基于生物信息學(xué)構(gòu)建前列腺癌單細(xì)胞層面lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)*

莫泳鋒，謝遠(yuǎn)亮，陳蔓瑩，覃洪宇，葉 雨**

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣西南寧 530007；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西南寧 530021)

前列腺癌(Prostate Cancer，PCa)是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全世界有將近130萬PCa新發(fā)病例和35.9萬PCa死亡病例。PCa的發(fā)病率為13.5%，死亡率為6.7%，分別居全球男性腫瘤疾病第二位和第五位[1]。隨著社會(huì)的發(fā)展，人口逐漸向老齡化過渡，飲食健康問題及生活方式的改變使PCa的發(fā)病形勢(shì)仍十分嚴(yán)峻[2,3]。因此，開展PCa的機(jī)制研究，不斷深入探索腫瘤的發(fā)病機(jī)制，從分子機(jī)制上取得進(jìn)一步突破,對(duì)臨床診治工作有必要且關(guān)鍵的作用。

生物信息學(xué)分析是基于高通量測(cè)序結(jié)果研究腫瘤發(fā)病機(jī)制和鑒定預(yù)后生物標(biāo)志的重要方法。lncRNA是內(nèi)源性非編碼長RNA(長度200-100 000個(gè)核苷酸)，轉(zhuǎn)錄本主要位于細(xì)胞核中，其穩(wěn)定性和保守性較差，但特異性強(qiáng)[4]。lncRNA參與包括PCa在內(nèi)的多種類型癌癥的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)過程[5-8]。miRNA是內(nèi)源性非編碼微小RNA(長度約22個(gè)核苷酸)，在細(xì)胞和體液(包括血漿或血清)中相對(duì)穩(wěn)定[9,10]。在大多數(shù)情況下，miRNA與靶信使RNA的3′未翻譯區(qū)相互作用，在轉(zhuǎn)錄后誘導(dǎo)mRNA降解和抑制翻譯[11]。有研究提出了競爭性內(nèi)源性RNA(Competing Endogenous RNA，ceRNA)，即編碼RNA和非編碼RNA可以通過競爭相同的miRNA反應(yīng)元件(miRNA Response Elements，MREs)來相互調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)水平[12-14]。ceRNA的提出意味著在lncRNA-mRNA之間存在著通信調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，通過競爭相同的miRNA序列來調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)，形成一個(gè)復(fù)雜多樣的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)從而調(diào)節(jié)生物學(xué)過程和腫瘤發(fā)生，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白修飾等[15]。近年來雖然對(duì)ceRNA的研究越來越深入并取得了一定的成果，但是lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)對(duì)PCa的具體調(diào)控機(jī)制還不明確。

單細(xì)胞RNA測(cè)序(Single cell RNA sequencing，scRNA-seq)是一種可以在單細(xì)胞水平上探索復(fù)雜組織細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄組信息的新技術(shù)[16]。與批量RNA測(cè)序(Bulk RNA-seq)相比，scRNA-seq可以反映單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平，為細(xì)胞分子機(jī)制研究提供更精細(xì)且可靠的研究方法。lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制在bulk RNA-seq的支持下已得到越來越多學(xué)者的認(rèn)可，并證實(shí)其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。目前，關(guān)于scRNA-seq與bulk RNA-seq技術(shù)結(jié)合構(gòu)建的lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)研究仍較少，將二者結(jié)合構(gòu)建單細(xì)胞水平的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可為腫瘤致病機(jī)制研究提供新方向，同時(shí)有望獲得潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物，為PCa的診斷和治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

從GDC(https://portal.gdc.cancer.gov/)中獲取TCGA數(shù)據(jù)庫PCa的RNA-Seq測(cè)序文件，共獲得499例腫瘤組織和52例正常前列腺組織。通過GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取GSE157703中的2例前列腺癌單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)。

1.2 構(gòu)建表達(dá)矩陣

通過R_4.1.1軟件(https://www.r-project.org/)，使用rtracklayer_1.50.0和SummarizedExperiment_1.20.0命令集構(gòu)建人類基因信息比對(duì)數(shù)據(jù)庫。用data.table_1.14.0、tidyr_1.1.3和dplyr命令集讀取PCa的RNA-Seq測(cè)序文件進(jìn)行整理獲取全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)矩陣，然后與基因信息庫進(jìn)行基因匹配，獲取轉(zhuǎn)錄組的基因?qū)傩?，通過基因?qū)傩苑謩e獲取lncRNA和mRNA的表達(dá)矩陣。

1.3 差異基因的篩選

用R語言的DESeq2_1.30.1和edgeR_3.32.1命令集對(duì)構(gòu)建的lncRNA和mRNA表達(dá)矩陣進(jìn)行整理分析，分別得到lncRNA和mRNA差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes，DEGs)，使用plot命令集繪制靶基因的mRNA火山圖，用pheatmap_1.0.12命令集繪制Top 100-DEGs的熱圖。DEGs的篩選條件為|log2FC|>1且adj.P<0.05，log2FC表示取差異表達(dá)倍數(shù)以2為底的對(duì)數(shù)，adj.P表示矯正的P值。

1.4 lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過Mircode數(shù)據(jù)庫(http://www.mircode.org/)，運(yùn)用perl軟件對(duì)lncRNA-miRNA關(guān)系對(duì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。將獲取的miRNA通過TargetScan數(shù)據(jù)庫(https://www.targetscan.org/vert_72/)、miRTarBase數(shù)據(jù)庫(https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/)和miRDB數(shù)據(jù)庫(http://mirdb.org/)分別預(yù)測(cè)miRNA的靶基因，取交集得到最終的miRNA靶基因，然后與整合的DEGs取交集，最終得到多條lncRNA-miRNA-mRNA軸，據(jù)此構(gòu)建一個(gè)lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape_3.8.1進(jìn)行可視化。

1.5 功能富集分析

對(duì)構(gòu)建的lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)中的靶基因進(jìn)行生物學(xué)功能及通路富集分析。首先對(duì)lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)中的mRNA運(yùn)用R語言的org.Hs.eg.db_3.12.0包進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換；然后通過clusterProfiler_3.18.1、enrichplot_1.10.2和ggplot2_3.3.3包進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)以及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析，以PvalueCutoff=0.05、QvalueCutoff=0.05為篩選條件，結(jié)果以氣泡圖和圈圖顯示；最后使用STRING (https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的mRNA進(jìn)行蛋白互作分析，設(shè)定Medium confidence>0.4，結(jié)果使用Cytoscape_3.8.1將數(shù)據(jù)可視化。

1.6 單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的整合以及構(gòu)建單細(xì)胞水平調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

對(duì)獲取的單細(xì)胞測(cè)序文件，首先通過R語言的Seurat_4.0.1、ggplot2_3.3.3、clustree_0.4.3和cowplot_1.1.1包等命令集，合并整理構(gòu)建單細(xì)胞表達(dá)矩陣、矯正批次效應(yīng)以及質(zhì)量控制；然后進(jìn)行降維，根據(jù)Top 2 000差異基因進(jìn)行聚類和分群；最后根據(jù)mark基因?qū)Ω骷?xì)胞亞群進(jìn)行定義，通過拷貝數(shù)變異(Copy Number Variation,CNV)定義腫瘤細(xì)胞亞群，并進(jìn)一步驗(yàn)證lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)中的靶基因在各細(xì)胞亞群上的表達(dá)情況，同時(shí)構(gòu)建單細(xì)胞水平的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.7 預(yù)后分析與免疫組織化學(xué)驗(yàn)證

利用R軟件的cgdsr、DT、survival等數(shù)據(jù)包，獲取494例PCa的臨床數(shù)據(jù)及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)基因的中位表達(dá)情況，將其分為目的基因高表達(dá)組和低表達(dá)組，并分析無病生存期(Disease-Free Survival，DFS)，根據(jù)疾病有無復(fù)發(fā)或死亡將其分為復(fù)發(fā)組和死亡組或無復(fù)發(fā)組和死亡組，并分析基因的表達(dá)情況，通過ggpubr包進(jìn)行可視化。然后將基因輸入在線數(shù)據(jù)庫人類蛋白質(zhì)圖譜(https://www.proteinatlas.org/)，參數(shù)選擇前列腺癌病理圖譜，獲取目的基因免疫組織化學(xué)的鏡下圖像并導(dǎo)出，通過圖像處理軟件Adobe Illustrator可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)基因的篩選與鑒定

通過獲取TCGA的PCa測(cè)序數(shù)據(jù)，經(jīng)過篩選得到3 013個(gè)DEmRNA，其中上調(diào)1 282個(gè)，下調(diào)1 731個(gè)[圖1(a)]。由圖1(b)可知，共得到1 101個(gè)DElncRNA，其中上調(diào)443個(gè)，下調(diào)658個(gè)。取前100個(gè)差異基因作熱圖分析，結(jié)果顯示差異基因在腫瘤和正常組織中存在差異表達(dá)(圖2)。

圖2 差異基因熱圖分析結(jié)果Fig.2 Heat map analysis results of differential gene

2.2 lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將得到的DElncRNA通過Mircode數(shù)據(jù)庫進(jìn)行miRNA預(yù)測(cè)，得到1 935個(gè)lncRNA-miRNA關(guān)系對(duì)，然后將miRNA通過TargetScan、miRTarBase和miRDB數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)mRNA，與mRNA DEGs取交集得到97個(gè)miRNA的靶基因，最終納入構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的基因共175個(gè)，包括51個(gè)lncRNA、27個(gè)miRNA和97個(gè)mRNA。結(jié)果通過調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化(圖3)。

Blue diamond represents lncRNA,red triangle represents miRNA,green oval represents mRNA,and the linear connection represents that they have regulatory relationships

2.3 GO生物功能富集與KEGG信號(hào)通路富集分析

根據(jù)GO分析和KEGG分析，以P<0.05，F(xiàn)DR<0.05為篩選條件，并按照富集基因個(gè)數(shù)從大到小排列，將排名在前15的富集結(jié)果和KEGG分析結(jié)果用氣泡圖和圈圖表示(圖4)。GO分析結(jié)果顯示，lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的靶基因在腺狀細(xì)胞遷移、化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)、跨突觸信號(hào)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞形態(tài)分化與發(fā)生的調(diào)節(jié)、上皮細(xì)胞遷移和組織遷移等生物學(xué)過程富集[圖4：(a)(c)(e)]。KEGG分析結(jié)果顯示，miRNA在癌癥、軸突導(dǎo)向、胞間的黏附、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、Rap1、MAPK、PI3K-Akt和Ras等信號(hào)通路富集[圖4:(b)(d)(f)]。

圖4 GO和KEGG分析結(jié)果Fig.4 Analysis results of GO and KEGG

2.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

使用STRING數(shù)據(jù)庫分析lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)靶基因的蛋白互作關(guān)系，通過Cytoscape軟件繪制，得到蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，圓圈越大則互作對(duì)越多。由圖5可知，共得到58個(gè)蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)，其中Top 10基因分別為BDNF、FGF2、EZH2、MET、KIT、PIK3R1、PTGS2、RRM2、DLGAP5和CEP55。

Circle represents proteins,the larger the circle,the higher the interaction score;and the linear connection represents the interaction between proteins

2.5 單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)的整合及構(gòu)建單細(xì)胞水平調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

使用R軟件將獲取的GSE157703中的2例前列腺癌單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，得到6 803個(gè)細(xì)胞、24 639個(gè)基因的單細(xì)胞矩陣，最終定義了B細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、髓系細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共9個(gè)細(xì)胞亞群(圖6)。

Sample 1 and Sample 2 are sequenced samples of cancer tissue from two different PCa patients

為驗(yàn)證lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)靶基因在各個(gè)亞群的表達(dá)情況，取平均表達(dá)10%以上的亞群作為單細(xì)胞水平調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)[圖7：(a)(b)]，據(jù)此可以得到B細(xì)胞表達(dá)靶基因PEG10，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有25個(gè)lncRNA、1個(gè)miRNA和1個(gè)mRNA，共25條lncRNA-miRNA-mRNA軸[圖7(c)]；得到T細(xì)胞表達(dá)靶基因DUSP2，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有9個(gè)lncRNA、2個(gè)miRNA和1個(gè)mRNA，共18條lncRNA-miRNA-mRNA軸[圖7(d)]；得到成纖維細(xì)胞表達(dá)靶基因PDPN、HAS2、MAP1B和INMT，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有32個(gè)lncRNA、5個(gè)miRNA和4個(gè)mRNA，共70條lncRNA-miRNA-mRNA軸[圖7(e)]；得到肥大細(xì)胞表達(dá)靶基因KIT和PTGS2，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有6個(gè)lncRNA、1個(gè)miRNA和2個(gè)mRNA，共12條lncRNA-miRNA-mRNA軸[圖7(f)]；得到內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)靶基因GJA1、SNCG、TGFBR3、DUSP5、INMT和MET，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有46個(gè)lncRNA、6個(gè)miRNA和6個(gè)mRNA，共158條lncRNA-miRNA-mRNA軸[圖7(g)]；得到平滑肌細(xì)胞表達(dá)靶基因RBPMS2、SNCG、MAP1B和ARC，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有39個(gè)lncRNA、5個(gè)miRNA和4個(gè)mRNA，共77條lncRNA-miRNA-mRNA軸[圖7(h)]；得到上皮細(xì)胞表達(dá)靶基因EGLN3，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有11個(gè)lncRNA、3個(gè)miRNA和1個(gè)mRNA，共23條lncRNA-miRNA-mRNA軸[圖7(i)]；得到髓系細(xì)胞表達(dá)靶基因SLC7A11和DUSP5，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有31個(gè)lncRNA、3個(gè)miRNA和2個(gè)mRNA，共43條lncRNA-miRNA-mRNA軸[圖7(j)]；得到腫瘤細(xì)胞表達(dá)靶基因TRIM36、TRIM29、TP53INP1、ITGA2、PDLIM5、AMOT、PRRG4和MET等，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有45個(gè)lncRNA、10個(gè)miRNA和8個(gè)mRNA，共188條lncRNA-miRNA-mRNA軸[圖7(k)]。

圖7 lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在單細(xì)胞亞群中的表達(dá)情況Fig.7 Expression of lncRNA-miRNA-mRNA regulatory network in single cell subpopulation

2.6 PCa腫瘤細(xì)胞相關(guān)靶基因預(yù)后分析及驗(yàn)證

通過R軟件分別獲取ITGA2、MET、PDLIM5、PRRG4以及TP53INP1基因的DFS及其分組表達(dá)情況(圖8)。結(jié)果顯示，ITGA2、PDLIM5H和PRRG4的DFS存在差異且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，上述基因的低表達(dá)組有更高的腫瘤復(fù)發(fā)率或死亡率。為了進(jìn)一步驗(yàn)證調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的靶基因在PCa單細(xì)胞水平上的腫瘤細(xì)胞群的表達(dá)情況，通過在線數(shù)據(jù)庫分別驗(yàn)證ITGA2、PDLIM5和PRRG4基因在腫瘤細(xì)胞中的蛋白水平表達(dá)情況，結(jié)果顯示上述靶基因在PCa患者的腫瘤組織病理中均有不同程度的表達(dá)。

3 討論

隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，研究重點(diǎn)逐步從編碼RNA向非編碼RNA轉(zhuǎn)變。隨著近年來對(duì)腫瘤lncRNA-miRNA-mRNA軸的不斷深入研究，越來越多的研究表明lncRNA-miRNA-mRNA與PCa的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，lncRNA KCNQ1OT1/miR-211-5p/CHI3L1調(diào)控PCa細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲[17]。Luo等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TTN-AS1/miR-193a-5p在PCa中起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。Jiang等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOXD-AS1/miR-361-5p/FOXM1參與PCa腫瘤的轉(zhuǎn)移。也有研究提出lncRNA HOTAIR通過競爭性吸附miR-590-5p，參與調(diào)節(jié)STAT3，并參與PCa細(xì)胞對(duì)多西他賽的耐藥[20]。上述研究結(jié)果表明，lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與了調(diào)節(jié)PCa的增殖、遷移、侵襲和凋亡等多個(gè)生物學(xué)過程以及化療藥物的抵抗。以往構(gòu)建的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是基于bulk測(cè)序來進(jìn)行的，具有宏觀的指導(dǎo)意義，但更精確的微觀調(diào)控關(guān)系仍待進(jìn)一步研究。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的提出，使測(cè)序結(jié)果能精確到單個(gè)細(xì)胞水平，為腫瘤分子機(jī)制的研究提供了新方法。本研究通過對(duì)TCGA-PRAD的bulk測(cè)序和GEO中GSE157703的scRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，以此構(gòu)建單細(xì)胞水平的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以為PCa的分子機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

本研究通過對(duì)TCGA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到3 013個(gè)DEmRNA和1 101個(gè)DElncRNA，篩選出51個(gè)lncRNA、27個(gè)miRNA和97個(gè)mRNA來構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過GO分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的靶基因在腺狀細(xì)胞的遷移、細(xì)胞形態(tài)分化與發(fā)生調(diào)節(jié)、上皮細(xì)胞遷移和組織遷移等生物學(xué)過程富集。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的靶基因在胞間黏附、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等信號(hào)通路富集。因此可以得出生物功能主要與細(xì)胞形態(tài)分化、胞間連接和細(xì)胞遷移有關(guān)，信號(hào)通路參與了細(xì)胞黏附、細(xì)胞連接的形成。同樣地，在PPI的Top 10基因中BDNF、FGF2、MET和KIT也參與了上述生物功能以及相關(guān)信號(hào)通路。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是PCa患者死亡的重要原因之一，研究PCa轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)于改善其預(yù)后至關(guān)重要[21]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA HOXD-AS1通過miR-361-5p/FOXM1參與PCa患者的轉(zhuǎn)移[19]。本研究結(jié)果提示lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)參與了PCa的細(xì)胞連接、遷移以及黏附等相關(guān)生物學(xué)功能和通路的調(diào)控，可見其在轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制的調(diào)控中有重要作用。

根據(jù)標(biāo)記基因，在單細(xì)胞測(cè)序的聚類定義后，可得到B細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、髓系細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共9個(gè)細(xì)胞亞群的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控關(guān)系。下面將其分為免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、T細(xì)胞和髓系細(xì)胞)、上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肥大細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)以及腫瘤細(xì)胞4大類進(jìn)行討論。

免疫細(xì)胞的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要通過調(diào)控PEG10、SLC7A11、DUSP2和DUSP5基因參與調(diào)節(jié)腫瘤的免疫微環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA OIP5-AS1通過miR-128-3p/SLC7A11信號(hào)傳導(dǎo)抑制長期接觸鎘的前列腺癌鐵凋亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，SLC7A11在髓系細(xì)胞群表達(dá)較高，提示lncRNA-miRNA-SLC7A11信號(hào)軸可通過調(diào)控PCa腫瘤微環(huán)境中的髓系細(xì)胞參與調(diào)控PCa細(xì)胞凋亡。

上皮細(xì)胞的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要通過調(diào)控EGLN3基因參與腫瘤相關(guān)微環(huán)境的調(diào)節(jié)。miR-1205可以通過靶向EGLN3的3′-UTR位點(diǎn)，下調(diào)其轉(zhuǎn)錄活性參與調(diào)控PCa細(xì)胞增殖[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，EGLN3主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)，提示lncRNA-miRNA-EGLN3可能參與PCA腫瘤微環(huán)境中的上皮細(xì)胞群的相關(guān)增殖。

間質(zhì)細(xì)胞的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要通過調(diào)控GJA1、SNCG、TGFBR3、DUSP5、INMT、MET、KIT、PTGS2、PDPN、HAS2、MAP1B、INMT、RBPMS2、SNCG、MAP1B和ARC基因參與腫瘤相關(guān)微環(huán)境的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的lncRNA DLX6-AS1通過miR-497-5p/SNCG軸在PCa中起到促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡從而調(diào)控PCa進(jìn)展的作用[24]。相關(guān)研究表明，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中MiR-124-3p通過直接吸附PTGS2抑制AKT/NF-κB通路，從而抑制PCa細(xì)胞的細(xì)胞活力、增殖、遷移、侵襲并促進(jìn)凋亡[25]。這些結(jié)果提示本研究構(gòu)建的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，主要通過調(diào)控PCa的間質(zhì)細(xì)胞群從而間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲等過程。

腫瘤細(xì)胞的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要參與TRIM36、TRIM29、TP53INP1、ITGA2、PDLIM5、AMOT、PRRG4和MET基因的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA625可通過靶向miR-432調(diào)控TRIM29，從而調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白通路，抑制PCa細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡[26]。另外，lncRNA AGAP2-AS1/miR-195-5p/PDLIM5在PCa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及腫瘤生長過程發(fā)揮調(diào)控作用[27]。通過預(yù)后分析得出腫瘤細(xì)胞lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的靶基因ITGA2、PDLIM5H和PRRG4可以預(yù)測(cè)PCa的DFS，這些基因在蛋白水平也得到表達(dá)驗(yàn)證，提示其可作為預(yù)后的觀測(cè)指標(biāo)之一。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了在PCa單細(xì)胞水平下包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的9個(gè)細(xì)胞亞群的數(shù)百條精確的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并發(fā)現(xiàn)該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不僅參與PCa的發(fā)生發(fā)展調(diào)控，同時(shí)在臨床預(yù)后預(yù)測(cè)方面也有重要的意義。本研究構(gòu)建的多條lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控軸雖然為PCa的基礎(chǔ)研究提供了新方向，但是目前在各個(gè)細(xì)胞亞群的具體生物學(xué)功能尚未得知，還需通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。