類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎潛在治療中藥的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)*

姚承佼，李奕霖，熊欽，羅利紅，謝鳳嬌，李廷林，謝文光，周京國(guó)，馮培民

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072； 2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637007；3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，四川 成都 610500

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性、侵蝕性、多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的致殘性自身免疫性疾病[1]，嚴(yán)重影響著世界上0.5%～1.0%的人群[2]，但其臨床緩解率卻僅有8.6%。RA病因尚不完全明確，多重研究發(fā)現(xiàn)遺傳易感性、免疫失衡、腸道菌群、神經(jīng)內(nèi)分泌、環(huán)境因素等相互交織，彼此聯(lián)系[2]，故RA又被認(rèn)為是具有遺傳傾向的多因子復(fù)雜性疾病，其中，以基因和遺傳易感性為主導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制研究一直是RA研究的焦點(diǎn)。目前，西醫(yī)尚無(wú)可根治RA的藥物，臨床治療多使用改善病情抗風(fēng)濕藥、生物制劑、合成小分子靶向藥物等，但上述藥物常出現(xiàn)如嚴(yán)重感染、骨髓抑制、肝腎功能受損、消化道反應(yīng)等不良反應(yīng)，且費(fèi)用較高，常需要聯(lián)合用藥，極大增加了患者和社會(huì)的醫(yī)療成本。

中醫(yī)將RA歸屬“痹證”“尪痹”“頑痹”的范疇[3]，有數(shù)千年的治療歷史，理論及經(jīng)驗(yàn)積累豐富，早在《素問(wèn)·痹論》中就有對(duì)其成因的描述，“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”，強(qiáng)調(diào)風(fēng)寒濕外邪致病，該篇中“榮者水谷之精氣也……衛(wèi)者水谷之悍氣也……逆其氣則病，從其氣則愈，不與風(fēng)寒濕氣合，故不為痹”，強(qiáng)調(diào)內(nèi)因致病的重要性。后世醫(yī)家在內(nèi)經(jīng)理論基礎(chǔ)上發(fā)展了“熱”“瘀”“虛”等致“痹”的理論，逐漸形成了完備的辨證論治體系[4]。中醫(yī)辨證施治，以內(nèi)、外治聯(lián)合，中西醫(yī)結(jié)合，在控制RA病情進(jìn)展及改善患者生活質(zhì)量方面取得進(jìn)展，顯示了中醫(yī)的臨床優(yōu)勢(shì)[5]。單味中藥雷公藤、白芍、青風(fēng)藤等，經(jīng)典復(fù)方如桂枝芍藥知母湯、黃芪桂枝五物湯、獨(dú)活寄生湯等，以及火針、艾灸、蜂針輸穴等中醫(yī)療法有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)的功效，可極大的改善痹證病情，緩解癥狀，改善關(guān)節(jié)功能[6-8]。中醫(yī)藥現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，治療RA的中藥單體成分繁多，包括生物堿、黃酮類、苯丙氨酸等，其可能涉及的下游通路包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear factor kappa B，NF-κB)等介導(dǎo)的經(jīng)典通路[9]。但中醫(yī)治療缺乏標(biāo)準(zhǔn)的量化指標(biāo)，藥物單體難以提取，療效背后潛在的分子機(jī)制尚不明確，故讓中醫(yī)在國(guó)際范圍內(nèi)的推廣造成困難，為中西醫(yī)結(jié)合造成困頓。

基因芯片技術(shù)因具有高通量、高速度、低成本和集約化的特點(diǎn)，已成為目前研究疾病基因和遺傳特性的主流手段之一。基因芯片技術(shù)結(jié)合應(yīng)運(yùn)而生的生物信息學(xué)分析，為深入挖掘RA發(fā)病機(jī)制、生物標(biāo)記物，探索潛在治療靶點(diǎn)、早期診斷指標(biāo)開辟了新的思路。本研究運(yùn)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的基因芯片技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析的方法，從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus，GEO，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[10]中提取原始數(shù)據(jù)，挖掘RA差異表達(dá)基因(differentialy expressed genes，DEGs)和其對(duì)應(yīng)的生物學(xué)功能及信號(hào)通路，并將其與中藥治療靶點(diǎn)相互映射，用以探尋RA高危預(yù)警、診斷和治療的中西醫(yī)結(jié)合之路，為新藥研發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)提取在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中提取GSE1919、GSE55235、GSE55457數(shù)據(jù)集的基因片段原始數(shù)據(jù)，僅保留RA患者和對(duì)照組正常人群的關(guān)節(jié)滑膜組織樣本以作進(jìn)一步分析，其中三個(gè)數(shù)據(jù)集的RA關(guān)節(jié)滑膜組織均取自關(guān)節(jié)置換術(shù)或者開放性滑膜切除術(shù)的RA患者。各基因芯片數(shù)據(jù)集包含樣本例數(shù)、芯片平臺(tái)等相關(guān)詳細(xì)信息。見(jiàn)表1。

表1 RA和對(duì)照組基因芯片的相關(guān)基本信息

1.2 DEGs篩選GEO2R(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是一個(gè)基于Limma R包用于比較GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中兩個(gè)或者多個(gè)數(shù)據(jù)集差異表達(dá)基因的交互式網(wǎng)絡(luò)工具，廣泛運(yùn)用于各種芯片的數(shù)據(jù)分析處理。利用在線分析工具GEO2R分別篩選3個(gè)基因芯片數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因，當(dāng)基因差異表達(dá)log2FC絕對(duì)值>2，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用韋恩圖(http：//bioinfor matics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對(duì)3個(gè)數(shù)據(jù)集的差異表達(dá)基因取交集，獲得最終DEGs。

1.3 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號(hào)通路富集分析DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david-d.ncifcrf.gov/)[13]是集基因注釋、可視化、數(shù)據(jù)挖掘、分析整理為一體的在線生物信息學(xué)資源庫(kù)。GO是一種重要的基因注釋生物學(xué)過(guò)程分析的生物信息工具。KEGG以從分子水平了解生物系統(tǒng)功能和實(shí)用程序而著稱，是國(guó)際上最常用的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)之一。使用DAVID對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，以 FDR<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction network，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及重點(diǎn)基因篩選STRING(https：//string-db.org/)[14]是預(yù)測(cè)功能性蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的在線平臺(tái)。深入了解不同蛋白質(zhì)在功能上的相互關(guān)系，可為深入認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后判斷提供可靠的依據(jù)。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs進(jìn)行PPI構(gòu)建，篩選標(biāo)準(zhǔn)為combined score>0.4。Cytoscape是生物信息學(xué)分析中用于網(wǎng)絡(luò)可視化分析的一個(gè)重要的開源分析工具[15]。使用Cytoscape3.7.0軟件及CytoHubba插件篩選DEGs中的重點(diǎn)基因。CytoHubba插件根據(jù)nodes在網(wǎng)絡(luò)中的屬性進(jìn)行排名，包含11種拓?fù)浞治龇椒?，degree值更高的基因更傾向于是重點(diǎn)基因。用MCODE插件對(duì)篩選出的重點(diǎn)基因進(jìn)行模塊分析，篩選條件為MCODE score>5，degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，Max depth=100，k score=2。

1.5 重點(diǎn)基因驗(yàn)證及關(guān)鍵基因篩選在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中提取GSE77298數(shù)據(jù)集的基因片段原始數(shù)據(jù)，并在GSE77298數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證篩選出的重點(diǎn)基因的表達(dá)，去掉表達(dá)趨勢(shì)相反的重點(diǎn)基因，并將表達(dá)趨勢(shì)一致的重點(diǎn)基因定義為關(guān)鍵基因。

1.6 靶點(diǎn)對(duì)接及中藥預(yù)測(cè)將篩選的關(guān)鍵基因分別映射到Coremine Medical(http：//www.coremine.com/)中，篩選出與關(guān)鍵基因相關(guān)的中藥，P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選結(jié)果基于GSE1919、GSE55235、GSE55457基因芯片數(shù)據(jù)集，利用在線分析工具GEO2R篩選RA共同DEGs 33個(gè)，其中包括32個(gè)表達(dá)上調(diào)的DEGs和1個(gè)表達(dá)下調(diào)的DEGs。DEGs交集韋恩圖見(jiàn)圖1。篩選出的DEGs名稱標(biāo)注在火山圖上，圖中橫坐標(biāo)表示基因表達(dá)差異的倍數(shù)，縱坐標(biāo)表示P值，綠色點(diǎn)表示表達(dá)下調(diào)的基因，紅色點(diǎn)表示表達(dá)上調(diào)的基因，藍(lán)色的點(diǎn)表示表達(dá)上調(diào)的DEGs，粉色的點(diǎn)表示表達(dá)下調(diào)的DEGs。見(jiàn)圖2。

圖2 RA差異表達(dá)基因火山圖

2.2 PPI構(gòu)建和重點(diǎn)基因篩選將DEGs導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)由45個(gè)節(jié)點(diǎn)和209條邊構(gòu)成，見(jiàn)圖3。使用Cytoscape中的CytoHubba插件篩選重點(diǎn)基因，依據(jù)參數(shù)Degree值排名，選擇排名前10位的DEGs為重點(diǎn)基因，見(jiàn)表2，并使用MCODE插件進(jìn)行模塊分析。結(jié)果顯示，CD27、CD79A、CXCL9、CXCL10、CXCL13、CCL5、CD3D、LCK、TNFRSF17、CCL8這10個(gè)DEGs是在RA發(fā)生發(fā)展及病情評(píng)估中起重要作用的重點(diǎn)基因。重點(diǎn)基因PPI網(wǎng)絡(luò)由10個(gè)節(jié)點(diǎn)和22條邊構(gòu)成，見(jiàn)圖4，使用Cytoscape中的MCODE進(jìn)行模塊分析，并最終得到一個(gè)重要模塊：CD27、CXCL10、CCL5、CXCL9、CXCL13，見(jiàn)圖5。

圖3 DEGs的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 重點(diǎn)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 重點(diǎn)基因中的重要模塊

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)中的重點(diǎn)基因

2.3 重點(diǎn)基因驗(yàn)證及關(guān)鍵基因篩選通過(guò)GSE77298原始數(shù)據(jù)集驗(yàn)證重點(diǎn)基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在GSE77298數(shù)據(jù)集中，RA患者滑膜組織中CD27、LCK表達(dá)下降，而在GSE1919、GSE55235、GSE55457數(shù)據(jù)集中，RA患者滑膜組織中CD27、LCK表達(dá)上升，故將兩者刪除。其余8個(gè)重點(diǎn)基因在四個(gè)數(shù)據(jù)集中的表達(dá)趨勢(shì)相同，定義為關(guān)鍵基因。

2.4 中藥預(yù)測(cè)結(jié)果Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)集中草藥、基因本體論、蛋白表達(dá)、解剖等醫(yī)學(xué)綜合信息的開放檢索平臺(tái)。將篩選到的8個(gè)關(guān)鍵基因映射到Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)，共篩選出可能治療RA的中藥172種，以P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，共篩選出靶向中藥52種。按照《中藥學(xué)》[16]將靶向中藥進(jìn)行分類發(fā)現(xiàn)，篩選出的靶向中藥主要為清熱涼血藥(白藥子、苦參、苦瓜、茶樹根、臭靈丹草、連翹、雷公藤、夏枯草、板藍(lán)根、通關(guān)藤、魚腥草、崗梅根、臭椿皮、紫草、地榆、栘枍)、祛風(fēng)散寒藥(青風(fēng)藤、姜皮、干姜、花椒、紅豆寇、鵝不食草、椒目、生姜、眼鏡蛇、八角茴香)和活血祛瘀藥(丹參、沒(méi)藥、毛冬青、合歡花)。這些篩選出的中藥可能作為RA治療潛在藥物來(lái)源。見(jiàn)表3。選擇部分清熱涼血藥物，通過(guò)Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證其所涉及生物過(guò)程。其中，雷公藤與樹突狀細(xì)胞遷移、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear factor kappa，B，NF-κB)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡過(guò)程關(guān)系緊密。通關(guān)藤與細(xì)胞周期停滯、凋亡過(guò)程、細(xì)胞自噬、細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)系密切。而祛風(fēng)通絡(luò)的青風(fēng)藤與白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)產(chǎn)生過(guò)程、滑膜細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)負(fù)調(diào)控、細(xì)胞凋亡過(guò)程密切相關(guān)。

表3 關(guān)鍵基因中藥預(yù)測(cè)結(jié)果

2.5 DEGs的GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析GO分析涵蓋分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)和生物過(guò)程(biological process，BP)三個(gè)大方面。對(duì)DEGs進(jìn)行GO分析可知，MF主要涉及趨化因子活性(chemokine activity)、免疫球蛋白受體結(jié)合(immunoglobulin receptor binding)、抗原結(jié)合(antigen binding)、肽聚糖結(jié)合等。CC主要集中在質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外組分、質(zhì)膜、IgM免疫球蛋白復(fù)合物等。DEGs涉及的生物過(guò)程主要集中在免疫應(yīng)答、B細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程、適應(yīng)性免疫反應(yīng)、趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)等。KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果表明，DEGs主要富集在細(xì)胞因子間受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、原發(fā)性免疫缺陷、Toll樣受體信號(hào)通路等。見(jiàn)表4，圖6。

表4 DEGs涉及的GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析

注：A：分子功能(molecular function，MF)；B：細(xì)胞組分(cell component，CC)；C：生物過(guò)程(biological process，BP)；D：KEGG信號(hào)通路圖6 DEGs涉及的GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種致炎過(guò)程極其復(fù)雜的自身免疫性疾病，其發(fā)病是多基因、環(huán)境、飲食等共同演變的過(guò)程。目前，已發(fā)現(xiàn)趨化因子及其受體(CXCL1、CXCL2、CXCL5、CCL9、CCL3等)[17]、自噬相關(guān)因子(Atg、ULK1、LC3等)[18]、凋亡相關(guān)因子(Bcl-2、Bax、GG2-1等)[19]及Toll樣受體、JAK-STAT、Wnt/β-catenin等[20-21]信號(hào)通路相關(guān)的多個(gè)基因的異常表達(dá)均參與RA的發(fā)生發(fā)展。故而，利用基因芯片技術(shù)從基因組上研究RA疾病發(fā)生進(jìn)展的機(jī)制，以期能起到事半功倍的效果。

本研究在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中提取多個(gè)基因芯片數(shù)據(jù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析挖掘RA差異表達(dá)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RA患者與健康對(duì)照者之間存在33個(gè)差異表達(dá)基因。GO分析和KEGG分析顯示，差異表達(dá)基因與免疫失衡關(guān)系密切。通過(guò)Cytoscape軟件中的CytoHubba插件和MCODE模塊分析，以及GSE77298數(shù)據(jù)集進(jìn)一步驗(yàn)證，得到參與RA發(fā)生發(fā)展的8個(gè)關(guān)鍵DEGs。

關(guān)鍵DEGs中CXCL9、CXCL10、CXCL13、CCL5、CCL8屬于趨化因子及其受體家族，而CD79A、CD3D、TNFRSF17則在T/B細(xì)胞分化發(fā)育成熟及信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。趨化因子可通過(guò)定向趨化免疫細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多途徑影響體液免疫、細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)過(guò)程。CCL5是趨化因子CC家族重要成員之一，可定向誘導(dǎo)T細(xì)胞趨化游走、聚集活化，是一種典型的炎癥源性趨化因子。CCL5與受體CCR5通過(guò)受體內(nèi)吞的方式結(jié)合后形成CCL5/CCR5軸，特異性表達(dá)于活化的Th1細(xì)胞表面，選擇性的誘導(dǎo)Th1細(xì)胞聚集在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑膜及滑液內(nèi)，并刺激Th1細(xì)胞產(chǎn)生大量IFN-α、TNF-α、IL-1等炎癥細(xì)胞因子，激活炎癥信號(hào)通路造成關(guān)節(jié)持續(xù)性的病理?yè)p害[22]。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)與CCR5表達(dá)量顯著相關(guān)[23]，使用CCL5抑制劑后，關(guān)節(jié)炎癥狀得到有效緩解，并能有效阻斷炎癥因子風(fēng)暴[24]。中藥雷公藤對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中CCL5表達(dá)的抑制作用顯著，并能有效緩解關(guān)節(jié)疼痛，減輕關(guān)節(jié)腫脹。趨化因子CXCL9、CXCL10則可與大量表達(dá)于Th1細(xì)胞表面的趨化因子受體 CXCR3 特異性結(jié)合，從而發(fā)揮趨化作用。CXCL10與CXCR3結(jié)合后，一方面促進(jìn)T細(xì)胞分化為CD4+Th1細(xì)胞，另一方面誘導(dǎo)RANKL表達(dá)于破骨細(xì)胞前體[25]，影響MMP-1活性，導(dǎo)致RA骨侵蝕破壞，故在RA滑膜內(nèi)可見(jiàn)大量CXCR3表達(dá)，且滑膜液內(nèi)CXCL9和CXCL10含量明顯升高，以利于CXCR3表達(dá)的炎癥細(xì)胞從血液遷移至滑膜內(nèi)[25]。趨化因子CXCL13可與B淋巴細(xì)胞表面的受體CXCR5特異性結(jié)合，激活Rap并加速細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶Pyk2磷酸化，達(dá)到定向趨化B細(xì)胞的目的[26]。在RA中，CXCL13被認(rèn)為是一個(gè)早期的生物標(biāo)記物，其水平高低可準(zhǔn)確地評(píng)估RA滑膜炎的嚴(yán)重程度。另有研究發(fā)現(xiàn)，CXCL13可趨化Tfh細(xì)胞定向轉(zhuǎn)移到淋巴濾泡，刺激其產(chǎn)生抗CCP抗體，促進(jìn)RA的發(fā)生發(fā)展[27]。

同時(shí)，本研究預(yù)測(cè)出DEGs的KEGG信號(hào)通路主要富集在細(xì)胞因子間受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、原發(fā)性免疫缺陷、Toll樣受體信號(hào)通路等。既往針對(duì)RA的生物信息學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子間受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路在RA的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用[28]，與本研究的預(yù)測(cè)不謀而合。另一項(xiàng)針對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞因子間相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，RA是一種Th1細(xì)胞介導(dǎo)的以細(xì)胞免疫反應(yīng)損傷為主的疾病[29]。Toll樣受體在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中均起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，RA滑膜細(xì)胞受到LPS刺激后可導(dǎo)致Toll樣受體信號(hào)通路活化，炎癥因子大量釋放，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜的自身免疫性炎癥和嚴(yán)重的組織損害[30]。而白芍總苷則可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，改善關(guān)節(jié)炎癥癥狀，降低炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)關(guān)節(jié)滑膜組織細(xì)胞的凋亡[31]。當(dāng)歸四逆湯可通過(guò)調(diào)節(jié)TLR/Beclin-1通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)信號(hào)蛋白表達(dá)，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)組織起到有效保護(hù)作用[32]。雷公藤內(nèi)酯醇則可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)，降低炎性因子的產(chǎn)生，減少炎性反應(yīng)[33]。

RA在中醫(yī)上沒(méi)有特定的病名，但依據(jù)本病主癥特點(diǎn)，多將其歸屬“痹病”“尪痹”“頑痹”“骨痹”等范疇?！氨浴边@一病名起始于《素問(wèn)·痹論》：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風(fēng)氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕勝者為著痹。”《備急千金要方·諸風(fēng)》中記載：“歷節(jié)風(fēng)著人，久不治者，令人骨節(jié)蹉跌……古今以來(lái)，無(wú)問(wèn)貴賤，往往苦之，此是風(fēng)之毒害者也。”由此可見(jiàn)，外感六淫中的風(fēng)、寒、濕三邪是痹證產(chǎn)生的主要外因，而葉天士《臨證指南醫(yī)案》中提到“濕熱流著，四肢痹痛。”《諸病源候論》：“熱毒氣從臟腑出，攻于手足，手足則焮熱赤腫疼痛也”，則進(jìn)一步提出了“熱毒致痹”的觀點(diǎn)，即是外感偏盛的風(fēng)、寒、濕之陰邪從濕熱進(jìn)展為熱痹[34]。由上述病機(jī)聯(lián)系證候，可將痹癥分為“風(fēng)寒濕痹”和“熱痹”兩種。RA活動(dòng)期常表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹，表皮溫度升高，壓痛明顯，疼痛劇烈，活動(dòng)受限，實(shí)為“風(fēng)寒濕邪內(nèi)侵或內(nèi)生濕邪久蘊(yùn)不解，化熱釀毒滯瘀，以致熱毒濕瘀互結(jié)，痹阻經(jīng)絡(luò)骨髓”所指的“熱痹”[34]。而在RA非活動(dòng)期，風(fēng)寒濕邪侵襲機(jī)體，痹阻經(jīng)絡(luò)，經(jīng)絡(luò)失和，氣血運(yùn)行不暢，寒性收引凝滯，關(guān)節(jié)以冷痛，屈伸不利為主，多為“風(fēng)寒濕痹”[35]。在疾病活動(dòng)期施以雷公藤、地骨皮、苦參、苦瓜、茶樹根等清熱藥，結(jié)合青風(fēng)藤、紅豆寇等祛風(fēng)藥物，暗合“熱痹”治療清熱解毒，祛濕通絡(luò)、活血止痛的治標(biāo)原則；而在疾病非活動(dòng)期以山藥、黃芪等扶正藥物，配伍丹參、沒(méi)藥活血，輔以干姜、花椒散寒，則體現(xiàn)了治療“風(fēng)寒濕痹”以扶正為主，兼化瘀祛風(fēng)通絡(luò)，溫經(jīng)散寒的治本原則。

將前文中篩選出的關(guān)鍵基因映射到Coremine Medical數(shù)據(jù)庫(kù)，以篩選對(duì)RA可能有效的中藥。篩選的中藥中，雷公藤有清熱涼血，行氣通絡(luò)功效，在臨床治療RA應(yīng)用已久。《本草綱目》記載雷公藤味苦辛，性寒，有大毒。中醫(yī)利用其毒性，以“以毒攻毒”的中醫(yī)原理，治療痹癥之“毒”。研究發(fā)現(xiàn)其能有效阻斷CCL5的表達(dá)，抑制IL-1/IL-17/IL-18等多種炎癥因子及炎癥通路，抑制VEG和/MMP-9表達(dá)，有效改善CRP、血沉、RF等指標(biāo)及DAS評(píng)分[36]。另外，預(yù)測(cè)出的藥物中還有青風(fēng)藤、通關(guān)藤和雷公藤這幾種藤類植物。古書有云“凡藤蔓之屬，皆可通經(jīng)入絡(luò)，此物善治風(fēng)疾，故一切歷節(jié)麻痹皆治之”。臨床研究發(fā)現(xiàn)，青風(fēng)藤湯能顯著降低RA患者體內(nèi)的Tfh細(xì)胞及IL-21水平，有效延緩疾病發(fā)展，改善患者臨床癥狀[37]。雷公藤內(nèi)酯醇則可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)，降低炎性因子的產(chǎn)生，減少炎性反應(yīng)[33]。連翹酯苷A是連翹的有效成分，其可通過(guò)抑制炎癥因子TNF-α的含量，并干擾TNF-α蛋白的翻譯，影響抗氧化酶及自由基含量，最終發(fā)揮抗炎功效[38]。氧化苦參堿可通過(guò)調(diào)控RA患者IL-6、TNF-α、CRP水平，明顯改善RA的免疫功能，降低炎癥因子水平，減輕關(guān)節(jié)癥狀[39]。這說(shuō)明通過(guò)現(xiàn)代生信技術(shù)預(yù)測(cè)的結(jié)果與千百年來(lái)總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，RA中的DEGs在分子功能、細(xì)胞組成、生物過(guò)程和信號(hào)通路上均與適應(yīng)性免疫密不可分。通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)出的靶向中藥可能成為治療RA的潛在藥物，為后續(xù)分子機(jī)制的挖掘以及診斷治療、新藥開發(fā)提供了重要的參考價(jià)值。未來(lái)須進(jìn)一步結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證相關(guān)中藥的療效，進(jìn)一步探索其潛在的治療靶點(diǎn)。