m6A修飾在骨肉瘤中分子機(jī)制的研究進(jìn)展*

凌志安，梁玉婷，韋素萍，王 禹，趙勁民**

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣西南寧 530007；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧 530021)

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是骨骼系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，起源于間葉組織，好發(fā)于兒童和青少年，具有高侵襲性與轉(zhuǎn)移性且進(jìn)展迅速，早期易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重危害患者的生命健康[1,2]。N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物中編碼和非編碼RNA中最廣泛的RNA修飾形式之一。現(xiàn)有研究表明，m6A相關(guān)因子在骨肉瘤進(jìn)程中發(fā)生了失調(diào)，且與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。本文強(qiáng)調(diào)了m6A修飾在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展與預(yù)后轉(zhuǎn)歸中的關(guān)系，闡述了其細(xì)胞生物學(xué)功能和分子機(jī)制，以及未來(lái)在骨肉瘤中的研究趨勢(shì)和潛在的臨床應(yīng)用，為臨床提供新的檢測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。

1 m6A修飾

N6-甲基腺苷(m6A)是發(fā)生在腺苷N6位點(diǎn)的甲基化修飾，是真核生物mRNA中最普遍的內(nèi)部修飾。m6A修飾是指在腺嘌呤核苷酸的第6位氮原子上添加或刪除甲基，是mRNA分子中最豐富的表觀遺傳修飾之一[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾是一種具有動(dòng)態(tài)和可逆特征的表觀遺傳學(xué)改變[5]，可以通過(guò)多種調(diào)節(jié)蛋白來(lái)調(diào)節(jié)RNA的剪接、核輸出、定位、翻譯、降解和穩(wěn)定性。一些研究報(bào)道了m6A修飾在人類不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及與細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、疾病發(fā)生有關(guān)的細(xì)胞生物學(xué)功能[6,7]。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織/成骨細(xì)胞相比，在骨肉瘤組織/細(xì)胞中DLGAP1-AS2和m6A甲基化水平上調(diào)，通過(guò)進(jìn)一步構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)后模型，預(yù)測(cè)DLGAP1-AS2可能成為OS的預(yù)后靶向基因。

2 m6A甲基化蛋白酶

m6A修飾主要與3種類型的蛋白酶相關(guān)，即為多酶復(fù)合體，主要包括甲基化轉(zhuǎn)移酶(稱為“編碼器”)、去甲基化轉(zhuǎn)移酶(稱為“消碼器”)和甲基識(shí)別蛋白(稱為“讀碼器”)[6]，三者之間存在復(fù)雜的生物學(xué)功能[9]。

第一類是m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶，其編碼基因稱為“Writers”，包括METTL3、METTL14、WTAP、RBM15B、KIAA1429、ZC3H13和METTL16。METTL14與METTL3形成的穩(wěn)定復(fù)合物促使m6A甲基化基團(tuán)編輯入RNA中[10]，在底物識(shí)別中起主要作用[11-13]。每種蛋白其生物學(xué)功能各不相同，METTL3的結(jié)構(gòu)域具有催化活性，METTL14與METTL3形成異源二聚體，協(xié)同增強(qiáng)甲基轉(zhuǎn)移酶活性[13]。WTAP被認(rèn)為是一種銜接蛋白，主要功能是和METTL3-METTL14復(fù)合物相互結(jié)合，起穩(wěn)定METTL3-METTL14復(fù)合物的作用[11]。RBM15B主要功能是與尿嘧啶富集區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)某些RNAs的甲基化[14]。ZC3H13主要在錨定WTAP中起著關(guān)鍵作用，通過(guò)將WTAP連接到mRNA結(jié)合因子Nito來(lái)增強(qiáng)m6A活性[15,16]。ZC3H13參與了不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。據(jù)報(bào)道，ZC3H13在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)[17]，相反，與鄰近黏膜相比，ZC3H13在結(jié)腸腺癌腫瘤組織中的表達(dá)顯著上調(diào)[18]。此外，METTL16是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)甲基化轉(zhuǎn)移酶，能催化U6-snRNA中的m6A修飾，并參與rRNA的剪接[19]。KIAA1429是m6A甲基化酶復(fù)合物中重要的一部分，但其分子功能仍難以捉摸[20]?？傊恳粋€(gè)m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶對(duì)于m6A修飾是必需的，m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶和m6A去甲基化轉(zhuǎn)移酶之間的相互作用決定了m6A修飾的動(dòng)態(tài)和可逆調(diào)節(jié)。

第二類是m6A去甲基化轉(zhuǎn)移酶，其編碼基因稱為“Erasers”，目前報(bào)道的有FTO和ALKBH5[21]。這類去甲基化轉(zhuǎn)移酶可去除RNA中的m6A甲基化基團(tuán)，從而影響腫瘤生物學(xué)過(guò)程。越來(lái)越多的研究表明，F(xiàn)TO和ALKBH5的功能障礙可能導(dǎo)致癌癥發(fā)生[22-25]。FTO在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，同時(shí)FTO在肝細(xì)胞癌(HCC)組織中的表達(dá)也上調(diào)，這與患者預(yù)后不良有關(guān)[26]。

第三類是甲基識(shí)別蛋白，其與m6A甲基化位點(diǎn)結(jié)合并讀取信息，進(jìn)而發(fā)揮作用，其編碼基因稱為“Readers”，到目前為止發(fā)現(xiàn)的包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2等YTH家族，還有HNRNPC、HNRNPG、HNRNPA2B1和IGF2BP[27]，這些基因在維持m6A的mRNA的穩(wěn)定性、代謝以及翻譯等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[28]。隨著蛋白質(zhì)研究的不斷深入，甲基識(shí)別蛋白逐漸被發(fā)現(xiàn)，其功能與分子機(jī)制也在進(jìn)一步完善。

3 m6A修飾在骨肉瘤中的分子作用機(jī)制

3.1 m6A修飾在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

OS的發(fā)病是一個(gè)多因素的復(fù)雜過(guò)程，涉及廣泛的分子異常和腫瘤異質(zhì)性[29]。據(jù)報(bào)道，m6A是真核細(xì)胞中含量最豐富的RNA內(nèi)部修飾，m6A修飾主要通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)致癌基因或抑癌基因的mRNA水平來(lái)促進(jìn)或抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遷移等，并且異常的m6A修飾可通過(guò)多個(gè)分子機(jī)制在腫瘤發(fā)生中起重要作用[30]。

目前，許多研究證實(shí)了m6A修飾調(diào)控因子對(duì)OS細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。Yuan等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，與正常成骨細(xì)胞/組織相比，骨肉瘤細(xì)胞/組織中去甲基化酶ALKBH5水平的下調(diào)與m6A甲基化水平升高有關(guān)，ALKBH5過(guò)表達(dá)可顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲和觸發(fā)細(xì)胞凋亡；而沉默ALKBH5可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲，該研究預(yù)示ALKBH5過(guò)表達(dá)可能是替代骨肉瘤治療的一種新方法。Chen等[32]與Huang等[33]的研究也得出類似的結(jié)論，ALKBH5通過(guò)介導(dǎo)PVT1的m6A修飾，抑制閱讀器蛋白YTHDF2在PVT1中的結(jié)合;ALKBH5介導(dǎo)的PVT1上調(diào)促進(jìn)了體外OS細(xì)胞增殖和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng);ALKBH5的過(guò)表達(dá)顯著抑制了OS細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲等細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。Shi等[34]利用circRNA芯片檢測(cè)骨肉瘤中circRNA表達(dá)的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中circNRIP1的表達(dá)水平升高，通過(guò)下調(diào)circNRIP1表達(dá)水平可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Ling等[35]的研究表明，在OS細(xì)胞中敲除METTL3基因，導(dǎo)致m6A和DRG1 mRNA水平下降，沉默DRG1可降低OS細(xì)胞的活力，抑制細(xì)胞的遷移和集落形成能力，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由上述可知，DRG1在OS中具有致瘤作用，其中METTL3以m6A依賴的方式誘導(dǎo)DRG1在OS中的表達(dá)上調(diào)。Wang等[36]在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，METTL3與TRAF6呈正相關(guān)關(guān)系，METTL3下調(diào)會(huì)導(dǎo)致OS細(xì)胞中TRAF6的表達(dá)下降；METTL3在OS中高表達(dá)，通過(guò)m6A修飾增強(qiáng)TRAF6的表達(dá)水平，從而促進(jìn)OS細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Zhou等[37]的研究表明，METTL3通過(guò)m6A修飾提高了DANCR mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)了OS的治療進(jìn)展，說(shuō)明METTL3可能是OS治療腫瘤的新靶點(diǎn)。Zhou等[38]通過(guò)沉默METTL3可使OS細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲力下降，利用細(xì)胞學(xué)功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)了METTL3通過(guò)調(diào)節(jié)ATAD2在骨肉瘤生長(zhǎng)和侵襲過(guò)程中發(fā)揮致癌基因的作用。Miao等[39]研究表明，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3通過(guò)調(diào)控LEF1的m6A水平和激活Wnt/b-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的進(jìn)展。可見，通過(guò)不同的RNA m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶激活不同的上游基因、調(diào)控不同的下游靶基因，可影響骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，預(yù)示m6A修飾已成為OS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)不可或缺的因素。

3.2 m6A修飾在骨肉瘤化療耐藥中的作用

骨肉瘤目前的標(biāo)準(zhǔn)治療包括術(shù)前化療、術(shù)中病灶切除、術(shù)后化療，化學(xué)藥物治療有著不可替代的作用，但如今化療耐藥是臨床上骨肉瘤治療的一大瓶頸，因此，研究骨肉瘤化療耐藥的機(jī)制對(duì)骨肉瘤的治療有重要的意義。近期研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中TRIM7 m6A修飾缺失，METTL3和YTHDF2是參與TRIM7 m6A異常修飾的主要因素[40]，具有較高TRIM7水平的PDX小鼠和骨肉瘤細(xì)胞中易觀察到化療耐藥性，此研究預(yù)示m6A在化療耐藥中發(fā)揮重要作用，有望成為腫瘤耐藥治療的新靶點(diǎn)。臨床上常用的化療藥物阿霉素(DXR)，主要是通過(guò)誘導(dǎo)骨肉瘤干細(xì)胞激活Wnt/B-catenin信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮作用[41]。Zhang等[42]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA FOXC2-AS1 m6A修飾及其反義轉(zhuǎn)錄本FOXC2在具有阿霉素耐藥性的骨肉瘤細(xì)胞和組織中均升高，同時(shí)FOXC2通過(guò)誘導(dǎo)耐藥相關(guān)的ABCB1基因來(lái)促進(jìn)化療耐藥。以上研究結(jié)果表明，m6A與骨肉瘤的耐藥機(jī)制相關(guān)，可能通過(guò)提高或降低靶基因的m6A水平影響基因的表達(dá)及激活相關(guān)信號(hào)通路，從而影響腫瘤耐藥性，為降低臨床骨肉瘤化療耐藥提供理論依據(jù)。

3.3 m6A修飾在骨肉瘤靶向治療中的作用

m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5。FTO和ALKBH5可通過(guò)影響底物m6A修飾水平激活多種信號(hào)通路以促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展，因此m6A相關(guān)蛋白的特異性抑制劑在骨肉瘤治療中發(fā)揮重要作用。Huang等[43]的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)出兩種FTO抑制劑(FB23、FB23-2)，該抑制劑能選擇性地抑制人急性髓系白血病(AML)細(xì)胞中FTO的去甲基化功能，上調(diào)AML關(guān)鍵基因mRNA上的m6A修飾，并通過(guò)增加抑癌蛋白的豐度、降低促癌蛋白的豐度來(lái)抑制細(xì)胞增殖，從而實(shí)現(xiàn)抗AML腫瘤的治療效果，提示通過(guò)分子靶向性干預(yù)m6A修飾影響基因表達(dá)可能成為抗腫瘤的研究新方向。Shan等[44]通過(guò)檢測(cè)OS細(xì)胞/組織中KLF3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)OS細(xì)胞/組織中KLF3的mRNA水平和蛋白水平均升高，且與OS患者腫瘤TNM的分期及預(yù)后有關(guān)，同時(shí)FTO能促進(jìn)OS細(xì)胞的增殖和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，F(xiàn)TO介導(dǎo)的KLF3 m6A修飾促進(jìn)了OS進(jìn)展，預(yù)示KLF3可能為OS提供治療靶點(diǎn)。Chen等[45]的研究表明，m6A去甲基化酶ALKBH5介導(dǎo)的PVT1上調(diào)，可促進(jìn)體外OS細(xì)胞增殖和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，可知PVT1可能為OS提供治療靶點(diǎn)。

3.4 m6A修飾在骨肉瘤預(yù)后轉(zhuǎn)歸中的作用

目前，關(guān)于m6A修飾與OS預(yù)后的研究相對(duì)較少。不同的m6A修飾調(diào)控因子與OS預(yù)后的結(jié)果有所差別。Li等[46]通過(guò)公共基因組數(shù)據(jù)集和組織微陣列分析發(fā)現(xiàn)，METTL3、METTL14、YTHDF2的低表達(dá)以及KIAA1429、HNRNPA2B1的高表達(dá)與不良預(yù)后顯著相關(guān)，且HNRNPA2B1可能是OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Zhang等[8]利用從有效治療方法的治療應(yīng)用研究(TRAGET)中下載的數(shù)據(jù)集，通過(guò)生物信息學(xué)分析獲得與OS密切相關(guān)的m6A lncRNA，構(gòu)建了m6A相關(guān)的lncRNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)后模型(RP11-286E11.1、LINC01426、AC010127.3、DLGAP1-AS2、RP4-657D16.3、AC002398.11)為OS預(yù)后研究提供了理論依據(jù)。Zhang等[47]通過(guò)分析骨肉瘤患者的預(yù)后信息發(fā)現(xiàn)，METTL3、YTHDC1、FTO是與生存率相關(guān)的重要標(biāo)志物，且與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)性。Zheng等[48]利用生物信息學(xué)獲得骨肉瘤的保護(hù)因子AC004812.2，AC004812.2的低表達(dá)預(yù)示著總生存率較差，而AC004812.2的過(guò)表達(dá)可抑制143B細(xì)胞增殖，提高IGF2BP1和YTHDF1的表達(dá)水平，表明AC004812.2可能是m6A修飾的重要調(diào)控因子，也是骨肉瘤中很有前景的治療靶點(diǎn)。

WTAP在骨肉瘤組織中高表達(dá)，是骨肉瘤總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。有研究表明沉默的HMBOX1明顯減弱了shWTAP介導(dǎo)的對(duì)骨肉瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制，且WTAP/HMBOX1通過(guò)介導(dǎo)PI3K/AKT通路調(diào)控骨肉瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，證實(shí)了WTAP介導(dǎo)的m6A修飾在骨肉瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵作用，這可能為骨肉瘤的治療提供了新的見解[49]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF1表達(dá)水平低的患者預(yù)后較差，總生存率較低，提示YTHDF1可能與OS患者的預(yù)后不良有關(guān)[50]。隨著研究的深入，研究人員還發(fā)現(xiàn)了有利于OS患者預(yù)后的m6A修飾調(diào)控因子。FTO是m6A去甲基化酶，可以去除m6A修飾，調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致各種癌癥發(fā)病機(jī)制的改變[51]。此外，也有研究表明，F(xiàn)TO是一種保護(hù)基因，F(xiàn)TO的高表達(dá)可以提高骨肉瘤患者的生存率，而IGF2BP2是骨肉瘤的風(fēng)險(xiǎn)基因，IGF2BP2的高表達(dá)降低了骨肉瘤患者的生存率，F(xiàn)TO和IGF2BP2的異常表達(dá)與骨肉瘤的進(jìn)展顯著相關(guān)，是能夠獨(dú)立預(yù)測(cè)骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)鍵因素[52]。Liu等[53]通過(guò)檢測(cè)骨肉瘤組織中METTL14的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，METTL14與骨肉瘤患者的預(yù)后呈正相關(guān)，METTL14表達(dá)下調(diào)可能是骨肉瘤發(fā)生的一個(gè)潛在機(jī)制，可作為腫瘤抑制基因。

綜上可知，上述m6A修飾調(diào)控因子為OS的診斷、治療及預(yù)后轉(zhuǎn)歸的評(píng)估提供了新的思路，為進(jìn)一步深入研究m6A修飾調(diào)控OS的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制提供了研究方向，為OS的輔助治療提供了新的生物標(biāo)志物。

4 展望

目前，m6A在OS中的機(jī)制研究正處于發(fā)展階段，盡管在m6A生物學(xué)領(lǐng)域取得了顯著的進(jìn)展，但仍存在許多未知數(shù)和挑戰(zhàn)。m6A修飾就像一把“雙刃劍”，可以通過(guò)不同的方式加速或抑制骨肉瘤的進(jìn)展[54]。本文總結(jié)了m6A修飾在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展、化療耐藥、靶向治療、預(yù)后轉(zhuǎn)歸的分子機(jī)制方面的研究，以期為人類骨肉瘤的治療尋找有希望的靶點(diǎn)。雖然m6A的相關(guān)調(diào)節(jié)因子被證實(shí)可作為OS的診斷或治療靶點(diǎn)，但關(guān)于m6A的上游調(diào)控因子和下游靶點(diǎn)及其致癌或腫瘤抑制機(jī)制尚不清楚，仍有待進(jìn)一步深入研究。因此，未來(lái)還需從以下3個(gè)方面進(jìn)行突破：第一，立足OS構(gòu)建m6A及其相關(guān)修飾因子的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型；第二，增大臨床入選樣本量和篩選因子，作為早期診斷和預(yù)后的靶標(biāo)因子；第三，在OS動(dòng)物模型中開展與m6A相關(guān)的靶向治療，為OS靶向治療提供新的思路。