顯著縮短高爾基-考克斯染色時程的一種可靠改進(jìn)方法

陸海善，岑麗蘭，2，黃永秩，周欣鴻，2，顧倩，2，安苗苗，2，楊茜，2，3

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床病理科，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷與研究中心，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，廣西 百色 533000)

Golgi-Cox法是通過重鉻酸鉀和硝酸銀浸潤神經(jīng)元的經(jīng)典染色技術(shù)[1]。與大多數(shù)組織樣本采用甲醛固定染色不同，這種染色方法可用于研究動物和人死后腦中神經(jīng)元的形態(tài)改變并對其進(jìn)行定性定量分析[2]，這一特征對于神經(jīng)病理學(xué)領(lǐng)域的研究至關(guān)重要。Golgi-Cox法幫助人們最大限度地挖掘神經(jīng)元更大的功能，并將神經(jīng)元樹突和樹突棘形態(tài)可視化，如樹突長度和分支形態(tài)，樹突棘的數(shù)量、形狀和大小[3]。該方法的缺點(diǎn)是染色時間長，特異性、重復(fù)性差以及成功率低[4-6]。雖然很多研究者試著去改良這個技術(shù)，試圖得到更好的染色結(jié)果，但其仍然存在太多不確定性。目前FD Rapid GolgiStainTMKit是對Golgi-Cox法進(jìn)行改良后用于神經(jīng)元形態(tài)學(xué)分析的高爾基體浸漬方法，但染色時間仍持續(xù)在14～21 d[2]。該方法本身復(fù)雜，需要昂貴的試劑和耗時的步驟，很大程度上阻礙了技術(shù)的推廣。本次試驗(yàn)的目的是尋找一種耗時更少，染色效果更好的方法，使缺乏組織染色經(jīng)驗(yàn)的研究人員能夠獲得可重復(fù)性和高質(zhì)量的結(jié)果。該改良方法可以使研究人員在短時間內(nèi)處理大量的腦組織樣本。因此，本課題組希望通過本次研究得到一種簡便的改良方法，在短時間內(nèi)獲得始終如一的染色結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)選用7～8周雄性C57BL/6J小鼠，小鼠購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2019-0011]，所有小鼠均被飼養(yǎng)在右江民族醫(yī)學(xué)院SPF級動物實(shí)驗(yàn)中心(每籠6只)。動物飼養(yǎng)條件：小鼠在恒溫[(24±2) ℃]和濕度(55%～70%)條件下以12 h的明/暗周期單籠飼養(yǎng)，避噪聲，24 h提供充足的食物和水。所有程序均經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合“實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)使用指南”的要求。

1.1.2 主要試劑和設(shè)備 包埋劑OCT(德國萊卡儀器有限公司，型號：mTcod3XH)，F(xiàn)D Rapid GolgiStainTMKit(美國FD Neuro Technologies，lnc.型號：PK401A)，明膠載玻片(美國FD Neuro Technologies，lnc.型號：PO101)。CM1950型冰凍切片機(jī)(德國徠卡儀器有限公司)，數(shù)字切片掃描儀MIDI(3DISTECH公司，型號：Pannoramic MIDI)。

1.2 方法

1.2.1 取材方式 取4只C57BL/6J雄性小鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.06 mL/10 g)常規(guī)麻醉，室溫下心臟灌注生理鹽水40 mL后再灌注4%多聚甲醛(PFA) 40 mL，固定完全后立刻斷頭，小心剝離出完整的腦組織后繼續(xù)浸泡于4%PFA 24 h，放入含30%蔗糖的PBS液中脫水。在-80 ℃冰箱下冰凍后轉(zhuǎn)入低溫恒溫器中進(jìn)行切片。按FD Rapid GolgiStainTMKit進(jìn)行高爾基染色。

另取3只C57BL/6J雄性小鼠根據(jù)FD Rapid GolgiStainTMKit的說明書指導(dǎo)取材。組織塊(樣本)的厚度和大小影響高爾基染色效果[7-8]，為了避免這一實(shí)驗(yàn)誤差，小心剝離出完整的腦組織后用預(yù)冷的1x PBS清除表面血液，進(jìn)行2次冠狀面和1個矢狀面切割，得到3個大小相同的10 mm區(qū)塊，見圖1。將組織塊放入提前24 h配制的FD Rapid GolgiStainTMKit A+B混合液(1∶1)中，每個組織塊被放置在單獨(dú)標(biāo)記好的管中，25 ℃避光浸泡21 d，第2天更換新鮮的混合液?；旌弦旱捏w積是腦組織體積的5倍(試劑盒說明書推薦)，轉(zhuǎn)至C溶液室溫下避光浸泡，至少72 h(最多1周)，浸泡C液24 h內(nèi)至少更換一次溶液，同樣條件下切片染色。

注：A1和A2為體積相等的腦組織塊。圖1 小鼠完整腦組織

1.2.2 浸泡時間和浸泡溫度 提高溫度有助于縮短高爾基染色浸泡時間并得到理想的神經(jīng)元染色效果[9]。在此前提下，37 ℃是縮短高爾基染色時間的理想溫度[7]。取15只C57BL / 6J雄性小鼠進(jìn)行常規(guī)麻醉后按圖1所示取材，放入提前配制的FD Rapid GolgiStainTMKit A+B混合液中，保證每只小鼠的腦組織塊(A1、A2)在25 ℃和37 ℃高爾基染色混合液中浸泡12 h、24 h、48 h、72 h、1周。

1.2.3 制片準(zhǔn)備 吸干腦組織表面的水分，將腦組織在-35 ℃冰凍切片機(jī)中快速冷凍，添加適量包埋劑OCT(萊卡)于腦組織周圍，待冰凍后進(jìn)行切片。為了保持最好的細(xì)胞形態(tài)，防止腦組織受到冰晶損壞，將組織在-22 ℃低溫恒溫器中進(jìn)行切片，厚度為100 μm。將切好的切片貼到事先涂上C液的明膠玻片上，用濾紙吸干玻片表面水分，室溫避光風(fēng)干待染色。

1.2.4 染色和封片 玻片干燥后，用雙蒸水沖洗玻片2次，每次2 min。轉(zhuǎn)移至由D∶E∶雙蒸水=1∶1∶2比例配置的混合液中10 min。移入雙蒸水沖洗2次，每次4 min(雙蒸水經(jīng)常更換)，使用50%、75%和95%的乙醇梯度脫水，每次4 min。在無水乙醇中脫水4次，每次4 min。二甲苯透明3次，每次4 min，中性樹膠封片。顯微鏡下進(jìn)行采圖。

2 結(jié)果

2.1 浸泡前進(jìn)行組織的固定不利于Golgi-Cox染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先用4%PFA固定后進(jìn)行組織高爾基染色和按試劑盒說明書取材后染色，均可觀察到純凈、一致的背景：低、高倍鏡下，背景干凈呈淡黃色。從按試劑盒說明書取材及染色得到的圖片可看到皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞染色密度高，高倍鏡下可較清晰分辨出神經(jīng)元細(xì)胞和豐富完整的樹突棘，而用4%PFA固定組織后染色大多數(shù)腦區(qū)樹突輪廓未被完全染色，見圖2。

2.2 高爾基Golgi-Cox染色浸漬溫度不同對神經(jīng)元染色的影響結(jié)果 比較腦組織塊在兩種溫度下浸泡高爾基試劑盒A+B混合液12 h、24 h、48 h、72 h、7 d后切片染色結(jié)果。浸泡于25 ℃ 12 h和24 h的切片在染色過程中出現(xiàn)掉片現(xiàn)象，因此省略在25 ℃和37 ℃浸泡12 h和24 h的染色結(jié)果對比。在37 ℃浸泡48 h后，神經(jīng)元染色明顯，主要分布于切片的皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)，皮質(zhì)下區(qū)神經(jīng)染色不完全。浸泡在25 ℃的腦組織塊切片，皮質(zhì)區(qū)、皮質(zhì)下區(qū)、海馬神經(jīng)元不完全染色或可忽略。切片在37 ℃浸泡72 h，皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)可

注：A、B分別為4%PFA心臟灌注固定后和 染色后的組織；C、D分別為新鮮組織。圖2 腦組織及染色結(jié)果(4×，20×)

見大量明顯黑色填充(神經(jīng)元)，皮質(zhì)和皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)均可見染色良好的神經(jīng)元。浸泡在25 ℃ 72 h的腦組織塊皮質(zhì)區(qū)、皮質(zhì)下區(qū)、海馬區(qū)無法被分辨出完整的神經(jīng)元、樹突及樹突棘的形態(tài)，該溫度下腦組織塊染色效果不佳或可忽略。腦組織塊在37 ℃浸泡7 d，幾乎所有區(qū)域的神經(jīng)元都被完全染色，這些結(jié)果均勻地分布在整個切片上，并且在所有組實(shí)驗(yàn)中都是一致的。而在25 ℃的腦組織浸泡7 d的切片效果仍不理想。見圖3。

圖3 不同時間及不同溫度下新鮮腦組織按FD Rapid GolgiStainTM Kit取材后的染色結(jié)果(4×)

2.3 37 ℃是縮短高爾基染色的理想溫度 按高爾基染色試劑盒提示的方法取材，在37 ℃下浸泡腦組織12 h、24 h、48 h、72 h、1周。12 h的切片未見染色現(xiàn)象，高低倍鏡下均見腦片褶皺，與玻片不貼合，內(nèi)有氣泡，染色時容易掉片。24 h切片平整緊貼玻片，低倍鏡下可觀察到不均勻染色的細(xì)胞，高倍鏡下可見神經(jīng)元胞體、樹突棘開始被染色。在48 h皮質(zhì)和皮質(zhì)下區(qū)域盡管神經(jīng)元染色逐漸明顯，仍未達(dá)到神經(jīng)元的完全染色。將浸泡時間延長至7 d，腦片皮質(zhì)、海馬各區(qū)可見到更加黑密的染色，神經(jīng)元數(shù)量較多，高倍鏡下樹突、樹突棘清晰可見，見圖4。

圖4 不同時間、相同溫度下新鮮腦組織按FD Rapid GolgiStainTM Kit取材后于37 ℃下浸泡不同時間的染色結(jié)果(4×，60×)

3 討論

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)最基本的結(jié)構(gòu)和功能單位，可分為胞體和突起兩部分，突起是神經(jīng)元胞體的延伸部位，從形態(tài)和結(jié)構(gòu)可分為樹突和軸突[10]。樹突表面可見許多棘狀突起，長約0.5～1.0 μm，粗約0.5～2.0μm，稱樹突棘(dendritic spine)[11]。樹突棘是大腦興奮性突觸輸入的主要接受者，它的形態(tài)學(xué)為正在進(jìn)行的突觸傳遞的功能狀態(tài)提供了重要信息[12-13]。樹突棘有很多種類型，常見的類型為絲狀偽足型、長條型、短而粗硬型(不成熟類型)、蘑菇型、分枝棘型(成熟樹突棘)[3]。成熟樹突棘含有豐富的神經(jīng)遞質(zhì)受體，以維持高水平的突觸活動[3，14]。樹突棘成熟過程中的變化會導(dǎo)致神經(jīng)元回路功能的改變。對樹突棘進(jìn)行有效的量化和分類，有助于精確地對神經(jīng)元進(jìn)行分析，這在衰老以及神經(jīng)元退化和再生過程的研究中具有重要價值，也是發(fā)育神經(jīng)生物學(xué)和翻譯神經(jīng)生物學(xué)廣泛關(guān)注的問題。而用于樹突棘的可視化和識別最突出的方法是Golgi-Cox染色法[2]。但目前神經(jīng)高爾基染色的機(jī)制尚不完全清楚，而且其染色時間過長及一致性和重復(fù)性差阻礙其被廣泛利用。

研究提示，用4% PFA心臟灌注后的腦組織可以減少細(xì)胞損傷并保持細(xì)胞形態(tài)[15]，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的染色[16]?；诖嘶A(chǔ)，本課題組對比了4% PFA心臟灌注后固定的腦組織進(jìn)行高爾基染色和新鮮組織按FD Rapid GolgiStainTMKit混合液浸泡后染色的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用4% PFA進(jìn)行心臟灌注處理后的腦組織，神經(jīng)元染色效果不佳，皮質(zhì)及皮質(zhì)下區(qū)域未充分染色，樹突及樹突棘形態(tài)不清，無法進(jìn)行分析。在新鮮組織上進(jìn)行染色時，神經(jīng)元、樹突及樹突棘均被染色。然而，染色差異背后的具體機(jī)制仍不清楚。

本課題組比較腦組織塊在25 ℃和37 ℃下高爾基染色液浸泡12 h、24 h、48 h、72 h、7 d。雖然使用的明膠玻片可以防止腦切片的脫落[17]，但浸泡于25 ℃ 12 h和24 h的切片在染色過程中出現(xiàn)掉片現(xiàn)象，可能原因如下：腦組織脂肪和含水量多，并且浸泡溫度低、時間短，金屬離子沒有完全浸潤組織，腦切片沒有很好脫水，與玻片貼合差，導(dǎo)致染色過程易掉片。在25 ℃下浸泡(浸泡時間：48 h、72 h、7 d)的切片染色結(jié)果顯示：大腦皮質(zhì)及海馬均未顯示明顯染色，或染色結(jié)果可忽略。而在37 ℃浸泡48 h、72 h、7 d腦片的皮質(zhì)區(qū)及皮質(zhì)下區(qū)域較25 ℃浸泡下的腦片染色更均勻、清晰，浸泡72 h足以在整個大腦和較小的腦塊中進(jìn)行皮質(zhì)染色[16]，而37 ℃浸泡7 d，皮質(zhì)下區(qū)域(海馬區(qū))完全被染色。所以37 ℃溫度下浸泡組織可以在縮短時間下提高染色效果?？s短高爾基染色時間的最理想溫度是37 ℃，這個與之前的研究結(jié)果一致[7]。這種有效染色的一個可能原因是高溫下浸泡，Golgi-Cox法溶液中金屬分子的移動速度更快，動能更強(qiáng)，更有利于在較短的時間內(nèi)浸潤組織，增加染色，顯示樹突形態(tài)、棘突數(shù)量。

但目前使用Golgi-Cox方法改善神經(jīng)元染色的機(jī)制尚未完全清楚，內(nèi)在或外在因素都可以影響染色效果。以往的高爾基染色法都用于切片機(jī)切片，很少用于振動切片和冷凍切片[17]。目前有幾種商用高爾基染色試劑盒可用于切片機(jī)切片、振動切片和冷凍切片[18]，本實(shí)驗(yàn)采用冷凍切片機(jī)切片。但不同的切片方法是否會影響染色效果尚不清楚。據(jù)報(bào)道，浸泡染色溶液的pH值也是其中的關(guān)鍵因素[16]，腦切片上的殘余血液可能會干擾染色效果[19]。然而影響高爾基染色的因素可能需要進(jìn)一步探索。

本研究中描述的改良高爾基染色方案對比以往的優(yōu)勢如下：①它可以在半腦上操作，允許對剩余半腦進(jìn)行額外分析，并減少動物數(shù)量的使用；②改變溫度來探索縮短高爾基染色的時間，也能得到可靠和一致的染色效果。