姜黃素調(diào)控miR-551b-3p對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

耿錳行 孫玉信

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院)

食管癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，化療是臨床上治療食管癌的主要方法之一，但治療效果不佳且患者預(yù)后較差，中草藥具有抗炎、抗癌等作用，已有研究表明甘草甜素等中藥提取物可抑制食管癌的發(fā)展進(jìn)程〔1～4〕。姜黃素是姜黃屬植物根莖中的多酚化合物，其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，并可抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，研究表明姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡〔5〕。miR-551b-3p在食管鱗癌細(xì)胞中表達(dá)水平降低，并可能參與食管鱗癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔6〕。但miR-551b-3p是否可作為姜黃素治療食管癌的潛在靶點(diǎn)尚未可知。本研究探究姜黃素調(diào)控食管癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的機(jī)制與miR-551b-3p之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 姜黃素(上海一研生物)；正常食管上皮細(xì)胞HEEC與食管癌細(xì)胞EC9706(美國(guó)ATCC)；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(上海陽(yáng)光生物)；miR-NC、miR-551b-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-551b-3p(廣州銳博生物)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒均(日本TaKaRa)；CCK-8試劑(上海李記生物)；Transwell小室(北京優(yōu)尼康生物)；Matrigel基質(zhì)膠、凋亡檢測(cè)試劑(北京索萊寶)；兔抗人G1/S特異性周期蛋白(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、p21、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(美國(guó)CST)公司；二抗(北京中杉金橋生物)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 EC9706細(xì)胞分別加入含有不同濃度(5、10、20 μmol/L)姜黃素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h〔7〕，設(shè)置低、中、高劑量姜黃素組?？瞻椎腅C9706細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-551b-3p mimics的EC9706細(xì)胞，設(shè)為miR-NC組、miR-551b-3p組。anti-miR-NC、anti-miR-551b-3p轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞后加入含有20 μmol/L姜黃素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，分別記為高劑量姜黃素+anti-miR-NC組、高劑量姜黃素+anti-miR-551b-3p組。

1.3qRT-PCR檢測(cè)miR-551b-3p表達(dá) 使用RNA抽提試劑盒提取待測(cè)細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。按照qPCR試劑盒的操作說(shuō)明書要求操作，檢測(cè)cDNA中miR-551b-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集各組細(xì)胞，調(diào)整至適當(dāng)密度2×105個(gè)/ml，按照100 μl/孔的劑量接種96孔板。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，取出每孔加入10 μl CCK-8溶液，微微震蕩混勻，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組細(xì)胞的OD值。

1.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲 侵襲：Matrigel基質(zhì)膠在稀釋時(shí)，使用無(wú)血清培養(yǎng)基。將100 μl稀釋液鋪于上室，各組細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后采用DMEM培養(yǎng)基重懸(2×105/ml)，按照每孔200 μl的密度加入上室，取含胎牛血清DMEM培養(yǎng)基600 μl加入下室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。上室底部朝上，用4%甲醛溶液固定20 min，再使用0.5%的結(jié)晶紫溶液染色15 min。遷移：上室不需加入Matrigel基質(zhì)膠稀釋液，其余同上。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書要求操作。具體步驟：用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液洗滌細(xì)胞5次，結(jié)合緩沖液制備成懸浮液。用5 μl的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V、碘化丙啶(PI)染色，避光孵育20 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析并讀取細(xì)胞的凋亡情況。

1.7Western印跡檢測(cè)CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、p21、Bax蛋白 細(xì)胞使用RIPA、超聲裂解后，12 000 r/min，離心5 min，收集總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)液對(duì)蛋白定量。將5倍的上樣緩沖液與蛋白樣品混合，并在沸水中煮沸10 min，進(jìn)行變性。取變性后的上清上樣行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離蛋白。轉(zhuǎn)膜儀將蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，轉(zhuǎn)膜后使用封閉液37℃封閉2 h。一抗稀釋液4℃孵育過(guò)夜，二抗稀釋液室溫條件下孵育1 h。ECL顯影，曝光。ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-551b-3p在食管癌EC9706細(xì)胞中的表達(dá) 與HEEC細(xì)胞(1.01±0.04)比較，EC9706細(xì)胞中miR-551b-3p的表達(dá)水平顯著降低(0.43±0.03，t=12.523，P=0.000)。

2.2姜黃素對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與對(duì)照組比較，低劑量姜黃素組、中劑量姜黃素組、高劑量姜黃素組細(xì)胞活力明顯降低，遷移侵襲數(shù)顯著下降，凋亡率顯著升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，p21、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(均P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1、表2、圖2。

表1 姜黃素對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表2 姜黃素對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖、遷移侵襲、凋亡相關(guān)蛋白及miR-5516-3p的影響

A：EC9706細(xì)胞的遷移侵襲(結(jié)晶紫染色，×100)；B：細(xì)胞凋亡流式圖圖2 姜黃素對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞遷移侵襲和凋亡的影響

2.3姜黃素對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞中miR-551b-3p的影響 與對(duì)照組比較，低劑量姜黃素組、中劑量姜黃素組、高劑量姜黃素組miR-551b-3p的表達(dá)水平升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.4過(guò)表達(dá)miR-551b-3p表達(dá)對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-551b-3p組細(xì)胞活力明顯受到抑制，遷移侵襲數(shù)均顯著下降，凋亡率明顯升高，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，p21、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(均P<0.05)，見(jiàn)圖3、表3、圖4。

A：EC9706細(xì)胞的遷移侵襲(結(jié)晶紫染色，×100)；B：細(xì)胞凋亡流式圖圖3 過(guò)表達(dá)miR-551b-3p表達(dá)對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞遷移侵襲和凋亡的影響

表3 過(guò)表達(dá)miR-551b-3p表達(dá)對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡及相關(guān)蛋白的影響

圖4 增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.5下調(diào)miR-551b-3p能逆轉(zhuǎn)姜黃素對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 與高劑量姜黃素+anti-miR-NC組比較，高劑量姜黃素+anti-miR-551b-3p組細(xì)胞活力顯著上升，遷移侵襲數(shù)均明顯上調(diào)，凋亡率顯著降低，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，p21、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5、圖6、表4、表5。

圖5 增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

A：EC9706細(xì)胞的遷移侵襲(結(jié)晶紫染色，×100)；B：細(xì)胞凋亡流式圖圖6 下調(diào)miR-551b-3p能逆轉(zhuǎn)姜黃素對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞遷移侵襲和凋亡的影響

表4 下調(diào)miR-551b-3p能逆轉(zhuǎn)姜黃素對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表5 下調(diào)miR-551b-3p能逆轉(zhuǎn)姜黃素對(duì)食管癌EC9706細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

目前食管癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，臨床主要采用手術(shù)切除等方式進(jìn)行治療，但食管癌具有高度侵襲性與轉(zhuǎn)移性導(dǎo)致患者治療效果降低，化療等治療方式又具有一定毒副作用，中醫(yī)藥在延緩病情與控制復(fù)發(fā)等方面具有重要作用，既往研究顯示，橙皮素、紫花牡荊素等可促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡，還可抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移〔8～10〕。中醫(yī)藥抗腫瘤作用主要通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)而發(fā)揮作用，但姜黃素抗食管癌的分子機(jī)制尚未闡明。

姜黃素可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，其作用機(jī)制可能與抑制Hsp90-JAK/STAT3信號(hào)通路有關(guān)〔11〕。姜黃素可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路從而抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔12〕。姜黃素對(duì)乳腺癌細(xì)胞具有增殖、遷移侵襲抑制及凋亡促進(jìn)作用〔13〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，姜黃素對(duì)食管癌細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)抑制作用。細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CyclinD1、p21在食管癌中能夠通過(guò)調(diào)控癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖〔14〕。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，姜黃素可通過(guò)抑制食管癌細(xì)胞增殖而發(fā)揮抗癌作用。MMP-2、MMP-9作為基質(zhì)破壞的標(biāo)志物，其表達(dá)水平的上調(diào)預(yù)示著細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力〔15〕。本研究結(jié)果提示，姜黃素可抑制食管癌細(xì)胞遷移及侵襲。Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白〔16〕。本研究結(jié)果提示，姜黃素可明顯促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡。

研究表明miR-551b-3p通過(guò)靶向CyclinD1而抑制人膽管癌的腫瘤生長(zhǎng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LncRNA MIAT可通過(guò)調(diào)控miR-551b-3p/CyclinD1分子軸而促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的增殖〔17，18〕。本研究結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。抑制miR-551b-3p表達(dá)可明顯拮抗姜黃素對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲及凋亡的治療作用，說(shuō)明miR-551b-3p在姜黃素的抗食管癌惡化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

綜上，姜黃素抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲，促進(jìn)凋亡。食管癌細(xì)胞中miR-551b-3p的表達(dá)水平降低，而姜黃素可促進(jìn)食管癌細(xì)胞中miR-551b-3p的表達(dá)，抑制miR-551b-3p的表達(dá)可拮抗姜黃素對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用，表明姜黃素抗食管癌的作用與上調(diào)miR-551b-3p的表達(dá)有關(guān)，可為進(jìn)一步揭示姜黃素治療食管癌的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。