廣西壯族兒童哮喘易感基因預測模型的篩選

馬卓然，林娜

(1. 右江民族醫(yī)學院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

支氣管哮喘是兒童常見的慢性呼吸道疾病。《2022年全球哮喘防治指南(GINA)》[1]認為哮喘是一種以慢性氣道炎癥、可變呼氣氣流受限為特征的特異質疾病。長期發(fā)病可導致氣道重構。哮喘的發(fā)病不僅與年齡、性別、環(huán)境等因素有關，還與基因多態(tài)性有關[2]。2006年，OBER C等[3]在對人全基因組進行分析后發(fā)現超過25種基因多態(tài)性，如：β腎上腺素受體(ADRB2)基因、IgE高親和力受體(FCER1B)基因、白細胞介素4受體(IL-4R)等可能與哮喘的發(fā)病相關。哮喘發(fā)病的不定時性、氣道重塑的難逆轉性，嚴重影響患兒的生活。兒童哮喘的有效預防也成為哮喘疾病研究的新熱點。2009年上海交通大學華麗等[4]提出的9位點[FCER1B rs1441586(C-109T)、FCER1B rs5-69108(E237G)；ADRB2 rs1042713(R16G)；IL-4R rs1801275(Q551R)、IL-4R rs1805010(I75V)；IL-4R rs2243250(C-590T)；IL-13 rs1295686(C1923T)、IL-13 rs20541(A2044G)、IL-13 rs1800925(C-1112T)]構成的漢族兒童哮喘易感基因預測模型，對漢族兒童有較好的預測效能。本研究選取漢族兒童哮喘易感基因預測模型中的5個位點，驗證所選位點與廣西壯族兒童哮喘發(fā)生的相關性，旨在篩選廣西壯族兒童哮喘易感基因預測模型適合位點，擴大漢族兒童易感基因預測模型的適用范圍，為壯族兒童哮喘預防提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 哮喘病例組 選取2021年1月至2021年9月就診于右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸科的100例確診哮喘患兒為哮喘病例組。其中男71例，女29例，年齡1～11歲，平均(4.36±2.15)歲。納入標準：①符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》；②入院前2周內未使用抗生素、激素、平喘等藥物。排除標準：①患有喉炎、毛細支氣管炎、氣道器質性病變(如：狹窄、軟化、畸形等)、氣道異物等；②合并肺部疾病、心臟病、免疫系統(tǒng)疾病等；③長期或近期服用免疫調節(jié)劑；④尚不能確診哮喘的其他喘息性疾病。

1.1.2 健康對照組 選取同期右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院體檢中心的100例正常兒童為健康對照組。其中男62例，女38例，年齡1～12歲，平均(4.29±2.72)歲。納入標準：①截至目前未出現喘息史、過敏史、濕疹史等；②三代以內直接家屬中無哮喘、鼻炎等疾??；③近期未服用免疫調節(jié)劑、激素、抗生素等藥物。

1.1.3 兩組基本資料 以上兩組兒童祖孫三代及以上均為壯族，個體之間沒有血緣親屬關系，年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義(t=0.574，χ2=1.818，P>0.05)。本研究已獲得本院倫理委員會批準，符合《赫爾辛基宣言》道德原則，所有患兒和(或)家屬均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器及試劑 DNA提取試劑盒(GK1043型)、PCR儀-A300(杭州朗基科學儀器有限公司)、3730XL基因測序儀(美國ABI公司)、電泳儀君意JY300C(山東博科科學儀器有限公司)、PCR MIX試劑(上海翊圣生物科技有限公司)、引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司)、Taq DNA ligase(美國NEB公司)。

1.2.2 DNA提取 空腹抽取患者外周血1 mL，放入EDTA抗凝管中，去除紅細胞后，嚴格按照離心柱法提取DNA，放入-20 ℃冰箱中保存。用分光光度計檢測提取的DNA含量，并通過0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度、純度。

1.2.3 單核苷酸多態(tài)性檢測 位點選擇：本研究所選位點均來源于dbSNP數據庫，有穩(wěn)定遺傳特性，且被國內外報道與兒童哮喘疾病發(fā)生有關。引物設計：根據GenBank所提供序列，用Primer 5.0設計位點擴增引物，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。PCR擴增：總反應體系15 μL，包括模板DNA 1 μL(20～50 ng/μL)、上下游引物各0.3 μL、2×PCR Mix 7.5 μL、雙蒸水5.9 μL。充分混勻后放入PCR擴增儀。反應過程：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸40 s，共循環(huán)35次；72 ℃修復延伸10 min。LDR連接反應：總反應體系10 μL，包括PCR產物3 μL、10×buffer 1 μL、Taq DNA連接酶(40 U/μL)0.125 μL、探針(10 μM)0.2微升/條；雙蒸水 2.875 μL。反應過程：94 ℃變性20 s、58 ℃退火90 s，共循環(huán)30次。取1 μL延伸產物加入9 μL高度去離子甲酰胺(HiDi)冰水浴后測序。Gene Marker軟件分析結果。

表1 5位點引物設計序列

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 ADRB2 rs104271

3、FCER1B rs569108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs18-05010位點均檢測出AA、AG、GG基因型，FCER1B rs1441586檢測出CC、CT、TT基因型。經Haploview 4.1軟件計算，以上位點在哮喘組與健康組之間的實測頻率與期望頻率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡定律(見表2)，證明所選位點有群體代表性，可進行遺傳學研究?；蚍逍鸵妶D1。

表2 所選位點Hardy-Weinberg平衡定律遺傳檢驗

表2(續(xù)) 所選位點Hardy-Weinberg平衡定律遺傳檢驗

圖1 FCER1B基因 rs569108、rs1441586 位點峰形圖

2.2 基因型及基因頻率的比較 經檢驗ADRB2 rs1042713、IL-4R rs1801275位點的基因型與基因頻率在哮喘組與健康組之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩位點基因型AA數量及等位基因A的頻率高于對照組；FCER1B rs1441586、FCER1B rs569108、IL-4R rs1805010位點的基因型及等位基因頻率在兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3～表7。

2.3 廣義多因子降維分析 采用GMDR對所選位點(ADRB2 rs1042713，FCER1B rs1441586、FCER1B rs569108，IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010)進行降維分析結果顯示：FCER1B rs1441586和IL-4R rs1801275組成模型有哮喘預測作用。其預測模型準確度為60.00%，靈敏度為72.00%，特異度為48.00%，OR(95%CI)=2.374(1.0358～5.444)，χ2=4.245，P=0.039。見表8。

表3 兩組兒童ADRB2 rs1042713位點基因型及等位基因頻率比較

表4 兩組兒童IL-4R基因rs1801275位點基因型及等位基因頻率比較

表5 兩組兒童FCER1B基因rs1441586位點基因型及等位基因頻率比較

表6 兩組兒童FCER1B基因rs569108位點基因型及等位基因頻率比較

表7 兩組兒童IL-4R基因rs1805010位點基因型及等位基因頻率比較

表8 GMDR方法分析多位點交互作用的模型

2.4 兩兩位點協(xié)同比較 按是否攜帶ADRB2 rs1042713純合子AA和FCER1B rs569108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010純合子GG進行兩兩亞組劃分。結果顯示哮喘組中兒童攜帶AA+非GG的數量高于非AA+非GG。健康組中兒童攜帶AA+非GG的數量低于非AA+非GG。計算發(fā)現，哮喘組與健康組兒童在ADRB2 rs1042713AA+非GG與ADRB2 rs1042713非AA+非GG中差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05) ，見表9。當哮喘組和健康組兒童ADRB2 rs1042713基因座為非AA+GG與ADRB2 rs1042713非AA+非GG時，哮喘發(fā)生風險差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表10。

表9 ADRB2 rs1042713 AA基因型與FCER1B rs569108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010位點兩兩協(xié)同比較

表10 ADRB2 rs1042713 非AA基因型與FCER1B rs569108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010位點兩兩協(xié)同比較

3 討論

哮喘是以反復發(fā)作的呼吸道氣流受限、慢性氣道炎癥、氣道重塑為主要表現的特異質疾病。長期發(fā)作可導致下氣道產生病理學變化。全球約有3.34億人患有哮喘[5]，兒童哮喘發(fā)病率高于成人，且有逐年上升趨勢。隨著醫(yī)學分子生物學的不斷發(fā)展，人們對哮喘疾病的認識逐漸從環(huán)境方面向生物醫(yī)學方面轉變。基于人類基因組測序的不斷完善，更多與哮喘有關的基因已被發(fā)現，單核苷酸多態(tài)性(SNP)與哮喘疾病的發(fā)生已成為研究哮喘發(fā)病機制的熱點問題。 通過檢測兒童單核苷酸的變異程度來預測哮喘發(fā)生風險，已成為兒童哮喘預防的新方向。2009年由9個位點組成的漢族兒童哮喘易感基因預測模型被提出[4]，優(yōu)化后提出了4位點漢族兒童哮喘預測模型[6]。經驗證，兩個模型均有較好的哮喘風險預測效果，且適用于低齡喘息性患兒[7]、新疆漢族兒童[8]和浙江地區(qū)兒童。壯族是中國人口最多的少數民族[9]，哮喘易感基因預測模型的篩選、模型建立、模型優(yōu)化對壯族兒童哮喘的早期預防、延緩進展、改善預后等方面有著積極意義。

β腎上腺素受體(ADRB2)屬于G蛋白耦聯(lián)受體，由5號染色體(q31-q32)段編碼。與哮喘相關的rs1042713位點突變屬于錯義突變(A>G)，突變后甘氨酸變?yōu)榫彼醄10]，導致編碼蛋白質的三級結構出現折疊角度的變化和新的α-螺旋結構。這可能會影響細胞表面受體對支氣管擴張藥物的治療反應。研究發(fā)現，rs1042713位點突變后對支氣管舒張試驗、長效β受體激動劑的反應變差[11]。王冰潔等[12]研究結果表明基因型AA對哮喘的發(fā)生具有預測性。KARIMI L等[13]認為rs1042713位點突變與患兒哮喘加重有關，同時還增加經糖皮質激素和長效β受體激動劑常規(guī)治療后哮喘加重的風險，基因型AA可能是重度哮喘的預測因子。葉冬梅等[14]發(fā)現突變后的患兒發(fā)生肺功能異常的風險增高。但突變體是否會影響肺功能還需進一步研究。

IgE高親和力受體(FCER1)為多鏈免疫識別受體，由1條α鏈、1條β鏈和2條γ鏈組成。FCER1在抗原提呈部位形成局部放大作用，增強肥大細胞[1]、嗜堿性粒細胞釋放炎癥介質，可延長IgE的半衰期，上調IgE介導的炎癥反應。FCER1B位于11號染色體q13段，又稱跨膜結構域4亞家族A成員2(MS4A2)，編碼IgE高親和力受體的β鏈[15]。rs569108位點位于免疫受體酪氨酸激活序列附近，突變后(A>G)，導致β鏈末端的237位氨基酸極性發(fā)生變化。由酸性負電親水的谷氨酸變?yōu)榉菢O性疏水的甘氨酸，影響了受體與IgE的結合，促使哮喘的發(fā)生[16]。rs1441586位于靠近5′端的活化T細胞核因子的啟動子區(qū)域內，基因T可顯著提高轉錄效率，其多態(tài)性可直接調控基因的轉錄。研究發(fā)現，rs569108位點多態(tài)性與兒童哮喘發(fā)病、嚴重程度有關，攜帶等位基因G的哮喘發(fā)病率較野生純合子AA升高約1.5倍，其等位基因G可能是加重小兒喘息性疾病的危險因素[17]。YANG H J等[18]進行Meta分析認為，rs1441586位點與亞洲人的哮喘發(fā)病存在關聯(lián)，且發(fā)現突變(T>C)后rs1441586通過上調啟動子活性，增加IgE高親和力受體β鏈的表達。等位基因T可調控外周嗜堿性粒細胞，使其表達的IgE高親和力受體數量和轉錄活性降低。所以等位基因T被認為是兒童哮喘的保護性因素。

白細胞介素4的受體(IL-4R)由16號染色體的p11.2-12.1段編碼，是多鏈復合型受體。IL-4R分為IL-4RA、IL-2RG/CD132/IL-2γc鏈組成的Ⅰ型受體和IL-4RA、IL-13RA1組成的Ⅱ型受體[19]。Ⅰ型受體主要介導JAK1和JAK3信號通路，Ⅱ型主要介導JAK1和JAK2信號通路[20]。目前發(fā)現，IL-4R與兒童過敏性濕疹的發(fā)病相關[21]，且已有24個IL-4R多態(tài)性位點與哮喘相關。當鳥嘌呤替代了腺嘌呤(A>G)后，位于第五外顯子rs1805010的異亮氨酸變?yōu)榱死i氨酸，第12外顯子rs1801275的谷氨酰胺變?yōu)榱司彼?。影響信號轉導轉錄激活蛋白6(STAT6)與蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP-1)結合導致IL-4R與IL-4結合能力增強，增高了哮喘發(fā)病的風險。蘇保寧[22]研究發(fā)現，rs1801275位點多態(tài)性與兒童哮喘易感性相關。A-M H等[23]研究發(fā)現兩位點基因座為AA或AG時，體內分泌型IL-4受體(sIL-4R)數目雖高于正常兒童，但哮喘發(fā)病程度較輕。鄭莎莎等[24]發(fā)現貴陽地區(qū)兒童中rs1801275、rs1805010位點基因座是等位基因G時，哮喘的發(fā)病風險分別增加了4.1倍和1.9倍。

本研究選取漢族9位點預測模型中的5位點進行多態(tài)性驗證。結果顯示所選位點均符合Hardy-Weinberg遺傳定律。ADRB2 rs1042713、FCER1B rs56-9108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010位點檢測出AA、AG、GG基因型，FCER1B rs1441586檢測出CC、CT、TT基因型。這與漢族兒童9位點預測模型中的基因型一致。哮喘組中ADRB2 rs1042713、IL-4R rs1801275位點的基因型AA、等位基因A高于健康組。FCER1B rs1441586、FCER1B rs569108、IL-4R rs1805010位點的基因型及等位基因頻率在兩組之間差異無統(tǒng)計學意義。這與漢族9位點預測模型研究結果不一致。廣義多因子降維分析后發(fā)現，FCER1B rs1441586、IL-4R rs1801275組成模型可為臨床預測哮喘的發(fā)病提供依據。IL-4R rs1801275為主效應的模型，其預測模型準確度為60.00%、靈敏度為72.00%、特異度為48.00%。表明FCER1B rs569108、FCER1B rs1441586、IL-4R rs1805010可能不是廣西兒童哮喘預測模型的有效位點，但后續(xù)模型優(yōu)化時仍需排除位點的交互作用。為提高模型篩選位點的準確性，進行了5位點兩兩協(xié)同比較。本研究發(fā)現，ADRB2 rs1042713位點AA基因型有較高的哮喘發(fā)病風險。當ADRB2 rs1042713位點AA基因型與FCER1B rs569108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010位點非GG基因型分別組合時，哮喘發(fā)病風險比ADRB2非AA組合增高約2.3倍。ADRB2 rs1042-713位點非AA基因型與FCER1B rs569108、IL-4R rs1801275、IL-4R rs1805010位點任何基因型組合，均不增加哮喘患病風險。其余位點間未發(fā)現存在協(xié)同作用。

隨著漢族兒童哮喘易感基因預測模型的不斷完善，旨希望通過對漢族哮喘模型的借鑒與優(yōu)化，擴大其適用范圍并建立壯族兒童哮喘易感基因模型。本研究結果與現有國內外研究的結果差異的可能原因：①不同地域、不同民族基因多態(tài)性的差異；②所選基因與其他基因位點或信號轉導通路存在相互作用，但尚未闡明；③由于地理位置、海拔、溫度等因素造成的基因多態(tài)性不同。本研究的不足與展望：①所選位點有限，并未完全闡明基因、位點間的相互作用，需要更大的樣本量對已有結果進行論證；②位點排除后，未引入其他易感位點進行優(yōu)化，需要引入更多位點對模型進行優(yōu)化；③健康對照組患兒未能完全排除哮喘發(fā)病可能，易造成結果偏移；④需要與患兒發(fā)病嚴重程度、肺功能、用藥改善、預后等情況相結合，完善預測模型的相關指標。

4 結論

ADRB2 rs1042713、IL-4R rs1801275位點可能與廣西壯族兒童哮喘發(fā)病相關，FCER1B rs1441586、FCER1B rs569108、IL-4R rs1805010位點可能不是廣西壯族兒童哮喘發(fā)病的危險因素；FCER1B rs1441586、IL-4R rs1801275組成模型可為臨床兒童預測哮喘的發(fā)病提供依據，但模型仍需進一步完善。