCaT－HPV16 E6/E7細胞中C2TA、p－NF－κB、NF－κB、IKB－α蛋白表達的比較（±s，n =3）

表5 各組HaCaT－HPV16 E6/E7細胞中C2TA、p－NF－κB、NF－κB、IKB－α蛋白表達的比較（±s，n =3）

注：與對照組比較，1）P ＜ 0.01；與模型組比較，2）P ＜ 0.01。

圖4 各組HaCaT－HPV16 E6/E7細胞C2TA、p－NF－κB、NF－κB、IKB－α蛋白表達電泳圖

4 討論

人乳頭狀瘤病毒是常見的生殖道病原體，HRHPV 為宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)展提供有利條件［15］，E6/E7 是目前已知的兩類存在于宮頸鱗狀細胞癌中的病毒蛋白［16］。在上皮細胞的分化過程中E6/E7 通過影響促炎細胞因子分泌、上皮細胞黏附能力在內(nèi)的多種途徑幫助病毒基因組順利整合到宿主內(nèi)［17］。研究表明，E6、E7 的表達影響NF－KB 通路以及下游促炎細胞因子的激活，而細胞因子的分泌對于宿主免疫識別至關(guān)重要［18］。研究認(rèn)為，由于細胞因子的分泌對T 淋巴細胞受體（T cell receptor，TCR）識別病毒抗原，激活CTL 中的關(guān)鍵作用，HPV 感染后微環(huán)境中低水平表達的細胞因子與宮頸上皮瘤變進展相關(guān)［3］。MHC Ⅱ類分子的丟失對于免疫逃逸并不是必需的。但最近的研究數(shù)據(jù)表明，C2TA 可以調(diào)節(jié)Fas 配體或IL－4 等基因的表達，可能是參與免疫逃逸的關(guān)鍵步驟［19］。因此，推測C2TA 可通過間接效應(yīng)改變腫瘤生長、腫瘤進展或免疫逃逸［20?21］。

HPV E7蛋白通過多種途徑干擾遞呈抗原，其中包括直接干擾高爾基復(fù)合體的內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致病毒抗原肽難以被MHC 類分子識別或提呈至T 細胞受體［22］。此外，還包括病毒蛋白的低表達、影響干擾素作用，抑制細胞因子［23］、趨化因子［24］、黏附分子［25］表達等途徑，通過這些機制逃避免疫識別、殺傷。近期C2TA 在病毒感染中的作用備受矚目［26?27］，C2TA是NLRs家族NLRA的唯一成員，對MHC Ⅱ類的轉(zhuǎn)錄激活物發(fā)揮主要調(diào)控作用［28?29］，低表達的C2TA 限制MHC Ⅱ分子將病毒蛋白肽正常提呈給CD4+T細胞，一方面導(dǎo)致下游NF－κB信號通路活化受限，另一方面導(dǎo)致細胞因子及趨化因子分泌異常，以上均能幫助病毒逃避CTL 的免疫殺傷［30］。在一項對埃博拉病毒和SARS 樣冠狀病毒的研究中，研究人員利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因激活篩選方法發(fā)現(xiàn)C2TA 通過激活第二個基因CD74 的表達，誘導(dǎo)人細胞系對病毒產(chǎn)生抵抗力［9］。有研究表明［9，31?32］，C2TA的低表達導(dǎo)致MHC Ⅱ類分子表達下調(diào)，從而干擾CD4+CTL，使上皮細胞對病毒蛋白抗原多肽處于無應(yīng)答狀態(tài)，具體表現(xiàn)為NF－κB信號通路失活以及IL－6、IL－8、TNF－α 等細胞因子的表達受限。我們推測在HPV16 E6、E7 蛋白干擾細胞因子分泌過程中C2TA 發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過恢復(fù)C2TA 的表達或許能夠逆轉(zhuǎn)這一趨勢，增強免疫應(yīng)答反應(yīng)。藥根堿是從黃連等植物中分離出來的一種四氫異喹啉生物堿，其結(jié)構(gòu)與小檗堿相似，具有解毒殺菌降血糖的作用。在對黃連中4 種生物堿成分進行分析時發(fā)現(xiàn)藥根堿的抑菌作用最為明顯［33］，研究發(fā)現(xiàn)宮頸HPV 的感染與患者陰道菌群失衡密切相關(guān)［34］，陰道菌群失衡導(dǎo)致上皮細胞屏障功能受限，無法正常對病毒抗原肽進行免疫應(yīng)答，也有利于病毒實現(xiàn)免疫逃逸［35］。

本實驗通過生物信息學(xué)手段發(fā)現(xiàn)C2TA 的低表達與宮頸鱗狀細胞癌患者的不良生存情況之間存在聯(lián)系。隨后進行體外實驗驗證，利用慢病毒載體在角質(zhì)形成細胞HaCaT上成功構(gòu)建HPV16 E6/E7共同穩(wěn)定表達的細胞株，旨在研究HPV16 E6、E7 蛋白協(xié)同致病機制，鹽酸藥根堿給藥實驗試圖闡明鹽酸藥根堿在HaCaT 細胞中恢復(fù)免疫激活通路NF－κB 相關(guān)促炎細胞因子IL－6、IL－8等表達的作用。通常，宿主一旦檢測到病原相關(guān)分子模式（pathogen－associated molecular patterns，PAMPs），將會觸發(fā)細胞內(nèi)抗病毒信號級聯(lián)，誘導(dǎo)NF－κB信號通路激活和各種促炎細胞因子例如IL－6、IL－8、IL－1β 及TNF－ α 等的表達［18，28，36］，然而RT－PCR 結(jié)果顯示，IL－6、IL－8 等細胞因子在HPV16 E6/E7 過表達后受到的抑制，這提示E6、E7蛋白干擾上皮細胞免疫調(diào)節(jié)的能力可能與細胞因子分泌受限有關(guān)。為了探索E6、E7蛋白引起細胞因子分泌減少的具體機制，通過Western blot 法驗證的C2TA 蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)C2TA 在E6、E7 蛋白過表達后呈下降趨勢，以上說明細胞因子分泌減少確與C2TA之間存在聯(lián)系。此外，實驗發(fā)現(xiàn)HPV16 E6/E7 蛋白不僅抑制了細胞模型中C2TA 蛋白的表達，還干擾了NF－κB 通路的激活，這一現(xiàn)象說明HPV16 E6、E7 蛋白可能通過限制C2TA 的表達以及干擾NF－κB 通路激活影響細胞因子的分泌，抑制上皮細胞免疫反應(yīng)的敏感性。

綜上所述，鹽酸藥根堿可能通過上調(diào)HaCaTHPV16 E6/E7 細胞中C2TA 表達及激活NF－κB 調(diào)節(jié)人乳頭瘤病毒16 型E6/E7 蛋白抑制促炎細胞因子分泌，恢復(fù)上皮細胞分泌促炎細胞因子。