內皮素-1誘導A549細胞對Nur77表達的影響

嚴慧玲，黃玉蘭，田喆，蔣玉潔

(1. 右江民族醫(yī)學院研究生院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，廣西 百色 533000)

內皮素-1(Endothlin-1)是內皮素肽家族的主要亞型，大量存在于肺部上皮細胞、內皮細胞和炎癥細胞中，通過介導支氣管痙攣[1]、炎癥細胞招募和激活[2]、肺血管收縮和重塑[3]等過程參與到哮喘、肺動脈高壓等疾病的發(fā)病過程中。前期研究結果中發(fā)現在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的病理生理過程中升高的Endothlin-1可誘導產生全身性和肺動脈性高壓，導致直接升高毛細血管靜水壓、直接增加內皮和上皮通透性、促進炎癥細胞轉移進入肺實質、抑制肺泡液體清除，進一步研究提示核受體亞家庭4，A組，成員1(Nur77)是Endothlin-1負向上游調控因子之一[4]。然而，Nur77對靶蛋白的調節(jié)機制復雜且多變，常與靶蛋白形成反饋調控環(huán)路。Endothlin-1對A549細胞Nur77的調控模式也值得被大家關注。

Nur77是核受體家族4A(NR4A)亞組中的一員，因為其內源性配體尚未被確定，因此也被稱為孤兒核受體。此外，Nur77在核受體中也是獨特的，它是一種可以由多種細胞外因素刺激誘導生存、分化和凋亡的立即早期基因[5]。Nur77的活動是通過其亞細胞定位進行調節(jié)的。在細胞核中，Nur77作為致癌生存因子發(fā)揮作用，促進癌細胞生長。相反，當它遷移到線粒體時與Bcl-2結合并轉換其生存表型，引發(fā)細胞色素C的釋放和凋亡[6]。因此，研究Nur77移位對了解其在細胞中發(fā)揮的作用至關重要。

1 材料與方法

1.1 細胞株 實驗所需的A549細胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫，由本實驗室傳代凍存。細胞培養(yǎng)條件為F-12K培養(yǎng)基+10% FBS，37 ℃，5%CO2，飽和濕度。

1.2 主要儀器和試劑 TriStar Lb941多功能酶標儀(BERTHOLD，德國)、DMIL LED倒置式生物顯微鏡(Lecica，德國)、激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)、LightCycler 96熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)、powerPac Basic蛋白電泳系統(tǒng)電源(Bio-Rad，美國)、TGEM Plus微量紫外分光光度計(天根，中國)、Tanon-5200 mμlti全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(天能，中國)、Endothlin-1(貨號：05-23-3800，Sigma)、CCK-8試劑盒(貨號：CK04，Dojindo)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(貨號：K1622，Thermo Fisher Scientific)、FastStart Universal SYBR Green Master(貨號：03003230001，Roche)、FITC標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(貨號：S0007，Affinity)、Nur77抗體(C-5)(貨號：sc-365113，Santa Cruz)、β-actin鼠單克隆抗體(貨號：LF201，Epizyme)。

1.3 細胞生長曲線 觀察A549細胞狀態(tài)，將處于指數生長期的A549細胞用胰酶消化后制備成單細胞懸液，吹打均勻后種板。每隔12 h(分別為0 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h)加入CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后用酶標儀測定450 nm波長吸光度值，根據結果繪制生長曲線。

1.4 CCK-8實驗 制備A549細胞懸液，分為5個實驗組，每個實驗中分別加入不同終濃度(0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1000 nM)的Endothlin-1，并設空白對照組，對照組及每個不同濃度的實驗組均設5個復孔。按照設置的培養(yǎng)時間點取出培養(yǎng)板，加入CCK-8試劑，培養(yǎng)3 h后，酶標儀測450 nm波長處各孔的吸光度值并計算細胞相對增殖率(%)。

1.5 實時熒光定量PCR 使用Trizol法提取RNA，根據Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書要求將RNA逆轉錄成cDNA。使用SYBR Green qPCR SupurMix，按照制造商的說明在PCR儀進行定量PCR檢測，qRT-PCR結果歸一化為GAPDH的表達，實驗重復3次。

1.6 免疫印跡法 使用RIPA裂解液快速裂解細胞，裂解后收集蛋白并進行濃度測定。每個樣品經SDS-PAGE凝膠電泳分離后將蛋白電泳轉移至PVDF膜上。封閉PVDF膜后加入一抗(Nur77，1∶1000；β-actin，1∶5000)孵育過夜。第二天用HRP結合的二抗(1∶5000)室溫下反應1 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液反應數秒后采集圖像，并計算灰度值。

1.7 免疫熒光 A549細胞接種于共聚焦平皿中，待單細胞平鋪皿底后洗滌并固定。封閉后與一抗孵育過夜，然后洗滌后并與熒光二抗孵育1 h。洗滌后滴加抗熒光淬滅劑，隨后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 A549細胞生長曲線 通過檢測A549細胞在0～3 d之內(共6個時間點)450nm波長處的吸光度值，用來間接反映A549細胞的生長狀況。如圖1所示，細胞OD值隨著時間的增加經過潛伏期、指數增長期、平臺期，趨于穩(wěn)定后出現生長退化。

2.2 Endothlin-1對A549細胞的毒性作用 為探討Endothlin-1對A549細胞生長的毒性作用，檢測Endothlin-1處理A549細胞6 h、12 h、24 h、36 h、48 h后的細胞活力。不同濃度(0 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1000 nM)的Endothlin-1作用于A549細胞，干預6 h、12 h、24 h、36 h、48 h后，A549細胞的相對活力未出現明顯抑制(P>0.05)，如圖2所示。

注：檢測時間點分別為0 h、12 h、24 h、36 h、 48 h、60 h、72 h；OD：吸光度值。圖1 A549細胞生長曲線圖

2.3 外源性Endothlin-1刺激對Nur77 mRNA表達水平的影響 用qRT-PCR檢測不同時間和濃度Endothlin-1刺激下Nur77 mRNA變化情況，如圖3所示。在同一作用時間點內，不同Endothlin-1刺激濃度組與對照組比較Nur77 mRNA表達無明顯變化(P>0.05)。

注：細胞相對增值率(%)=(實驗組A450-空白組 A450)/(對照組A450-空白組A450)×100%。圖2 不同濃度Endothlin-1對A549細胞 干預不同時間后的細胞活力

濃度梯度：0 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1000 nM；時間梯度：0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h。圖3 外源性Endothlin-1在不同濃度和時間刺激A549細胞的Nur77 mRNA表達水平

2.4 外源性Endothlin-1刺激對Nur77 蛋白表達水平的影響 用Western Blot檢測不同時間和濃度在Endothlin-1刺激下的Nur77蛋白變化情況，如圖4所示。在同一作用時間點內，不同Endothlin-1刺激濃度組與對照組比較Nur77的蛋白表達量無明顯變化(P>0.05)。由此可知，在Endothlin-1刺激下的Nur77表達并無呈現時間和濃度依賴性。

濃度梯度：0 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1000 nM；時間梯度：0.5 h、1 h、2 h、6 h、12 h、24 h。圖4 外源性Endothlin-1在不同濃度和時間刺激A549細胞的Nur77蛋白表達水平

2.5 Endothlin-1刺激誘導Nur77入核 檢查Nur77在Endothlin-1刺激反應中的亞細胞定位，如圖5所示。使用抗Nur77抗體進行免疫染色檢查內源性Nur77亞細胞定位，并通過DAPI染色確定細胞核的位置。結果顯示Nur77在Endothlin-1刺激后由細胞漿轉移至細胞核。

注：綠色熒光標記Nur77，DAPI用于標記細胞核顯示 藍色熒光；放大倍數：400倍，標尺：20 μm。圖5 Endothlin-1刺激誘導Nur77入核

3 討論

A549細胞雖然是肺癌細胞系，但具有Ⅱ型上皮細胞特性，經常被用作分析Ⅱ型上皮細胞的模型系統(tǒng)，在本項目中用于研究Endothlin-1對Nur77表達調控的機制。本課題組前期研究發(fā)現，Nur77作為轉錄因子調節(jié)下游靶基因的轉錄和表達，升高的Nur77可通過抑制NF-κB及p38 MAPK信號通路激活下調LPS誘導的A549細胞及LPS致ARDS大鼠Endothlin-1蛋白及mRNA表達水平，是Endothlin-1負向上游調控因子之一[4]。LI X X等[7]研究發(fā)現，NFATc1可在破骨細胞分化后期誘導Nur77表達，而Nur77又可反過來在轉錄水平上上調E3泛素連接酶Cbl-b，后者隨后促進NFATc1蛋白降解，形成NFATc1→Nur77→Cblb→NFATc1負反饋調節(jié)機制。類似地，TO S K Y等[8]發(fā)現Nur77可與β-catenin形成正反饋調控環(huán)，進而促進結腸癌細胞的生長。這意味著Nur77對下游靶因子的調控機制復雜而多變，會與下游靶因子形成調控環(huán)路，并非簡單的單向調控。Endothelin-1是一種含有21個氨基酸的肽類，屬于內皮素家族的亞型之一，以旁分泌和自分泌方式普遍表達的應激反應調節(jié)劑，對平滑肌細胞具有血管收縮作用，有助于維持內源性血管舒縮功能，是血管擴張劑一氧化氮(NO)的天然對應物[9]，不僅被當作評估內皮功能的標志物[10]， 也被研究作為冠狀動脈疾病、心肌梗塞和心力衰竭的預測因子和預后標志物[11]。物理因素，如剪切應力，或包括凝血酶、腎上腺素、血管緊張素Ⅱ、生長因子、細胞因子和自由基在內的刺激會增強Endothlin-1的分泌，而NO、環(huán)狀鳥苷一磷酸(cGMP)、心房利鈉肽和前列環(huán)素等介質會減少內源性 Endothlin-1的釋放，因此，在正常條件下，Endothlin-1 的作用是通過抑制或刺激Endothlin-1從內皮釋放來進行調節(jié)的[12]。本課題組前期研究發(fā)現Endothlin-1 作為細胞因子之一，可調節(jié)機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)、參與肺損傷炎癥反應，在機體生理及病理過程中起著重要的作用。深入研究 Endothlin-1誘導A549細胞Nur77表達的影響，有助于加深對相關炎癥性疾病病理生理過程的認識。然而，內源性產生的Endothelin-1被用于外源性刺激細胞的研究范例較為少見。因此，本研究采用CCK-8法對Endothlin-1體外培養(yǎng)A549后產生的細胞毒性進行測試。結果顯示，不同濃度的Endothlin-1在不同時間點干預后，A549 細胞并未呈現出增殖抑制情況。本次研究尚未對Endothlin-1在動物模型中的作用做出闡述，今后的研究工作需要進一步深入探討。

PAYAPILLY A等[13]研究認為，在某些類型的細胞中，由生長刺激誘導的Nur77在細胞核中作為轉錄因子，正向或負向調節(jié)參與細胞生存的基因的表達。Nur77也被某些凋亡刺激所誘導，并在適當的修飾下(可能是通過磷酸化和去磷酸化)，作為Nur77/RXR異源二聚體從細胞核遷移到細胞質，在那里它通過與Bcl-2結合靶向線粒體[6]。與Bcl-2的相互作用引起B(yǎng)cl-2的構象變化，引發(fā)細胞色素C的釋放和細胞凋亡。凋亡誘導劑(AHPN)和某些RXR配體可以通過誘導Nur77移位有效地誘導癌細胞凋亡[14]。這提示，Nur77移位對其生物學功能表達起著至關重要的作用，磷酸化可能在調控Nur77移位方面發(fā)揮了作用。在本次實驗中，觀察到Endothlin-1誘導A549細胞Nur77從細胞漿轉移至細胞核，出現入核現象。神經生長因子誘導的Nur77出核需要絲裂原活化蛋白激酶途徑使Nur77在Ser105(人類Nur77的Ser140)處磷酸化，這證明了磷酸化在Nur77出核中的作用[15]。Endothlin-1刺激是否影響Nur77的磷酸化以及磷酸化對調節(jié)其亞細胞定位仍在持續(xù)研究中。此外，到目前為止隨著研究的深入，發(fā)現當檢測Nur77蛋白表達水平時發(fā)現Endothlin-1外源性刺激條件下，Nur77蛋白條帶帶形上漂，推測這可能是翻譯后修飾的結果。

綜上所述，本次研究說明Endothlin-1外源性刺激對A549細胞無毒性作用，實驗進一步驗證了Endothlin-1誘導下對A549細胞Nur77 mRNA和蛋白表達無明顯影響，通過一種與轉錄無關的機制介導Nur77從胞漿轉移至胞核。本次實驗為開展Endothlin-1對A549細胞Nur77表達調控研究提供前期準備，并為后續(xù)探討Endothlin-1如何誘導Nur77亞細胞定位的研究奠定基礎。