36份新選育玉米自交系抗瘤黑粉病鑒定及抗性遺傳初步分析

肖明綱

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 博士后工作站，黑龍江 哈爾濱 150086)

玉米瘤黑粉病是由玉蜀黍黑粉菌(Ustilagozeae(Beckm.)unger)侵染引起的一種世界性玉米病害，土壤、氣流和種子均可傳播。玉米瘤黑粉病是非系統(tǒng)侵染病害，在玉米生長的各個階段均可發(fā)生。玉蜀黍黑粉菌主要通過傷口侵染植株的所有地上組織，被侵染部位形成形狀各異、大小不一的腫瘤[1]。瘤黑粉病是我國玉米生產(chǎn)中的重要病害，在我國普遍發(fā)生[1-2]，發(fā)病率一般5%～10%，嚴(yán)重時可造成30%～80%的產(chǎn)量損失[3]。近年來，多年秸稈還田、西北玉米區(qū)常年連作及推廣品種缺乏抗病性等原因?qū)е峦寥乐胁『Τ跚秩驹醇眲≡黾?，各地瘤黑粉病發(fā)生呈逐漸加重趨勢，特別是在夏玉米區(qū)和西北玉米制種區(qū)，瘤黑粉病對玉米生產(chǎn)的影響越來越大[4-8]。河北省隆堯縣2014年玉米瘤黑粉病大發(fā)生，田間植株發(fā)病率高達14.5%，嚴(yán)重降低玉米產(chǎn)量[9]。2015年由于玉米品種抗性弱，連年重茬造成病原菌積累，玉米瘤黑粉病在云南省大關(guān)縣大發(fā)生，一般地塊發(fā)病率達到3%～8%，嚴(yán)重地塊產(chǎn)量損失達30%～40%[10]。2016年玉米抽雄后強烈降雨導(dǎo)致河北省玉米瘤黑粉病大面積暴發(fā)，果穗感病嚴(yán)重，造成玉米大面積減產(chǎn)達50%以上[11]。因氣候條件適宜，再加之感病品種的種植，玉米瘤黑粉病在安徽省北部地區(qū)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，自然發(fā)病率從2011—2016年由3.5%上升到5.3%，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)赜衩咨a(chǎn)[12]。2014—2016年期間，東北三省前期高溫干旱，中后期低溫多雨，導(dǎo)致玉米瘤黑粉病普遍發(fā)生，受侵染玉米面積高達995.33 萬hm2。其中，黑龍江省玉米瘤黑粉病發(fā)病最為嚴(yán)重，造成的經(jīng)濟損失也最大[13]。2015—2017年玉米瘤黑粉病在甘肅省天水市各玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，田間病株率在5%～12%，嚴(yán)重地塊造成玉米減產(chǎn)率高達15%以上[14]。國家玉米產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系2019年調(diào)研結(jié)果表明，玉米瘤黑粉病的發(fā)生和危害在東北各玉米產(chǎn)區(qū)逐年加重。因此，防治玉米瘤黑粉病的發(fā)生和危害是玉米減損增效的重要舉措。

選育抗病品種是控制玉米瘤黑粉病發(fā)生和危害最經(jīng)濟有效的措施，而豐富的抗病種質(zhì)資源則是抗病育種的材料基礎(chǔ)。為此，國內(nèi)很多學(xué)者對于玉米瘤黑粉病抗性種質(zhì)資源篩選和鑒定做了大量工作。姜曉穎等[15]對21個骨干自交系人工接種鑒定，發(fā)現(xiàn)17份抗病材料，其中9份材料高抗玉米瘤黑粉病。薛春生等[16]采用人工接種方法，評價了19個玉米骨干自交系對瘤黑粉病的抗性，發(fā)現(xiàn)8份抗病材料，占比為42%。段燦星等[17]對836份玉米種質(zhì)資源進行了抗玉米瘤黑粉病鑒定與評價，共篩選出275份抗玉米瘤黑粉病材料，占鑒定總材料的32.9%。嚴(yán)理等[18]采用苗期注射人工接種方法對22個玉米品種瘤黑粉病抗性初步鑒定表明，高抗和中抗品種各2個，抗病品種12個，抗病品種占比較高，達到73%。王澤浩[6]采用冬孢子粉菌土法評價了45份玉米品種親本對瘤黑粉病的抗性，鑒定結(jié)果表明，所有材料對瘤黑粉病都具有抗性。賈嬌等[19]田間調(diào)查了71份新選玉米自交系對瘤黑粉病的抗性，85.9%的材料對玉米瘤黑粉病具有抗性，其中高抗材料36份，抗病材料24份。施艷等[20]評價了河南省2015—2017年456份玉米區(qū)域試驗參試品種對瘤黑粉病的抗性水平，結(jié)果表明，玉米瘤黑粉病抗病品種鑒定結(jié)果在不同年份中差異較大，2015年和2016年以感病品種為主，2017年以中抗品種為主。周天旺等[21]利用田間人工接種方法評價了47份鮮食玉米對瘤黑粉病的抗性，結(jié)果表明，鮮食玉米新品種中抗瘤黑粉病品種比較豐富，47份鮮食玉米雜交種中僅有5份材料表現(xiàn)感病。郭成等[22]于2019年通過人工接種對42份鮮食玉米進行田間抗性鑒定，在鮮食玉米上，對瘤黑粉病抗性品種較為匱乏，42份品種中僅有5份材料表現(xiàn)抗病。于玲玲等[23]對新選育的20份玉米自交系進行抗瘤黑粉病鑒定，結(jié)果表明，僅有H7、H9、H12、H13和H19等5份材料抗玉米瘤黑粉病。王鐵兵等[24]研究了30份玉米自交系對瘤黑粉病的抗病性，發(fā)現(xiàn)僅有7份材料表現(xiàn)為抗病，其余23份均表現(xiàn)為感瘤黑粉病。段燦星等[25]首次對2 000份來源廣泛且遺傳背景豐富的玉米種質(zhì)資源進行了多年多點玉米瘤黑粉病的田間自然發(fā)生條件下抗病性鑒定，結(jié)果表明，玉米瘤黑粉病的發(fā)生受環(huán)境條件影響較大，需要后續(xù)人工接種精準(zhǔn)鑒定。張文潔[26]利用人工注射接種瘤黑粉冬孢子的方法對204份玉米自交系進行瘤黑粉病抗性鑒定，結(jié)果表明，抗性材料較少，占比僅為34.31%，感病自交系所占比例較大，達到65.69%，且不同玉米種質(zhì)對瘤黑粉病的抗性存在差異。

隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者開展了玉米抗病基因定位與克隆工作，但關(guān)于玉米瘤黑粉病抗性基因定位和克隆的研究較少。Lübberstedt等[27]采用復(fù)合區(qū)間作圖法，利用122個RFLP標(biāo)記進行了玉米抗瘤黑粉病的QTL定位，共發(fā)現(xiàn)19個不同的QTLs。Kerns等[28]采用單因素回歸分析法，利用146個RFLP標(biāo)記對玉米瘤黑粉病進行了QTL定位，鑒定出5個與瘤黑粉病相關(guān)的染色體區(qū)段。Baumgarten等[29]利用重組自交系群體，定位到了抗玉米瘤黑粉病的QTLs，這些抗病相關(guān)位點分布在除第6染色體以外其余9條染色體上。Ding等[30]利用重組自交系群體，定位到6個加性效應(yīng)QTLs，分布在第3、5、8染色體上。呂愛枝等[31]的片段代換系研究結(jié)果則顯示，chr3-7、chr3-1和chr3-6分別在phi046(bin3.08)、phi049(bin3.01)和umc1644(bin3.06)位點表現(xiàn)為高抗、中抗和感病。姬東華[32]以F2∶3家系為作圖群體，采用復(fù)合區(qū)間作圖法初步定位玉米瘤黑粉病相關(guān)抗性基因，共檢測到5個QTLs，表型貢獻率范圍為1.97%～28.68%。梁爽[13]利用Ici Mapping軟件對玉米瘤黑粉病進行QTL定位分析，結(jié)果共檢測到6個玉米抗瘤黑粉病QTLs，表型貢獻率為4.729 7%～7.612 8%。

目前玉米瘤黑粉病在我國各玉米種植區(qū)發(fā)生越來越普遍，危害也越來越嚴(yán)重，針對這種情況，我們利用人工接種方法，對新選育的32份玉米種質(zhì)資源進行玉米瘤黑粉病抗性鑒定和評價，并對高抗種質(zhì)資源進行連續(xù)多年鑒定，探究其真實抗性水平，以期為玉米抗瘤黑粉病新品種培育篩選有效種質(zhì)資源；利用F2群體對高抗瘤黑粉病材料進行抗性遺傳分析并初步定位抗病基因，豐富抗玉米瘤黑粉病基因資源，為抗病基因的進一步利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試自交系

36份新選育的穩(wěn)定玉米自交系。抗病鑒定對照材料齊319高抗玉米瘤黑粉病，掖478高感玉米瘤黑粉病。2018—2020年連續(xù)3 a對這些玉米材料進行了抗瘤黑粉病鑒定，抗性評價以3 a數(shù)據(jù)最高級別計算。

1.2 供試病原菌

玉蜀黍黑粉菌(Ustilagozeae)分離自黑龍江省玉米發(fā)病組織，由本課題組采集、分離、純化、培養(yǎng)并保存。

1.3 抗病鑒定圃設(shè)置

玉米抗瘤黑粉病鑒定圃設(shè)在哈爾濱呼蘭區(qū)，鑒定材料順序排列，每份材料種植4行，行長5 m，行距0.65 m，每行留25～30株，株距略小于大田生產(chǎn)，每份材料至少保苗100株，田間正常管理。在玉米展6～8葉期，采用注射法接種，7 d后進行第2次接種，乳熟后期進行抗性調(diào)查。

1.4 人工接種及抗性評價

接種體制備、具體接種方法、反應(yīng)分級及抗性評價標(biāo)準(zhǔn)參見《玉米病蟲害田間鑒別手冊》[1]。

1.4.1 玉米瘤黑粉病接種體準(zhǔn)備

在田間采集玉米瘤黑粉病植株上的未破裂菌體，放置通風(fēng)處陰干，在干燥條件下保存。接種前，將保存的瘤體破碎，并將厚垣孢子團充分碾碎，用50目細(xì)籮過篩，使病原菌成為均一的菌粉。在直徑90 cm培養(yǎng)皿中放置2～3層濾紙并充分浸潤，每皿均勻撒入0.2 g菌粉。25 ℃下保濕72 h，然后將每皿的菌粉洗入1 L水中，配制成濃度約為1×105孢子·mL-1接種液，接種液中加入0.5 g·L-1的葡萄糖[1]。

1.4.2 玉米瘤黑粉病人工接種方法

在玉米6～8葉期時采用注射法人工接種。接種時，在植株中部接近生長點的部位從外向內(nèi)且刺入心葉內(nèi)，每株注射菌液2 mL。1周后進行第二次接種，接種后田間正常管理[1]。

1.4.3 玉米瘤黑粉病抗性評價

在玉米進入乳熟后期進行調(diào)查，逐株調(diào)查每份材料，分別記載調(diào)查總株數(shù)、發(fā)病株數(shù)，計算和記載發(fā)病株率。發(fā)病株率0%～1.0%為1級(HR)，發(fā)病株率1.1%～5.0%為3級(R)，發(fā)病株率5.1%～10.0%為5級(MR)，發(fā)病株率10.1%～40.0%為7級(S)，發(fā)病株率40.1%～100%為9級(HS)[1]。

1.5 高抗玉米瘤黑粉病材料抗性遺傳初步分析

用高抗玉米材料與感病自交系掖478雜交，產(chǎn)生F2分離群體，在玉米6～8葉期時人工接種相應(yīng)的F2群體和感病對照掖478，1周后第二次人工接種，乳熟后期調(diào)查每個F2單株發(fā)病狀況[1]。計算各群體抗、感個體的分離比例，用SAS 8.2軟件(SAS Institute，Raleigh，NC，USA)計算分離比例的χ2值和概率值，進行分離比例的適合性測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 引進材料對瘤黑粉病的抗性鑒定與評價

2018年和2019年連續(xù)2 a采用注射法評價了36份玉米自交系對瘤黑粉病的抗性，抗病對照齊319發(fā)病株率分別為0和0.8%，表現(xiàn)為高抗，感病對照掖478感病株率為89.3%和89.1%，表現(xiàn)為高感，抗、感對照發(fā)病率差異明顯，鑒定結(jié)果有效。在36份待鑒定材料中，共篩選到19份玉米自交系對瘤黑粉病具有抗性，占鑒定材料的52.8%。其中高抗材料11份(Z16HEB-325、Z16HEB-328、Z16HEB-330、Z16HEB-333、Z16HEB-339、Z16HEB-342、Z16HEB-347、Z16HEB-349、Z16HEB-350、Z16HEB-352和Z16HEB-356)，占鑒定材料的30.6%；中抗材料2份(Z16HEB-335和Z16HEB-345)，占鑒定材料的5.6%；抗病材料6份(Z16HEB-322、Z16HEB-324、Z16HEB-326、Z16HEB-337、Z16HEB-344和 Z16HEB-354)，占鑒定材料的16.7%；感病材料11份(Z16HEB-323、Z16HEB-327、Z16HEB-331、Z16HEB-334、Z16HEB-336、Z16HEB-338、Z16HEB-340、Z16HEB-341、Z16HEB-346、Z16HEB-348和Z16HEB-353)，占鑒定材料的30.6%；高感材料6份(Z16HEB-321、Z16HEB-329、Z16HEB-332、Z16HEB-343、Z16HEB-351和Z16HEB-355)，占鑒定材料的16.7%(圖1)。鑒定結(jié)果表明，在新選育的36份玉米材料中，有豐富的玉米瘤黑粉病抗源，可用于抗病親本的選育及抗病材料的改良，以減輕玉米瘤黑粉病的危害，減少制種成本，提高制種產(chǎn)量。

圖1 新選玉米自交系瘤黑粉病抗性級別分布

2.2 外引高抗材料抗玉米瘤黑粉病重復(fù)鑒定

2020年對11份高抗玉米瘤黑粉病材料又進行了重復(fù)鑒定，感病對照掖478發(fā)病株率為87.1%，抗病對照齊319發(fā)病株率為0，抗、感對照充分發(fā)病，人工接種鑒定有效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自交系Z16HEB-325、Z16HEB-328、Z16HEB-330、Z16HEB-333、Z16HEB-339、Z16HEB-342、Z16HEB-347、Z16HEB-349、Z16HEB-350、Z16HEB-352和Z16HEB-356共11份材料3 a間玉米瘤黑粉病抗性表現(xiàn)穩(wěn)定，反映了其真實抗性水平(表1)。這些自交系可作為玉米抗瘤黑粉病的重要抗性資源，以拓展我國玉米抗瘤黑粉病種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)。

2.3 高抗玉米瘤黑粉病材料抗性遺傳分析

11份高抗自交系與感病對照掖478配制雜交組合，人工接種F2群體，F(xiàn)2單株對玉蜀黍黑粉菌的抗感表現(xiàn)結(jié)果表明，組合掖478/Z16HEB-325、掖478/Z16HEB-333、掖478/Z16HEB-339、掖478/Z16HEB-347和掖478/Z16HEB-352的F2群體抗感植株比例都符合3∶1的分離比，而組合掖478/Z16HEB-328、掖478/Z16HEB-330、掖478/Z-16HEB-342、掖478/Z16HEB-349、掖478/Z16HEB-350和掖478/Z16HEB-356的F2群體抗、感植株比例不符合3∶1的分離比(表2)，說明自交系Z16HEB-325、Z16HEB-333、Z16HEB-339、Z16HEB-347和Z16HEB-352對玉蜀黍黑粉菌的抗性可能受1對顯性單基因控制。

表1 11份玉米自交系對玉米瘤黑粉病多年抗性鑒定

表2 11個F2群體對玉蜀黍黑粉菌的抗性反應(yīng)

3 小結(jié)與討論

玉米瘤黑粉病屬于土傳病害，一旦傳入就很難根除，防治起來也十分困難。玉米瘤黑粉病在整個生育期都能發(fā)生，田間噴藥也很難奏效，同時從生產(chǎn)成本和環(huán)境保護角度看，化學(xué)方法也不能作為防治玉米瘤黑粉病的首選措施。

連續(xù)2 a人工接種鑒定評價了36份玉米自交系對瘤黑粉病的抗性，共篩選到19份玉米自交系對瘤黑粉病具有抗性，占鑒定材料的52.8%，其中高抗材料11份，且抗性穩(wěn)定，感病材料17份，占鑒定材料的47.2%。這些抗病資源將會在一定程度上拓寬我國玉米抗病種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)，對我國玉米抗病資源創(chuàng)制及抗病品種培育具有重要的應(yīng)用價值。

11份高抗自交系與感病對照掖478配制雜交組合，人工接種F2群體，利用F2群體抗感表現(xiàn)型對11份高抗玉米瘤黑粉病材料進行抗性遺傳分析，結(jié)果表明，組合掖478/Z16HEB-325、掖478/Z16HEB-333、掖478/Z16HEB-339、掖478/Z16HEB-347和掖478/Z16HEB-352的F2群體抗感植株比例都符合3∶1的分離比(表2)，說明自交系Z16HEB-325、Z16HEB-333、Z16HEB-339、Z16HEB-347和Z16HEB-352對玉蜀黍黑粉菌的抗性可能受1對顯性單基因控制。

盡管質(zhì)量抗性基因和數(shù)量抗性基因有著明顯的不同，但是在某些情況下，質(zhì)量抗性基因更像是一個主效QTL[33-34]。自交系Z16HEB-325、Z16HEB-328、Z16HEB-330、Z16HEB-333、Z16HEB-342、Z16HEB-347、Z16HEB-350、Z16HEB-352和Z16HEB-356年際間感病植株百分率均有波動，而自交系Z16HEB-339和Z16HEB-349年際間感病植株百分率比較恒定，均為0.8%(表1)，但病瘤數(shù)量、病瘤大小和病瘤產(chǎn)生部位可能有差異。僅根據(jù)病情級別，自交系Z16HEB-325、Z16HEB-333、Z16HEB-339、Z16HEB-347和Z16HEB-352對瘤黑粉病的抗性可能受一對顯性單基因控制，而如果綜合考慮病情級別、病瘤大小、病瘤數(shù)量、危害程度及環(huán)境因素，自交系Z16HEB-325、Z16HEB-333、Z16HEB-339、Z16HEB-347和Z16HEB-352對瘤黑粉病的抗性也可能受少數(shù)主效QTLs控制，存在微效基因的作用。下一步將重點開展質(zhì)量單基因或主效QTL位點的定位。