2020年豬圓環(huán)病毒2型云南流行株的分子鑒定及全基因組序列分析

周玉照，張小苗*，柴 俊

（1.大理農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 大理 671003；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明）

豬圓環(huán)病毒（PCV）根據(jù)其基因型的不同，目前分為 PCV-1、PCV-2、PCV-3及 PCV-4等 4種血清型[1-2]。而 PCV-1不致病，PCV-2是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒CVAD）的主要病原，PCV-3是一種與豬生殖功能衰竭、皮炎和腎病綜合征和多系統(tǒng)炎癥相關(guān)的新型圓環(huán)病毒[3]。PCV-2全基因組有1766～1768個核苷酸，其中ORF2基因編碼的 Cap蛋白是 PCV-2主要免疫原性蛋白，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，此外，ORF2還常用于PCV-2的流行病學(xué)分析[4]。因PCV-2在世界范圍內(nèi)的廣泛流行，使得PCV-2流行毒株的基因亞型相繼發(fā)生突變，給豬圓環(huán)病毒病的防治和疫苗研發(fā)帶來了困難[5]。因此，對云南 PCV-2流行毒株進行分析很有必要。筆者從云南不同地區(qū)采集的疑似PCV-2 43份樣品先進行PCV-2病原學(xué)檢測，再對陽性病料進行全基因測序，利用生物軟件對獲得的核苷酸序列進行進化分析，同時對獲得的ORF2基因序列編碼的Cap蛋白與5株疫苗株Cap蛋白作抗原指數(shù)差異性比較，從而弄清云南省豬場中PCV-2的基因型及其變異情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 從云南省不同地區(qū)發(fā)病豬場，采集臨床癥狀疑似豬圓環(huán)病的發(fā)病豬全血 41份和2份公豬精液，共43份。

1.1.2 主要試劑 rTaq酶、Taq Buffer、ddH2O、大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞、Magen DNA提取試劑盒、pMDl9-T載體、DNA Marker DL-2000，均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA膠回收試劑盒購自昆明錦昂科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 參考 GenBank里的PCV-2基因序列（GenBank登錄號為 KJ 437192.1），利用生物軟件分別設(shè)計用于擴增PCV-2-ORF2基因和PCV-2全基因的引物。引物序列 PCV-2-ORF2F 5′-ATGACGTATCCAAGGAG GC-3′，PCV-2-ORF2R 5′-TTAGGGTTTAAGTGG GGGGT-3′；PCV-2-F 5′-ATCCACGGAGGAAGG GGGCCAGTT-3′，PCV-2-R 5′-GTGGATTGTTCT GT AGCATTCTTCCA-3′。引物由寶生物（大連）有限公司合成。

1.2.2 PCR鑒定 用DNA提取試劑盒提取43份病料的總DNA并進行PCR擴增PCV-2-ORF2基因，大小約702 bp，PCR擴增體系：上下游引物各 0.5 μl，10×Taq Buffer 3 μl，dNTP 2.5 μl，rTaq 0.5 μl，DNA 2 μl，ddH2O 21 μl。PCR 擴增程序：預(yù)變性 95 ℃ 4 min；變性 95 ℃ 40 s，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 55 s，32個循環(huán)；終延伸72 ℃ 5 min。

1.2.3 PCV-2全基因PCR擴增及克隆 將陽性病料的DNA為模板，以引物PCV-2-F/R進行PCR擴增 PCV-2全基因片段，大小約 1 768 bp。將目的片段膠回收純化后進行陽性克隆，并挑選出陽性克隆的菌落并進行培養(yǎng)。

1.2.4 PCV-2全基因序列測定及分析 將陽性克隆重組質(zhì)粒菌液送寶生物有限公司進行全基因測序，應(yīng)用生物軟件進行PCV-2蛋白質(zhì)氨基酸同源性比對、遺傳進化分析、PCV-2 Cap蛋白氨基酸比對和Cap蛋白抗原指數(shù)預(yù)測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR鑒定

將PCV-2-ORF2基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，約702 bp處出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的片段（圖1）。

圖1 PCV-2-ORF2基因PCR擴增結(jié)果

2.2 PCV-2全基因PCR擴增

將擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，約 1768 bp處出與預(yù)期大小相符的片段（圖2）。

圖2 PCV-2全基因擴增結(jié)果

2.3 PCV-2全基因序列測定及分析

2.3.1 PCV-2蛋白氨基酸比對與遺傳進化分析將從公豬精液病料中測序得到的序列命名為 YN PCV2-1，從病豬全血病料中測序得到的序列分別命名為YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-4、YN PCV2-5。用DNAStar中的MegAlign軟件與國內(nèi)外PCV-2進行氨基酸比對和遺傳進化分析。結(jié)果表明，YN PCV2-1氨基酸同源性在82.0 %～99.1 % 之間；YN PCV2-2氨基酸同源性在81.5 %～99.1 % 之間；YN PCV2-3氨基酸同源性在 66.8 %～84.5 % 之間；YN PCV2-4氨基酸同源性在 83.3 %～98.7 % 之間；YN PCV2-5氨基酸同源性在 79.0 %～93.6 % 之間；YN PCV2-4氨基酸遺傳進化分型上與PT-27168-08.HQ831537毒株屬于同一個分支，親緣關(guān)系近。YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-5 與其他毒株不屬于同一個分支（圖3）。

圖3 PCV-2蛋白氨基酸遺傳進化分析結(jié)果

2.3.2 PCV-2 Cap蛋白氨基酸比對分析 用MegAlign軟件分別將 YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-4、YN PCV2-5 的ORF2基因與國內(nèi)外分離株、疫苗株（AY686764 ZJ、GU049340 1010、HM038027 SH、HM 038034 LG、KX161697 YZ）進行氨基酸比對分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)YN PCV2-5 Cap蛋白氨基酸變化最明顯，有8個氨基酸位點出現(xiàn)變異；獲得的5株Cap蛋白氨基酸都出現(xiàn)的位點為 25位 F→V，4株Cap蛋白氨基酸都出現(xiàn)的位點為11位K→F、217位A→V、223位M→T，3株Cap蛋白氨基酸都出現(xiàn)的位點為187位G→E/V，25氨基酸位點突變頻率最高，其次是 11位、217位、223位，詳細結(jié)果見表1。

表1 PCV-2 Cap蛋白氨基酸變異位點比對分析結(jié)果

2.3.3 PCV-2 Cap 蛋白抗原指數(shù)預(yù)測分析 應(yīng)用Protean軟件中的 Antigenicity-Jameson-Wolf分析YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-4、YN PCV2-5的Cap蛋白抗原指數(shù)并與5株疫苗株（AY686764 ZJ、GU049340 1010、HM038027 SH、HM038034 LG、KX161697 YZ）的 Cap蛋白抗原指數(shù)進行差異性分析。結(jié)果 YN PCV2-4 Cap蛋白抗原指數(shù)與 5株疫苗株的 Cap蛋白抗原指數(shù)差異性不大，而 YN PCV2-1、YN PCV2-2、YN PCV2-3、YN PCV2-5的 Cap蛋白抗原指數(shù)與5株疫苗株的Cap蛋白抗原指數(shù)差異性較大，其中在 5～10，25，40～50，70，172～176，210～223區(qū)域的抗原指數(shù)均不同于疫苗株（圖4）。

圖4 PCV-2 Cap蛋白抗原指數(shù)預(yù)測分析結(jié)果

3 討論

目前，豬圓環(huán)病毒 2型是嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[6]。疫苗免疫接種是預(yù)防 PCV的主要手段，但目前豬場普遍存在免疫失敗的情況，而引起免疫失敗的原因有很多，主要包括免疫程序、疫苗品質(zhì)、存在免疫抑制性疾病、豬場管理等方面的原因[7]。在不同規(guī)模的豬場、采取的生物安全措施也各有差異，所以PCV-2感染率也不一樣[8]。

在云南省福貢縣和花益[9]等報道農(nóng)村散養(yǎng)戶PCV-2感染率為 59 %；2016年宋春蓮[10]等在云南地區(qū)部分種豬場檢測出 PCV-2的陽性為28.71 %；2018年李金鳳[11]等在云南省思茅地區(qū)豬場蚊 PCV-2檢測，其陽性率為 15.96 %，2021年李枝蘭[12]等在云南不同地區(qū)成功分離到 2株P(guān)CV-2分離毒株?？梢奝CV-2感染已經(jīng)成為影響云南養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一。而與云南相領(lǐng)的省份也相繼報道有PCV-2的感染，2018年李海全[13]等在四川省部分地區(qū)檢測出 PCV-2的陽性為49.2 %；2018年吳好葉[14]等在貴州省獲得了 16株 PCV-2的流行株；2018年呂其壯[15]等在廣西北部灣地區(qū)檢測出 PCV-2的陽性為 42.16 %，李金鳳[16]從豬場蚊子體中檢測到 PCV2，而且存在PCV2a、PCV2b和 PCV2d 3種亞型，其中PCV2d為主要的基因型。試驗從云南各地區(qū)采集疑似病料 43份，并從中檢測出 5株云南流行PCV-2毒株，其陽性率為 11.63 %，說明云南省PCV-2普遍存在；獲得的Cap蛋白氨基酸多處出現(xiàn)突變，Cap蛋白抗原指數(shù)與 5株疫苗株存在較大的差異性，多個區(qū)域都與疫苗株不相同，說明云南省流行的PCV-2毒株與商品疫苗毒株存在差異，如果養(yǎng)殖場用商品化疫苗進行免疫接種預(yù)防豬圓環(huán)病毒 2型，可能預(yù)防效果會大大降底甚至起不到任何作用，這給云南省PCV-2的防控帶來很大難度。

4 結(jié)論

云南省普遍存在PCV-2的流行，且流行毒株與目前常用的商品化疫苗毒株相比基因發(fā)生了突變。對于云南養(yǎng)豬業(yè)來說要引起高度注視，而目前做好養(yǎng)殖廠生物安全是防控該病的最有效手段。