單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂對DPN大鼠多元醇代謝通路及尾神經(jīng)電生理變化的影響

任麗敏 何紅麗 白玲茹 趙霞

(1南陽醫(yī)學高等?？茖W校，河南 南陽 473000；2南陽醫(yī)學高等?？茖W校第一附屬醫(yī)院門診部)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病常見并發(fā)癥，臨床癥狀以感覺喪失、肌肉萎縮、疼痛等為主，可累及運動、感覺及自主神經(jīng)，引發(fā)坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)及細胞受損，造成患者疼痛和神經(jīng)功能障礙，極大影響其正常工作生活〔1，2〕。糖尿病(DM)體內(nèi)高糖環(huán)境可引發(fā)嚴重的炎癥反應(yīng)，造成坐骨神經(jīng)軸突變性萎縮、髓鞘紊亂、神經(jīng)細胞凋亡，在DPN的病理過程中具有關(guān)鍵作用〔3〕；另外高糖還可激活多元醇代謝通路，使神經(jīng)細胞內(nèi)多元醇含量明顯增加，造成滲透性腫脹，破壞細胞結(jié)構(gòu)完整性，并可促進氧自由基生成，加重炎癥反應(yīng)，也是DPN重要發(fā)病機制之一〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM)1可減輕DPN患者神經(jīng)炎癥，緩解疼痛，改善其臨床癥狀，具有神經(jīng)保護作用〔5，6〕，本研究探索GM1對DPN大鼠多元醇代謝通路及尾神經(jīng)電生理變化的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 清潔級雄性SD大鼠：上海茂生衍生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2017-0004，體重180～220 g，飼養(yǎng)在南陽醫(yī)學高等專科學校第一附屬醫(yī)院動物房中，室內(nèi)環(huán)境安靜、通風良好，維持清潔級，溫度25℃，相對濕度55%，自然照明。

1.1.2主要試劑及儀器 GM1鈉(長春翔通藥業(yè)有限公司，國藥準字H20066833)；甲鈷胺(北京星昊醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H20060865)；鏈脲佐菌素(西安熱默爾生物科技有限公司，貨號0210055701)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海信帆生物科技有限公司，貨號G1120-10)；大鼠醛糖還原酶酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海圻明生物科技有限公司，貨號YS06433B)；大鼠山梨醇ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，貨號LCS34521)；大鼠白細胞介素(IL)-6 ELISA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒、果糖測定試劑盒(美國Abcam公司，貨號ab100772、ab5603、ab83380)；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(上海碧云天公司，貨號：P0013K、P0011)等。XElx800酶標儀(Perkin Elmer公司，美國)；BIO-EVF3 Von Frey探針(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，中國)；ZH-YLS-6B智能熱板儀(上海珂淮儀器有限公司，中國)；RM2016病理切片機(購自上海徠卡儀器有限公司，中國)；ECLIPSE CI正置光學顯微鏡(NIKON公司，日本)；肌電誘發(fā)電位儀(大化集團有限責任公司，中國)等。

1.2方法

1.2.1動物模型制備及分組給藥 參考文獻〔7〕中的方法制備DPN大鼠模型：尾靜脈注射55 mg/kg劑量的鏈脲佐菌素溶液，72 h后測量血糖，至少連續(xù)2次結(jié)果均高于16.7 mmol/L，提示DM大鼠模型建立成功，28 d后以不同標號的Von Frey探針刺激安靜狀態(tài)下大鼠右側(cè)后爪皮膚，記錄大鼠嘶吼或縮爪任一行為時Von Frey探針的克數(shù)，即縮爪閾值，重復測試5次，中間間隔5 min，取平均值，當其明顯降低時，表明DPN大鼠造模成功。共建模64只，成功60只，隨機分為5組：模型組、GM1低劑量組、GM1中劑量組、GM1高劑量組、甲鈷胺組，每組12只，另取12只SD大鼠，腹腔注射等劑量生理鹽水，設(shè)定為對照組。

將GM1〔8〕溶于生理鹽水，GM1各劑量組以1.0、2.5、5.0 mg/kg的劑量尾靜脈注射，同時以與甲鈷胺組相同的劑量灌胃生理鹽水；將甲鈷胺〔9〕溶于生理鹽水，甲鈷胺組以0.25 mg/kg的劑量灌胃，同時以與GM1高劑量組相同的劑量尾靜脈注射生理鹽水；對照組與模型組以與甲鈷胺組相同的劑量灌胃生理鹽水，同時以與GM1高劑量組相同的劑量尾靜脈注射生理鹽水，1次/d，持續(xù)14 d。

1.2.2大鼠疼痛檢測試驗 結(jié)束給藥后24 h，進行機械性疼痛刺激試驗，檢測縮爪閾值；熱敏試驗：將安靜的大鼠放置在溫度保持在(44±1)℃的智能熱板儀熱板上，記錄大鼠出現(xiàn)后肢撤回或嘶吼時所用的時間，即為熱敏潛伏期，重復測試5次，中間間隔25 min，取平均值。

1.2.3大鼠尾神經(jīng)電生理變化檢測 疼痛檢測試驗結(jié)束后，以肌電誘發(fā)電位儀測定大鼠尾神經(jīng)電生理指標：尾神經(jīng)根部遠端放置刺激電極的陰極，近端放置陽極，相距1 cm，參考電極置于尾尖遠端，相距記錄電極1 cm，記錄電極置于尾尖近端，相距刺激電極陰極14 cm，接地電極置于刺激電極與記錄電極之間，在3～6 mA范圍內(nèi)逐漸增加刺激強度，使記錄到的神經(jīng)動作電位達到最大值，測定運動神經(jīng)傳導速度、波幅；將記錄電極與刺激電極互換，刺激強度固定于1.2 mA，測定感覺神經(jīng)傳導速度、波幅。

1.2.4大鼠坐骨神經(jīng)病理變化情況檢測及標本收集 電生理檢測結(jié)束后，使用5 ml注射器經(jīng)尾靜脈取血3 ml，靜置10 min，3 000 r/min，4℃，離心15 min，收集上清，獲得血清，儲存在-80℃冰箱備用；大鼠吸入乙醚麻醉，斷頭處死，解剖分離右側(cè)后肢坐骨神經(jīng)組織，取0.5 g剪碎，加入1 ml RIPA裂解液，勻漿，3 000 r/min，4℃，離心20 min，收集上清，獲得蛋白樣品液，采用BCA法測量總蛋白濃度后，-80℃儲存?zhèn)溆?；剩余坐骨神?jīng)組織以4%多聚甲醛溶液固定、低濃度到高濃度的梯度酒精溶液脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，采用切片機做厚度為2 μm的連續(xù)病理切片，經(jīng)脫蠟、高濃度到低濃度梯度酒精溶液浸泡處理后，做HE染色，參照試劑盒說明書進行，再次進行脫水、透明處理，最后封片，使用光學顯微鏡觀察坐骨神經(jīng)病理變化，任選5個視野拍照。

1.2.5大鼠坐骨神經(jīng)醛糖還原酶活性、多元醇(山梨醇、果糖)含量和血清IL-6、TNF-α水平檢測 取出1.2.4中的蛋白樣品液和血清，置于冰水浴中解凍，以各自試劑盒檢測其中醛糖還原酶活性、多元醇(山梨醇、果糖)含量、IL-6、TNF-α水平，具體步驟參照說明書進行。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS24.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組機械性痛覺刺激及熱敏刺激測定結(jié)果 與對照組比較，模型組縮爪閾值及熱敏潛伏期明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，GM1低、中、高劑量組及甲鈷胺組縮爪閾值及熱敏潛伏期升高，且GM1各組呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，GM1高劑量組與甲鈷胺組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組縮爪閾值及熱敏潛伏期

2.2各組尾神經(jīng)電生理變化 與對照組比較，模型組運動及感覺神經(jīng)傳導速度、波幅均顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，GM1低、中、高劑量組及甲鈷胺組運動及感覺神經(jīng)傳導速度、波幅均明顯升高，且GM1各組呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，GM1高劑量組與甲鈷胺組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組尾神經(jīng)電生理變化

2.3各組坐骨神經(jīng)病理形態(tài)變化 對照組神經(jīng)纖維排列緊密，結(jié)構(gòu)正常。模型組神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)混亂，排列松散分離，出現(xiàn)明顯的病理損傷。與模型組比較，GM1低、中、高劑量組及甲鈷胺組神經(jīng)纖維病理損傷減輕，且神經(jīng)纖維組織結(jié)構(gòu)隨GM1劑量升高而逐漸恢復正常，GM1高劑量組與甲鈷胺組比較，神經(jīng)纖維病理損傷無明顯差異，見圖1。

圖1 各組坐骨神經(jīng)病理(HE染色，×200)

2.4各組坐骨神經(jīng)醛糖還原酶活性 與對照組比較，模型組坐骨神經(jīng)醛糖還原酶活性顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，GM1低、中、高劑量組及甲鈷胺組坐骨神經(jīng)醛糖還原酶活性明顯降低，且GM1各組呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，GM1高劑量組與甲鈷胺組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.5各組坐骨神經(jīng)多元醇(山梨醇、果糖)含量 與對照組比較，模型組坐骨神經(jīng)山梨醇、果糖含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，GM1低、中、高劑量組及甲鈷胺組坐骨神經(jīng)山梨醇、果糖含量明顯降低，且GM1各組呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，GM1高劑量組與甲鈷胺組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.6各組血清TNF-α、IL-6水平 與對照組比較，模型組血清TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，GM1低、中、高劑量組及甲鈷胺組血清TNF-α、IL-6水平含量明顯降低，且GM1各組呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，GM1高劑量組與甲鈷胺組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組坐骨神經(jīng)醛糖還原酶活性、山梨醇、果糖含量及血清TNF-α、IL-6水平

3 討 論

DPN是DM患者的一種慢性并發(fā)癥，可導致其肢體麻木、疼痛、感覺減退，嚴重時可致殘，甚至致死〔10〕。DPN病程進展緩慢，發(fā)病機制復雜，與氧的親和力強的糖化血紅蛋白增多，引發(fā)血氧降低，造成組織細胞長期缺氧是DPN患者發(fā)生神經(jīng)病變的病理基礎(chǔ)〔11，12〕。神經(jīng)電生理檢查運動及感覺神經(jīng)傳導情況，在DPN基礎(chǔ)及臨床研究中得到了廣泛應(yīng)用，是判定DPN治療效果的經(jīng)典檢測方法〔13〕。本文結(jié)果表明鏈脲佐菌素誘導的高血糖可損害大鼠坐骨神經(jīng)組織，造成運動及感覺神經(jīng)傳導受損，并引發(fā)疼痛，提示模型建立成功。

大多研究認為DPN的發(fā)病與多元醇通路激活、糖基化產(chǎn)物產(chǎn)生、微血管病變、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等諸多因素有關(guān)。醛糖還原酶是多元醇代謝通路中的第一個酶，激活該酶，可促使葡萄糖大量轉(zhuǎn)化為山梨醇，并進一步轉(zhuǎn)化為果糖，積累在神經(jīng)細胞內(nèi)，導致產(chǎn)生高滲狀態(tài)，造成細胞腫脹、破裂〔14，15〕，另外高糖可誘導氧自由基過量產(chǎn)生，促進炎性因子表達，引發(fā)嚴重的炎癥反應(yīng)，最終加重神經(jīng)組織損傷〔16～18〕。研究發(fā)現(xiàn)，GM1是治療DPN的常用藥物，可降低患者炎性因子水平，抑制炎癥發(fā)生發(fā)展，緩解患者感覺異常及疼痛，改善神經(jīng)傳導速度，但其對多元醇代謝通路的影響目前還未見明確闡述〔19，20〕。本文結(jié)果表明，GM1可降低炎性因子表達，抑制多元醇代謝通路，減輕炎癥，緩解坐骨神經(jīng)病理損傷，改善神經(jīng)傳導障礙及疼痛，進一步證明了GM1對DPN的臨床療效。

綜上，GM1可降低DPN大鼠促炎因子水平，阻止炎癥發(fā)生及進展，減輕坐骨神經(jīng)組織炎癥損傷，緩解疼痛，改善坐骨神經(jīng)運動和感覺傳導功能，抑制多元醇代謝通路可能是其藥理機制之一，但未對調(diào)控多元醇代謝的分子信號進行探討，需進行后續(xù)深入探究。