轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析急、慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞基因變化

鐘麗梅，韋武均，黃晶晶，胡仁統(tǒng)，林成，黎作茶，韋家柱，陳曉昊，周律

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，廣西 百色533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)診斷研究中心，廣西 百色 533000；3. 廣西肝膽疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣西 百色 533000；4. 廣西百色市婦幼保健院保健科，廣西 百色 533000；5. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，廣西 百色 533000)

乙型肝炎(hepatitis B)是由乙型肝炎病毒(hepatitis bvirus，HBV)感染所致臨床常見(jiàn)的傳染性疾病。如果治療不及時(shí)，可演變成肝衰竭、肝硬化、肝細(xì)胞癌等終末期肝病[1]。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)[2-4]，全球約有2.4億人感染HBV，每年全球死亡人數(shù)高達(dá)100萬(wàn)。中亞和東亞是HBV高發(fā)地區(qū)，我國(guó)形勢(shì)尤為嚴(yán)峻，成年HBV攜帶者超過(guò)8 000萬(wàn)。急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎均為臨床常見(jiàn)的病毒性肝炎，與免疫系統(tǒng)在試圖清除病毒的過(guò)程中對(duì)肝細(xì)胞產(chǎn)生的攻擊有關(guān)，活化的T細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)度免疫反應(yīng)。而急、慢性乙型肝炎患者的單個(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)差異尚不清楚。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是通過(guò)提取樣本RNA，通過(guò)打斷并測(cè)序的方式，高通量地檢測(cè)每個(gè)基因的表達(dá)豐度，并可以通過(guò)生物信息學(xué)，對(duì)差異基因進(jìn)行分析，從而得到差異的功能與通路[5]。本研究收集急性乙型肝炎(acute hepatitis B，AHB)和慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的外周血樣本，比較單個(gè)核細(xì)胞基因表達(dá)差異，以此探討急、慢性肝炎單個(gè)核基因的基因表達(dá)譜差異，為臨床急、慢性肝炎的診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年6月至2020年8月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診，使用EDTA抗凝采血管采集的AHB 3例和CHB 3例的外周血。AHB診斷標(biāo)準(zhǔn)：既往無(wú)乙型肝炎病史或HBsAg陽(yáng)性記錄，現(xiàn)1個(gè)月內(nèi)檢查HBsAg和HBVDNA為陽(yáng)性者。CHB診斷標(biāo)準(zhǔn)：既往有乙型肝炎病史或HBsAg陽(yáng)性超過(guò)6個(gè)月，現(xiàn)HBsAg和HBVDNA仍為陽(yáng)性者。2組臨床特征資料見(jiàn)表1，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，兩組性別、年齡、HbsAg與HBVDNA差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

表1 兩組臨床特征資料

1.2 單個(gè)核細(xì)胞分離 新鮮全血加入等體積PBS，上下顛倒充分混勻；適量加入淋巴細(xì)胞分離液(solarbio)，20 ℃，3 000 g離心30 min；分離已靜置分層的白細(xì)胞層，20倍體積的Trizol試劑加入白細(xì)胞中，反復(fù)抽打混合液直至整個(gè)溶液呈現(xiàn)清亮不黏稠的狀態(tài)，-80 ℃保存。

1.3 RNA提取與測(cè)序 使用Trizol(Invitrogen)提取總RNA。使用Agilent 2100分析儀(Agilent Technologies)檢測(cè)RNA質(zhì)量，并用無(wú)RNase瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢查。質(zhì)檢合格的總RNA去除核糖體RNA以保留mRNA。使用片段緩沖液將富集的mRNA片段化，使用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA。加入DNA聚合酶Ⅰ，dNTP(用dUTP代替dTTP)RNase H和緩沖液合成第二鏈cDNA，QiaQuick PCR試劑盒(Qiagen)將cDNA片段純化，添加poly(A)進(jìn)行末端修復(fù)，并連接至Illumina測(cè)序接頭。接著使用UNG(尿嘧啶-N-糖基化酶)消化第二鏈cDNA。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳選擇消化產(chǎn)物的大小，PCR擴(kuò)增，使用Illumina HiSeqTM 4000測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析 將測(cè)序結(jié)果剔除接頭、核糖體RNA與低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，利用軟件Stringtie(1.3.4版)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的重建，該軟件與HISAT2 (2.1.0版本)一起鑒定出已知mRNA和新mRNA。通過(guò)cuffdiff(https：//cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/cuffd-iff/index.html)和FPKM(每百萬(wàn)個(gè)映射讀取的轉(zhuǎn)錄本每千堿基片段中的片段)讀數(shù)對(duì)篩選出的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了定量分析。采用FDR<0.05且|log2FC|>1兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)篩選兩組樣本的差異表達(dá)基因。對(duì)差異基因進(jìn)行GO(gene ontology，基因本體論)功能與KEGG(京都基因與基因組百科全書(shū))信號(hào)通路聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選 以P<0.05和│fold change│>2作為標(biāo)準(zhǔn)，AHB組和CHB組樣本相比共篩選出725個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)的基因有372個(gè)，下調(diào)的有353個(gè)。差異基因熱圖，見(jiàn)圖1。表達(dá)量上調(diào)最多的5個(gè)基因依次為：TOMM20L、SPANXN5、HTR3A、PIK3CG和HSD3B1；表達(dá)量下降最多的5個(gè)基因依次為：CD36、AP000295.1、UGT1A5、UTS2B和CEACAM21，見(jiàn)表1。

圖1 差異基因熱圖

表2 差異上調(diào)或下調(diào)的基因(前5個(gè))

2.2 差異基因GO功能分析 經(jīng)過(guò)GO富集分析，AHB患者、CHB患者差異基因主要集中在生物學(xué)過(guò)程(18個(gè))和細(xì)胞組分(2個(gè))方面，而在分子功能方面無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖2。按基因數(shù)多少進(jìn)行排序，生物學(xué)過(guò)程前5個(gè)功能分別是：微管發(fā)生功能(tube development，GO：0035295)、內(nèi)源性刺激反應(yīng)功能(response to endogenous stimulus，GO：0009719)、組織發(fā)生功能(tissue development，GO：0009888)、細(xì)胞增殖調(diào)控功能(regulation of cell proliferation，GO：0042127)與細(xì)胞增殖功能(cell proliferation，GO：0008283)；兩個(gè)細(xì)胞組分功能為細(xì)胞外區(qū)域功能(extracellular region part，GO：0044421)和(extracellular region，GO：0005576)。

2.3 差異基因KEGG信號(hào)通路富集 差異mRNA主要富集的KEGG信號(hào)通路，按q value進(jìn)行排序，前5個(gè)信號(hào)通路分別是：PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、硫胺素代謝通路(thiamine metabolism)、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)(transcriptional misregulation in cancers)和IL-17信號(hào)通路(IL-17 signaling pathway)，見(jiàn)圖3。

圖2 差異基因GO功能聚類(lèi)圖

圖3 差異基因KEGG信號(hào)通路聚類(lèi)圖

3 討論

AHB、CHB的發(fā)病都是由于免疫系統(tǒng)清除或試圖清除病毒過(guò)程中對(duì)肝細(xì)胞的攻擊造成的，然而AHB和CHB存在著明顯的流行病學(xué)和組織病理學(xué)差異。AHB發(fā)病時(shí)，雖然肝臟損傷指標(biāo)大幅升高，但病毒往往已經(jīng)被大部分清除；而CHB發(fā)病時(shí)，除肝損傷外，還伴隨著高滴度的病毒[6-7]。預(yù)示著AHB和CHB可能存在明顯的基因表達(dá)差異。本研究收集AHB和CHB患者的外周血樣本，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AHB組和CHB組共有725個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)的有372個(gè)，下調(diào)的有353個(gè)。表達(dá)量上調(diào)最多的5個(gè)基因依次為：TOMM20L、SPANXN5、HTR3A、PIK3CG和HSD3B1；表達(dá)量下降最多的5個(gè)基因依次為：CD36、AP000295.1、UGT1A5、UTS2B和CEACAM。

在表達(dá)上調(diào)的基因中，TOMM20L基因在重度抑郁癥中高表達(dá)[8]。五羥色胺受體HTR3A則被多篇報(bào)道證實(shí)與精神分裂、抑郁癥、酒精成癮、肺癌等多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[9-11]，PIK3CG則在動(dòng)脈粥樣硬化和胃癌組織中表達(dá)異常，是前列腺癌和乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)[12-13]。而HSD3B1基因則與前列腺癌和高血壓相關(guān)[14-15]。而本研究證實(shí)這些基因在A(yíng)HB中高表達(dá)，提示其高表達(dá)可能與AHB相關(guān)，而通過(guò)反基因鎖核酸等方式進(jìn)行關(guān)鍵上調(diào)基因的沉默，可能可以抑制HBV相關(guān)疾病進(jìn)展[16]。在表達(dá)下降的基因中，脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36參與了某些病毒的復(fù)制、組裝、儲(chǔ)存和分泌，如丙型肝炎病毒(HCV)和人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)，然而，CD36與HBV生命周期的關(guān)系尚不清楚[17-18]。本研究中，CD36在A(yíng)HB中表達(dá)下調(diào)，可能與HBV病毒復(fù)制相關(guān)。CEACAM蛋白是一種黏附在細(xì)胞膜表面的跨膜糖蛋白分子，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的間緊密連接表達(dá)影響著惡性腫瘤的分化和侵襲[19-20]。

本研究中，通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析，發(fā)現(xiàn)差異基因主要富集的GO功能在微管發(fā)生功能、內(nèi)源性刺激反應(yīng)功能、組織發(fā)生功能、細(xì)胞增殖調(diào)控功能與細(xì)胞增殖功能和細(xì)胞外區(qū)域功能。差異基因主要富集的KEGG信號(hào)通路在PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、硫胺素代謝通路、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)和IL-17信號(hào)通路，其中PI3K-Akt和IL-17信號(hào)通路在乙型肝炎中起到重要作用[21-22]，其將是后續(xù)研究的重點(diǎn)。第二代測(cè)序結(jié)果顯示，血漿中HBV Pre-S2缺失(第1～54位核苷酸)的肝癌患者，手術(shù)切除后容易復(fù)發(fā)[23]，HBV患者腸道菌群的α多態(tài)性略有增加，共47株菌株具有潛在的生物標(biāo)志物功能[24]，深度測(cè)序顯示了HBV可發(fā)展成肝癌[25]。本研究也存在不足之處：①對(duì)于芯片測(cè)序差異基因表達(dá)，需要進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本，并進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，并根據(jù)臨床生理病理與差異基因表達(dá)統(tǒng)計(jì)，分析差異基因的臨床意義；②針對(duì)差異基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)或沉默載體轉(zhuǎn)染，驗(yàn)證其功能與機(jī)制；③研究表明，丙肝、酒精肝等肝病會(huì)干擾乙肝相關(guān)疾病的診斷[26-27]，本研究中未設(shè)置相關(guān)對(duì)照組進(jìn)行排除，后期擴(kuò)大樣本驗(yàn)證會(huì)設(shè)置丙肝、酒精肝、正常人等對(duì)照組進(jìn)行參照研究；④針對(duì)發(fā)現(xiàn)的差異功能與通路，需要進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明其與AHB或CHB的關(guān)系，或設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的抑制劑探討用于治療的可能。

總之，本研究提供了AHB和CHB患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中差異基因表達(dá)變化的一般情況與可能調(diào)控功能和通路，篩選出的差異基因和相關(guān)信號(hào)通路在A(yíng)HB和CHB的疾病進(jìn)展中起到重要作用，本課題組將在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行深入探討，有助于闡明乙型肝炎的潛在機(jī)制。