lncRNA AC098934通過激活p38MAPK通路增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲性

張志文，李日著，李也鵬，黃世慶

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

目前，肺癌在全球癌癥中具有較高的死亡率，且在逐年升高。現(xiàn)如今在我國，肺癌已經(jīng)成為了發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，且由于將近一半的肺癌病人因早期癥狀不明顯，在就診時(shí)診斷屬于中晚期，錯(cuò)失手術(shù)機(jī)會(huì)，其中因肺癌死亡患者占所有癌癥死亡患者的20%[1-2]。lncRNA是具有調(diào)節(jié)功能的長鏈非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本，其參與細(xì)胞多種生理病理過程。其在很大程度上與mRNA轉(zhuǎn)錄本相似：它們是由RNA聚合酶Ⅱ從基因組位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄而來，染色質(zhì)狀態(tài)類似于mRNA。lncRNA在包括染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后處理過程中起到了“主調(diào)控因子”作用，其生物學(xué)功能嚴(yán)格依賴于其在細(xì)胞的位置[3]。在細(xì)胞核中，lncRNA通常負(fù)責(zé)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾、轉(zhuǎn)錄控制以及對mRNA或 miRNA的處理；在細(xì)胞質(zhì)中，lncRNA對翻譯起控制作用，促進(jìn)或抑制mRNA的穩(wěn)定性[4]。已知重組基因和細(xì)胞表觀組在遺傳學(xué)上的改變一直是細(xì)胞非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)功能發(fā)展的重要驅(qū)動(dòng)因素，近期研究結(jié)果表明[5]，lncRNA的表達(dá)異常與NSCLC的關(guān)系密切。

現(xiàn)在一種新的lncRNA已被發(fā)現(xiàn)，它就是lncRNA AC098934，其定位于1號染色體：202、810、238-202、810、829；長度592 bp，ensembl數(shù)據(jù)庫Transcript ID：ENST00000564127.1；且在數(shù)據(jù)庫中查詢表明，lncRNA AC098934在肺癌中顯著高表達(dá)。目前有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA AC098934.2-201亞型，也被稱為AGPG與腫瘤的糖酵解相關(guān)，且提示其與食管癌相關(guān)[6-7]。遂本研究以肺癌A549、H1299及NCI-H1299細(xì)胞為研究對象，旨在探討lncRNA AC098934通過p38 MAPK通路對肺癌細(xì)胞增殖能力的影響，為肺癌分子水平的治療提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇凍存的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、H1299、NCI-H1299后，分別用含10%胎牛血清的DMEM、1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，在37 ℃飽和濕度、含5% CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)中培養(yǎng)。48 h后換液，待細(xì)胞融合接近80%時(shí)即可傳代。實(shí)驗(yàn)選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA 采用lipo3000(美國Invitrogen公司)進(jìn)行細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。消化收集處于對數(shù)生長A549、H1299細(xì)胞，以3×105個(gè)/皿的細(xì)胞密度接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(美國Coring公司)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%左右時(shí)開始轉(zhuǎn)染。使用適量opti-MEM培養(yǎng)基稀釋lipo3000、AC098934 siRNA1(si-1)、AC098934 siRNA2(si-2)、陰性對照(NC)、空載體(CON)。將稀釋后的各轉(zhuǎn)染組與lipo 3000混勻，室溫靜置20 min。用無血清培養(yǎng)基洗滌A549、H1299細(xì)胞2次，分別加入孵育好的試劑混合液，同時(shí)補(bǔ)足適量opti-MEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染lncRNA AC098934 消化收集處于對數(shù)生長A549、NCI-H1299細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Coring公司)中，3×105個(gè)/孔；37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞匯合度為50%～60%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。不含血清培養(yǎng)基稀釋AC098934片段、適量轉(zhuǎn)染試劑，將片段和轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基混合，混勻后室溫靜置20 min；棄去板中原有培養(yǎng)基，把混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中補(bǔ)足培養(yǎng)基至2 mL，轉(zhuǎn)染組于4～6 h后換含血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲

1.3.1 檢測轉(zhuǎn)染siRNA細(xì)胞的侵襲性 用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，Transwell小室(美國Coring公司)上室各加100 μL，待其凝固后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。收集按照上述分組轉(zhuǎn)染48 h后的A549、H1299細(xì)胞，胰酶(美國Genview公司)消化細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取出小室，加入500 μL無血清培養(yǎng)基，放入37 ℃培養(yǎng)箱中；吸掉已充分浸潤基底膜后的侵襲小室內(nèi)的培養(yǎng)基；加500 μL的含有10% FBS的培養(yǎng)基至下室，加300 μL已調(diào)節(jié)好細(xì)胞密度的細(xì)胞懸液(1×105個(gè))至侵襲小室內(nèi)，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h；用多聚甲醛(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)固定20 min；500 μL結(jié)晶紫(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)分別將侵襲小室浸入染色10 min；用PBS沖洗后置于空氣中干燥；100倍顯微鏡(日本Nikon公司)拍照隨機(jī)選擇5個(gè)視野，行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)各孔的穿過膜的細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 檢測轉(zhuǎn)染lncRNA AC098934細(xì)胞的侵襲性 用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，Transwell小室上室各加100 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱中待其凝固后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。收集按照上述分組轉(zhuǎn)染48 h后的A549、NCI-H1299細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取出小室，加入500 μL無血清培養(yǎng)基，放入37 ℃培養(yǎng)箱中；吸掉已充分浸潤基底膜后的侵襲小室內(nèi)的培養(yǎng)基；加500 μL的完全培養(yǎng)基至下室，加300 μL已調(diào)節(jié)好細(xì)胞密度的細(xì)胞懸液(5×104個(gè))至侵襲小室內(nèi)，并按分組添加p38MAPK通路抑制劑SB203580于AC098934過表達(dá)組，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h；用多聚甲醛固定20 min；500 μL結(jié)晶紫分別將侵襲小室浸入染色10 min；用PBS沖洗后置于空氣中干燥；100倍顯微鏡拍照，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)各孔的穿過膜的細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western Blot檢測各組細(xì)胞樣本中p38、p-p38、JNK、p-JNK、Myc、p53蛋白的表達(dá)水平 在轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞中加適量RIPA裂解液(中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，冰上反應(yīng)30 min，4 ℃離心，收集上清液。取適量上清液，BCA法檢測蛋白樣品濃度。根據(jù)蛋白樣品體積加loading buffer，混勻，100 ℃變性10 min。按照20微升/孔將變性蛋白加入至SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠和12%分離膠)，電泳結(jié)束后恒壓100 V轉(zhuǎn)PVDF膜(德國Merck Millipore公司)，加5%milk-PBST封閉膜室溫輕搖60 min。加入針對p38(Abcam；Rabbit.no.ab170099)、p-p38(Abcam；Rabbit.no.ab170099)、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK(1∶1000稀釋)的一抗(Cambridge，USA)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5次，每次6 min。轉(zhuǎn)移膜至二抗(Abcam Cambridge，USA)中，室溫孵育1 h，TBST洗膜5次，每次6 min。ECL A和B液按體積1∶1混合后均勻滴加在膜上，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。用圖像分析軟件Image J對圖像進(jìn)行分析各抗體條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 沉默lncRNA AC098934表達(dá)對A549、H1299細(xì)胞侵襲性的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染 siRNA-1和siRNA-2的A549、H1299細(xì)胞與NC組相比，轉(zhuǎn)染si-RNA后的A549、H1299細(xì)胞侵襲性降低，穿膜細(xì)胞數(shù)下降(P<0.05)。見圖1。

注：A.各組細(xì)胞鏡下穿膜情況；B.A549及H1299各組細(xì)胞穿膜數(shù)量對比。****P<0.001。圖1 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測沉默lncRNA AC098934表達(dá)對A549、H1299細(xì)胞侵襲性的影響

2.2 過表達(dá)lncRNA AC098934對A549、NCI-H1299細(xì)胞侵襲性影響及抑制p38MAPK通路后對過表達(dá)lncRNA AC098934的A549、NCI-H1299細(xì)胞侵襲性影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)lncRNA AC098934的A549、NCI-H1299細(xì)胞組(OE-AC098934)相對于NC組，過表達(dá)lncRNA AC098934的A549、NCI-H1299細(xì)胞組(OE-AC098934)侵襲性增強(qiáng)，穿膜細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)；過表達(dá)lncRNA AC098934的A549、NCI-H1299細(xì)胞組(OE-AC098934)加入p38MAPK通路抑制劑SB203580后對比，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)lncRNA AC098934的A549、NCI-H1299細(xì)胞組(OE-AC098934)在加入p38MAPK通路抑制劑后細(xì)胞侵襲性有所降低，穿膜細(xì)胞數(shù)部分下降。見圖2。

注：A.各組細(xì)胞鏡下穿膜情況；B.A549及H1299各組細(xì)胞穿膜數(shù)量對比。**P<0.01，***P<0.001。圖2 過表達(dá)lncRNA AC098934對A549、NCI-H1299細(xì)胞侵襲性影響及抑制p38MAPK 通路后對過表達(dá)lncRNA AC098934的A549、NCI-H1299細(xì)胞侵襲性影響

2.3 沉默lncRNA AC098934對A549、NCI-H1299細(xì)胞p-p38、JNK、p-JNK、Myc、p53蛋白表達(dá)的影響 灰度分析結(jié)果顯示，相對于NC組，AC098934沉默載體組中Myc、p-p38/p38、p-JNK/JNK蛋白表達(dá)增高(P<0.05)，p53蛋白降低(P<0.05)。提示，AC098934沉默后促進(jìn)p38MAPK通路激活。見圖3。

3 討論

肺癌分為兩個(gè)主要組織學(xué)類型：小細(xì)胞肺癌(占所有肺癌的15%)和NSCLC(占所有肺癌的85%)， 一直以來超聲引導(dǎo)下或CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺活檢及支氣管鏡下活檢，因其確診的有創(chuàng)性，確診肺癌往往已經(jīng)處于中晚期[8]，經(jīng)臨床治療后患者預(yù)后較差[9]。因而急需尋找早期診斷及監(jiān)測肺癌的新方法。其中作為肺癌發(fā)生率最高的NSCLC，因發(fā)現(xiàn)時(shí)間較晚，很多NSCLC患者錯(cuò)過了手術(shù)機(jī)會(huì)，化療和靶向治療成為了主要的治療方式[10]，隨著靶向治療的普遍應(yīng)用，其耐藥性的問題也逐漸浮現(xiàn)[11]。對于最近炙手可熱的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，它改變了多種癌癥的治療模式，但它并沒有對癌癥患者均能產(chǎn)生較好的效果[12]?？傮w上來說，現(xiàn)

注：A.各組細(xì)胞樣本中p38、p-p38、JNK、p-JNK、Myc、p53蛋白的表達(dá)； B.各組細(xì)胞樣本中p38、p-p38、JNK、p-JNK、Myc、p53蛋白的表達(dá)灰度分析。圖3 沉默lncRNA AC098934對A549、NCI-H1299細(xì)胞p-p38、JNK、p-JNK、Myc、p53蛋白表達(dá)的影響

在NSCLC的診斷及治療均處于困境，急需微創(chuàng)或無創(chuàng)的診斷方法及新的治療靶點(diǎn)出現(xiàn)。現(xiàn)研究[5]表明lncRNA參與肺癌發(fā)生及發(fā)展過程。

lncRNA是一類不編碼的RNA分子，長度>200 nt，可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及翻譯水平的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[13]。lncRNA在多種腫瘤中異常表達(dá)，發(fā)揮促癌或抑癌作用，參與癌細(xì)胞的多種生物學(xué)過程，如LI Y S等[14]和CHI Y J 等[15]收集資料發(fā)現(xiàn)人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)的診斷和預(yù)后意義已在多種惡性腫瘤中證實(shí)。lncRNA在結(jié)直腸癌中扮演著與其增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥相關(guān)的重要作用[16]；lncRNA在乳腺癌中有促進(jìn)或抑制乳腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移[17-18]作用，并且發(fā)現(xiàn)lncRNA與乳腺癌的免疫預(yù)后相關(guān)[19-20]，XU J等[21]發(fā)現(xiàn)其中作為乳腺癌中最為惡性的三陰乳腺癌也與lncRNA有重要相關(guān)性。lncRNA與膀胱癌(bladder cancer，BC)也有一定相關(guān)性，lncRNA RMRP可介導(dǎo)miRNA促進(jìn)BC的增殖、遷移和侵襲[22-23]，另外lncRNA PCAT6也可作為BC新的生物標(biāo)記物[24]。ABDI E等[25]評估了lncRNA與上消化道(upper gastrointestinal tract，UGI)癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，上消化道癌癥死亡率很高，lncRNA相關(guān)多態(tài)性的單個(gè)和組合基因型可以預(yù)測癌癥風(fēng)險(xiǎn)，并且在某些情況下可以預(yù)測臨床診斷和治療結(jié)果。此外，AALIJAHAN H等[26]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA與宮頸癌的增殖、轉(zhuǎn)移、預(yù)后均明顯相關(guān)。在肺癌尤其是NSCLC中l(wèi)ncRNA可能通過調(diào)控miRNA而參與肺癌發(fā)生及發(fā)展過程，這為NSCLC的早期診斷及靶向治療帶來了新的希望。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是眾多通路中研究最為廣泛的通路之一[27]，其通常在多種人類惡性腫瘤中被激活[28]，MAPK主要包括4種途徑：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated protein kinases，ERK)途徑，c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)/應(yīng)激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)途徑，ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶 1(big MAP kinase 1，BMK1)途徑和 p38MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)傳導(dǎo)途徑[29]。其中p38MAPK是一條與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號途徑，尤其在促進(jìn)或抑制多種腫瘤侵襲方面已成為近年研究熱點(diǎn)[30]。如在侵襲性惡性間皮瘤和NSCLC細(xì)胞中通過p38MAPK觸發(fā)凋亡級聯(lián)[31]；ZHANG Z等[32]研究發(fā)現(xiàn)barbaloin通過滅活p38MAPK/Cdc25B/Hsp27通路在NSCLC中起抗增殖和抗轉(zhuǎn)移作用；細(xì)胞衰老通過p38MAPK和p44/42MAPK信號傳導(dǎo)促進(jìn)皮膚癌變[33]；表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7通過p38MAPK信號通路調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)[34]；腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來源的外泌體通過調(diào)節(jié)p38MAPK信號通路和免疫檢查點(diǎn)PD-L1促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[35]。

在前面課題的研究中，課題組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)lncRNA AC098934在肺腺癌(LUAD)組織中高表達(dá)，且lncRNA AC098934在甲基轉(zhuǎn)移酶3(METTL3)誘導(dǎo)的M6A修飾下可促進(jìn)LUAD腫瘤惡性行為[36]。為研究lncRNA AC098934與NSCLC細(xì)胞侵襲性之間的聯(lián)系，本研究通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測A549和H1299細(xì)胞的轉(zhuǎn)染siRNA模型侵襲能力的變化及對A549、NCI-H1299細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后其遷移能力的變化，并通過Western Blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測p38、p-p38、JNK、p-JNK、Myc、p53蛋白在樣本中的表達(dá)。課題組在研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后的NSCLC細(xì)胞侵襲性明顯降低；而對比NC組，過表達(dá)lncRNA AC098934后的NSCLC細(xì)胞侵襲性增加，在抑制p38MAPK通路后，NSCLC細(xì)胞的侵襲性降低；抑制lncRNA AC098934表達(dá)后，NSCLC細(xì)胞Myc、p-p38/p38、p-JNK/JNK蛋白表達(dá)提高，而p53蛋白降低。因此，lncRNA AC098934通過激活p38MAPK通路產(chǎn)生促癌作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)lncRNA AC098934促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的侵襲能力，其機(jī)制可能與激活p38MAPK通路有關(guān)，這為肺癌提供了潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。