AP患者血清HMGB1和NO對病情評估價值及相關(guān)性研究

周青宏，覃宗帥，鄭頻，王語陽，岑蘭英，蘇拾香，黃秀權(quán)，覃月秋

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)具有急性起病和疾病過程多變的臨床特點，多數(shù)AP患者病情較輕，僅有胰腺實質(zhì)的局灶性炎癥，病程自限，恢復(fù)快，預(yù)后好；20%的AP患者進展為重癥急性胰腺炎(SAP)[1]。在炎癥過程中，由壞死或非致死性損傷細(xì)胞釋放到細(xì)胞質(zhì)中的血清高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)充當(dāng)促炎細(xì)胞因子不斷浸潤細(xì)胞，導(dǎo)致炎性細(xì)胞釋放各種介質(zhì)，如一氧化氮(nitric oxide，NO)。大量AP的臨床試驗和動物模型結(jié)果表明[2-3]，包括HMGB1、NO在內(nèi)的局部和全身炎癥介質(zhì)之間存在復(fù)雜的相互作用。HMGB1是一種在真核生物中普遍存在的、多功能的、與DNA結(jié)合的非組蛋白，廣泛分布于多種哺乳動物細(xì)胞。在大多數(shù)細(xì)胞中，HMGB1位于細(xì)胞核，其參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、DNA修復(fù)和核小體形成等過程，這些過程對于維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)細(xì)胞功能具有重要作用[4]。 HMGB1一旦由細(xì)胞核進入細(xì)胞質(zhì)，就會產(chǎn)生多種炎癥反應(yīng)，并可以主動釋放到細(xì)胞外空間和循環(huán)中。HMGB1已經(jīng)被證實在AP中高表達，與胰腺腺泡細(xì)胞損傷及病情發(fā)展密切相關(guān)[5]。NO是一種氣態(tài)的神經(jīng)遞質(zhì)，是具有高度活性的自由基，由L-精氨酸在一氧化氮合酶(nitic oxide synthase，NOS)同工酶催化作用下產(chǎn)生[6]。NO是血管擴張劑和旁分泌調(diào)節(jié)劑，它具有復(fù)雜的生物作用，可作為抗炎介質(zhì)參與炎癥過程，濃度過高時可產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，對機體造成損害。在胰腺中，NO可調(diào)節(jié)胰腺外分泌、內(nèi)分泌胰島素的分泌和胰腺微血管血流[7]。AP中的NO明顯升高，其促進炎癥因子的產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)，并增加了疼痛因子的表達。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1促使胰腺腺泡細(xì)胞NO生成增多，而NO致腺泡細(xì)胞損傷，HMGB1和NO的關(guān)系有待進一步闡明[2]。本文采用ELISA、分光光度法檢測HMGB1及NO水平，探討HMGB1、NO對評估AP嚴(yán)重程度、患病的敏感性和特異性，分析不同嚴(yán)重程度AP中HMGB1與NO表達的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年9月至2022年9月于右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院治療的70例AP患者資料，其中輕癥急性胰腺炎(mild acute pancreatitis，MAP)組27例，中度重癥急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis，MSAP)組21例，重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)組22例，同時選取本院同期健康體檢者32例作為對照組，4組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。AP診斷及分級標(biāo)準(zhǔn)符合《中國急性胰腺炎診治指南(2021)》[8]。入選病例均排除心腦血管疾病、肝腎疾病、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病及腫瘤等。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，受試者簽署知情同意書。

表1 4組一般資料比較結(jié)果

1.2 方法

1.2.1 收集樣本 收集患者的一般資料(年齡、性別)。采集入院24 h內(nèi)空腹靜脈血3～5 mL，室溫靜置2 h，3000 r/min，離心15 min，抽取血清放入Eppendor管中，置于-80 ℃冰箱冷凍保存待檢，做好預(yù)處理后分別測定血清中的HMGB1及NO水平。

1.2.2 HMGB1檢測 按照Human HMGB-1 ELI-SA Kit(Elabscience Biotechnology，中國，武漢)試劑盒說明書做好前期工作準(zhǔn)備并按步驟操作，用酶標(biāo)儀測定在450 nm波長處血清的OD值，HMGB1濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出血清中HMGB1的濃度，見表2。

1.2.3 NO的檢測 按照NO檢測試劑盒(Beyotime Biotechnology，中國，上海)說明書步驟操作，用分光光度法測定血清在560 nm的吸光度，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中NO的濃度，見表2。

表2 4組患者HMGB1、NO對比結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 各組HMGB1、NO水平比較結(jié)果 MAP組、MSAP組、SAP組患者血清中HMGB1、NO水平均高于對照組(P<0.01)；MSAP組的NO水平高于MAP組(P<0.001)，而HMGB1水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；SAP組的HMGB1、NO水平高于MAP及MSAP組(P<0.05)，見圖1。

注：A代表各組HMGB1水平差異；B代表各組NO水平差異。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；△P為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。圖1 各組之間HMGB1、NO水平差異比較結(jié)果

2.2 HMGB1和NO評估AP嚴(yán)重程度及患病的ROC曲線 根據(jù)ROC曲線顯示，HMGB1和NO對評估AP患病相較于評估AP嚴(yán)重程度的曲線下面積、敏感性和特異性更佳，見表3、表4、圖2A、圖2B。

表3 HMGB1和NO評估AP患病的ROC曲線數(shù)據(jù)分析結(jié)果

表4 HMGB1和NO評估AP嚴(yán)重程度的ROC曲線數(shù)據(jù)分析結(jié)果

注：A代表HMGB1和NO評估AP患病的ROC曲線；B代表HMGB1和NO對評估AP嚴(yán)重程度的ROC曲線。圖2 HMGB1、NO水平在不同程度AP中的ROC曲線分析結(jié)果

2.3 不同組別的HMGB1和NO的相關(guān)性分析結(jié)果 Spearman相關(guān)性分析顯示，在MAP組、MSAP組中，血清 HMGB1 水平與NO水平無相關(guān)性(P>0.05)，見表5及圖3A、圖3B；在SAP組中血清 HMGB1水平與NO水平具有相關(guān)性(r=0.672，P<0.001)，且呈正相關(guān)，見表5及圖3C。

表5 不同組別的HMGB1和NO表達的相關(guān)性分析數(shù)據(jù)

圖3 MAP組、MSAP組、SAP組中血清HMGB1與NO的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

HMGB1是一種染色體蛋白質(zhì)，組織分布廣泛，但多數(shù)位于細(xì)胞核。HMGB1的生理功能與其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)有關(guān)，它本身有助于DNA的合成以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，作為炎癥因子或損傷分子模式時，可以參與多條信號傳導(dǎo)，促進細(xì)胞凋亡或炎性損傷[5]。NO是一種氣態(tài)分子，其生成受到一氧化氮合酶(NOS)的催化以及精準(zhǔn)電子鏈的傳輸控制，不同濃度的NO可以在人體產(chǎn)生不同的生理作用，NO水平升高往往提示炎癥的進展。目前，關(guān)于AP中HMGB1與NO的關(guān)系尚未有明確的定論。HMGB1通過參與多種信號通路，誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致胰腺損傷，而NO是AP局部和全身炎癥的潛在關(guān)鍵介質(zhì)，特定NOS抑制劑的實驗研究支持NO是在NOS介導(dǎo)下產(chǎn)生并發(fā)揮作用[9-10]。HMGB1可以與下游受體結(jié)合，觸發(fā)NF-κB核移位并活化[1]，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中iNOS表達增加，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性增加，促使大量NO產(chǎn)生，當(dāng)NO濃度達到一定程度時，會對胰腺產(chǎn)生不可估量的損害，使得AP患者病情迅速惡化[11]。盡管HMGB1和NO已經(jīng)被證實在AP中高表達，但其臨床意義及HMGB1和NO相互作用與AP炎癥損傷之間的關(guān)系少見報道。

為了探討在AP中HMGB1與NO之間是否存在相互關(guān)系，本研究收集了不同嚴(yán)重程度的AP患者的血清，采用ELISA、分光光度法檢測血清中的HMGB1及NO水平，探討在不同嚴(yán)重程度的AP中HMGB1和NO表達水平的差異對AP患病及評估AP嚴(yán)重程度的敏感性和特異性，分析HMGB1與NO表達的相關(guān)性，闡述它們之間可能存在的相互關(guān)系。各組HMGB1和NO表達水平結(jié)果顯示，MAP組、MSAP組、SAP組患者血清中HMGB1、NO水平均顯著高于對照組，AP嚴(yán)重程度越高，HMGB1及NO的水平越高，兩者表現(xiàn)出相同的趨勢，與前人研究的結(jié)果一致[3，9]。

本課題組進一步進行ROC曲線分析，結(jié)果提示HMGB1及NO對AP患病及病情嚴(yán)重程度的評估有一定的價值。對于AP患病的評估，HMGB1的AUC為0.825，P<0.001，其敏感性及特異性分別為78.60%、87.50%，NO的AUC為0.931，P<0.001，其敏感性及特異性分別為81.40%、93.90%；對于AP嚴(yán)重程度評估，HMGB1的AUC為0.705，P<0.01，其敏感性及特異性分別為44.20%、96.30%，NO的AUC為0.867，P<0.001，其敏感性及特異性分別為95.30%、66.70%，顯然NO評估AP患病的敏感性及特異性更高，HMGB1在評估病情嚴(yán)重程度中敏感性較NO低，但特異性卻比NO高，總體來說，HMGB1和NO對評估是否患病的敏感性及特異性結(jié)果更為理想。造成這些結(jié)果的原因可能是，HMGB1作為一種具有高電泳遷移率的非組蛋白核蛋白，其生理功能和特性與它復(fù)雜的結(jié)構(gòu)有關(guān)，它是由兩個串聯(lián)的折疊螺旋DNA以及包含一串谷氨酸和天冬氨酸的酸性尾巴組成，具有較高的流動性，當(dāng)HMGB1釋放到細(xì)胞外環(huán)境中時，可以引起全身炎癥反應(yīng)[2]。NO是可以在全身廣泛分布的氣體信號分子，在AP中充當(dāng)氣體遞質(zhì)，與HMGB1相比，它具有以下特點：①分子量小，分子結(jié)構(gòu)簡單，生物功能發(fā)揮快；②它們是內(nèi)源性合成、儲存和分散在體內(nèi)的；③它們可以在不使用任何運輸載體的情況下穿梭細(xì)胞膜[6]，基于這些特性，在炎癥反應(yīng)中，NO可能比HMGB1具有更強的流動性，分布更為廣泛，因此NO在本研究的ROC曲線結(jié)果中敏感性更高，而HMGB1的結(jié)構(gòu)特性則在某些方面賦予了更高的特異性。

為了解HMGB1表達與NO表達的相互關(guān)系，本課題組進行了相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SAP組中，血清 HMGB1及NO水平較對照組、MAP組明顯升高，在SAP組中呈正相關(guān)，且相關(guān)性較強，而在MAP組、MSAP組中無明顯相關(guān)性，說明在AP中，嚴(yán)重程度越高，HMGB1對促進NO的產(chǎn)生起到一定的作用，但具體機制仍待探究。HMGB1能與多種受體相結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞炎癥、免疫、增殖、遷移、自噬、凋亡，可能使NF-κB/MAPK活化，誘導(dǎo)NOS表達增加，提高NOS活性，間接促進炎性因子NO的產(chǎn)生[6，12]。這就導(dǎo)致SAP時，NO的濃度明顯升高，其損傷作用在機體中表現(xiàn)為直接作用和間接作用。直接作用即引起難治性血管擴張，造成有效循環(huán)血容量減少，從而減少胰腺或者其他臟器血流造成缺血缺氧損傷，間接作用表現(xiàn)為大量NO與周圍的氧自由基等物質(zhì)反應(yīng)而生成活性氮氧化物(reactive nitrogen oxide species，RNOS)，再由RNOS發(fā)揮NO的間接作用[13-15]。然而，在生理情況下，一定水平的NO濃度可以起到擴張微血管、抑制血小板聚集和白細(xì)胞黏附、神經(jīng)元活動的重要介質(zhì)的生物功能，介導(dǎo)一系列免疫病理過程[3，7，11]，這可能是本研究中MAP組、MSAP組的HMGB1與NO水平無明顯相關(guān)性的原因。

綜上所述，血清HMGB1及NO的表達水平有助于判斷AP患者的嚴(yán)重程度，HMGB1可能通過正向調(diào)控NO表達參與SAP的發(fā)生發(fā)展。探討HMGB1和NO的表達水平及相互關(guān)系，可為人們認(rèn)識HMGB1及NO在AP發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色提供一個全新的視角，也可能為AP的診斷和防治提供一個新的靶點。