黃芪總皂苷調(diào)控LKB1/AMPK信號通路對人乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期的影響及機(jī)制

譚艷芳 張艷冰 萬紅霞 肖薇 趙友蘭

(萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院 1甲狀腺乳腺外科，江西 萍鄉(xiāng) 337000；2藥劑科)

乳腺癌是多發(fā)于女性乳腺上皮或?qū)Ч苌掀さ膼盒阅[瘤〔1〕，是較為常見的侵襲性癌癥〔2〕，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中占據(jù)首位〔3〕，對女性生命健康構(gòu)成極大威脅〔4〕。當(dāng)下，乳腺癌的臨床治療以手術(shù)切除治療、藥物靶向治療、放療、化療為主，其中放化療不良反應(yīng)明顯，常輔以中藥材來緩解其產(chǎn)生的不良反應(yīng)。近年來，研究人員將研究重點(diǎn)放在中藥方面，部分中藥材具有天然的抗癌、抑癌效果，從植物代謝產(chǎn)物中篩選和發(fā)掘新的化合物是開發(fā)低毒高效抗癌藥物的重要途徑〔5〕。目前，中藥治療乳腺癌在臨床中被廣泛應(yīng)用〔6〕。黃芪總皂苷是于豆科植物蒙古黃芪的根中提取的，具有調(diào)控血糖、增強(qiáng)免疫、抗癌、抗氧化、改善炎癥反應(yīng)等多種作用〔7,8〕。有文獻(xiàn)記錄，黃芪總皂苷作用于人乳腺癌細(xì)胞后使大多數(shù)細(xì)胞誘導(dǎo)有絲分裂停滯和細(xì)胞凋亡，而存活細(xì)胞變得衰老，但其機(jī)制尚不可知。肝激酶(LK)B1是磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)上游激酶〔9～11〕，研究證明，LKB1/AMPK信號通路能夠影響癌細(xì)胞的增殖與凋亡。目前，對于黃芪總皂苷作用于乳腺癌的研究較少，其具體的作用機(jī)制也尚不清楚。本研究基于LKB1/AMPK信號通路探討黃芪總皂苷對人類乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及周期的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑、儀器 人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1；黃芪總皂苷；DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清(FBS)；裂解液；試劑盒；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀；酶標(biāo)儀；顯微鏡；流式細(xì)胞儀。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)液中添加FBS，青、鏈霉素，于37℃、5%CO2中培養(yǎng)ZR-75-1細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶細(xì)胞傳代。

1.3人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1增殖抑制檢測 取調(diào)整至5×106/ml濃度的ZR-75-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔100 μl，等待24 h。加入100 μl濃度各異的培養(yǎng)液，使黃芪總皂苷濃度分別為0(對照組)、50(低劑量組)、100(中劑量組)、150(高劑量組)mg/μl，等待24 h，加噻唑藍(lán)(MTT)液，無光環(huán)境下等待4 h，終止培養(yǎng)，去除培養(yǎng)基，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μl，震蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm檢測吸光度(A)，算抑制率。

1.4人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1凋亡情況 取人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1，藥物作用24 h，收集細(xì)胞，用200 μl冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞；加重懸細(xì)胞、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)、碘化丙啶(PI)混勻，室溫?zé)o光環(huán)境下靜置10 min，檢測。

1.5人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1細(xì)胞周期變化 取人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1，用不同濃度黃芪總皂苷作用24 h，消化，收取細(xì)胞，清洗2次，冷乙醇固定，4℃過夜，離心去乙醇，清洗，加入含RNaseA的 PBS 500 μl，再加入PI染色混勻，37℃無光環(huán)境下等待30 min，檢測。

1.6人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1 LKB1、AMPK mRNA表達(dá) 采用不同濃度的黃芪總皂苷處理細(xì)胞48 h后，TRIZOL提取人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行PCR檢測。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃，10 s，60℃，40 s，共27個(gè)循環(huán)。并用公式進(jìn)行定量分析：ΔCt =目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。引物序列為：LKB1：正向5′-GAGATGGACTTATATGAGGACTAC-3′，反向5′-TTGCTGCTAACA-CTTGAGAC-3′；AMPK：正向5′-CCAGGGACCATGTTTTGCC-3′，反向5′-CGAAGACGACAAGATGGACAA-3′；β-actin：正向5′-GGCATCGTGATGGACTCCG-3′，反向5′-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3′。

1.7人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1 LKB1、AMPK蛋白表達(dá) 人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1藥物作用24 h。終止細(xì)胞培養(yǎng)后，吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌，冰浴裂解30 min，離心，得到總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)測總蛋白，電泳后，移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉1 h，加抗體 LKB1、AMPK及β-actin，一抗4℃孵育過夜；清洗3次，5 min/次；加二抗，室溫培養(yǎng)1 h，洗3次，每次10 min，無光環(huán)境下等待5 min，顯影、掃描、分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組ZR-75-1細(xì)胞增殖情況 乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1的增殖受到黃芪總皂苷的影響，隨黃芪總皂苷劑量攀升，癌細(xì)胞增殖抑制率逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2各組ZR-75-1細(xì)胞凋亡狀況 乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1的凋亡受到黃芪總皂苷影響，黃芪總皂苷劑量越大，乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1的凋亡率越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

圖1 各組ZR-75-1細(xì)胞凋亡

2.3各組ZR-75-1細(xì)胞周期波動(dòng) 乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1的細(xì)胞周期受黃芪總皂苷影響出現(xiàn)波動(dòng)，隨黃芪總皂苷劑量攀升，G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期、G2期明顯降低，見圖2。

圖2 各組ZR-75-1細(xì)胞周期波動(dòng)

2.4各組ZR-75-1細(xì)胞LKB1、AMPK mRNA及蛋白表達(dá) 黃芪總皂苷作用下，乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1 LKB1、AMPK mRNA及蛋白表達(dá)上升，黃芪總皂苷劑量越高，LKB1、AMPK mRNA及蛋白表達(dá)上升越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖3。

表1 各組ZR-75-1細(xì)胞增殖率、凋亡率及LKB1、AMPK mRNA與蛋白表達(dá)

1～4:對照組，黃芪總皂苷低劑量組，黃芪總皂苷中劑量組，黃芪總皂苷高劑量組圖3 各組ZR-75-1細(xì)胞 LKB1、AMPK蛋白表達(dá)

3 討 論

近年來乳腺癌的發(fā)病率在全球女性癌癥中占榜首〔12〕。研究人員不斷探索新的治療方式，在此過程中，中藥憑借其靶點(diǎn)眾多、治療效果明顯、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)脫穎而出，得到眾多學(xué)者的關(guān)注。目前，已有多種中藥如連翹歸尾煎〔13〕、茯苓多糖〔14〕、莪術(shù)醇〔15〕等投入乳腺癌的治療。黃芪總皂苷是我國傳統(tǒng)中草藥豆科植物蒙古黃芪的根的提取物，具有升陽、固表、補(bǔ)中益氣的功效，能有效增強(qiáng)機(jī)體特異及非特異性免疫功能，同時(shí)也具有保肝、利尿、抗衰老、抗應(yīng)激、降壓和抗菌作用。相關(guān)研究指出，黃芪總皂苷對糖尿病、神經(jīng)元退行性疾病及部分癌癥具有較好的治療效果，其機(jī)制主要與機(jī)體代謝及自噬有關(guān)〔16,17〕。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1的增殖活力隨黃芪總皂苷的劑量而改變，黃芪總皂苷的劑量越高，其對乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1的增殖抑制作用就越強(qiáng)。流式術(shù)表明，乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1的凋亡與黃芪總皂苷密切相關(guān)，黃芪總皂苷的劑量越高，人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1的細(xì)胞凋亡率就越高，其他研究也指出，黃芪總皂苷能抑制人胃癌BGC-823細(xì)胞生長,降低其侵襲能力,并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔18〕。中藥抑制癌細(xì)胞增殖的重要途徑便是誘發(fā)癌細(xì)胞出現(xiàn)周期阻滯，本研究結(jié)果提示，黃芪總皂苷可能阻斷了乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1的細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1在G0/G1期阻滯，且黃芪總皂苷劑量越高，其變化就越明顯。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)內(nèi)容得知，黃芪總皂苷可能壓制乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1的增殖活性、推動(dòng)乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1自主走向凋亡，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1于G0/G1 期阻滯，從而達(dá)到遏制腫瘤擴(kuò)散的作用。

LKB1/AMPK信號通路是人體內(nèi)健康細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的能量感知橋梁，其能夠密切關(guān)注并感知細(xì)胞能量，此外，其還能夠誘導(dǎo)代謝適應(yīng)途徑從而保證細(xì)胞的生存狀態(tài)。一旦人體內(nèi)出現(xiàn)缺氧或營養(yǎng)匱乏情況，細(xì)胞內(nèi)一磷酸腺苷/三磷酸腺苷感知能量應(yīng)激條件陡然升高，LKB1就會(huì)磷酸化激活A(yù)MPK、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶〔19,20〕。AMPK、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶被激活后，LKB1/AMPK信號通路中分解代謝產(chǎn)生三磷酸腺苷的過程會(huì)隨之增加，如糖酵解和脂肪酸氧化，并抑制三磷酸腺苷消耗的生物合成過程，如蛋白質(zhì)、膽固醇和脂肪酸合成。已有研究證明〔21〕，LKB1是確定的腫瘤抑制因子，最早是在非洲爪蟾胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，它是經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)下糖原合成酶激酶(GSK)-3β激活的負(fù)調(diào)節(jié)因子。TCS2被GSK-3β磷酸化后抑制雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路，在Wnt刺激后與AMPK協(xié)同。在敲除了LKB1基因的人宮頸癌HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染了LKB1基因的HeLa細(xì)胞的增殖活性大大減弱，顯示出明顯的抑制作用。AMPK是腫瘤抑制因子。體外細(xì)胞試驗(yàn)表明，將LKB1、AMPK過度轉(zhuǎn)染于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，其貼壁的生長及體內(nèi)實(shí)體腫瘤生長明顯被抑制。此外，AMPK 已被證明對某些癌癥中癌基因誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)展和細(xì)胞增殖過程至關(guān)重要及 MEF和某些癌細(xì)胞系中的失巢凋亡抗性。在細(xì)胞遷移和侵襲期間，AMPK的藥理學(xué)活化導(dǎo)致線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)及腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)含量和細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的變化。LKB1/AMPK 信號傳導(dǎo)途徑的抑制培養(yǎng)條件是癌細(xì)胞存活和球狀體遷移所必需的〔21,22〕。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1 LKB1、AMPK mRNA及蛋白的表達(dá)都在黃芪總皂苷的影響下發(fā)生了變化，隨著黃芪總皂苷作用劑量的增加，LKB1、AMPK mRNA、蛋白表達(dá)對應(yīng)增加，這與上述內(nèi)容也相符合。

綜上，黃芪總皂苷使人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1的增殖活力受到遏制，并誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-1凋亡并在細(xì)胞增殖周期G0/G1期中阻滯，這其中產(chǎn)生作用的機(jī)制通道與LKB1/AMPK信號通路密切相關(guān)，至于其中是否有其他作用機(jī)制尚不可知，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。