綠豆種子組織培養(yǎng)的幾種滅菌方法

胡亞群，周琰琰，薛冬，韋雅雯，閆強，袁星星，陳新*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所 江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇 南京 210014)

綠豆[Vignaradiata(L．)R．Wilczek]屬于豆科(Leguminosae)、蝶形花亞科(Papilionaceae)、菜豆族(Phaseoleae)、豇豆屬(VignaSavi)作物，是主要的食用豆類之一[1]。中國綠豆種植的歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，栽培面積較大，是綠豆的起源中心之一[2]。綠豆的營養(yǎng)價值豐富，是糧菜兼用、醫(yī)食同源的經(jīng)濟作物，因蛋白含量高、脂肪含量低而受到人們的廣泛喜愛[3]。綠豆具有生育期短、耐干旱、耐瘠薄及適應(yīng)性強等特性，在農(nóng)業(yè)發(fā)展和土地養(yǎng)護方面起到重要作用[4]。

轉(zhuǎn)基因可以有效地選育抗病、抗蟲及抗除草劑的種質(zhì)資源，而轉(zhuǎn)基因育種的關(guān)鍵是組織培養(yǎng)技術(shù)，對種子的滅菌是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵前提，滅菌效果關(guān)系到種子萌發(fā)、后續(xù)幼苗的長勢及分化。對種子的滅菌不僅要殺死表面的微生物，還要減少滅菌劑對種子本身的傷害，以求得到污染率低、成活率高的外植體[5]。王棟等[6]研究發(fā)現(xiàn)，梭梭種子最佳滅菌方法為75%乙醇5 min+0.1%氯化汞8 min。王春梅等[7-8]對苜蓿種子滅菌的研究發(fā)現(xiàn)，0.1%氯化汞+10%次氯酸鈉+70%乙醇和10%次氯酸鈉+70%乙醇+1∶15潔爾滅的滅菌方法污染率最低，且后一種方法對操作人員相對安全。高雨靈等[9-11]研究證明，0.1%氯化汞是木棉種子的優(yōu)良滅菌劑[8]。但以上滅菌手段中所采用的氯化汞屬于劇毒試劑，對環(huán)境及人體有危害。

開發(fā)高效且環(huán)境友好的種子滅菌方式對組織培養(yǎng)有重要意義，很多研究者也進(jìn)行了積極的探索。侯金艷等[12]研究表明，次氯酸鈉溶液與超聲復(fù)合處理為黃連木種子滅菌的理想方法。王一珂等[13]以煙草種子為材料，研究過碳酸鈉對種子的滅菌效果及對無菌苗生長的影響，獲得了較好的滅菌效果。于倩等[14]研究表明，使用75%乙醇60 s、50%次氯酸鈉溶液30 min對白刺種子進(jìn)行處理，可獲得最好的滅菌效果。陳華濤等[15]研究表明，75%乙醇1 min+5%次氯酸鈉30 min的滅菌方法能有效降低污染率，小豆種子的萌發(fā)率也較高，綜合效果最佳。劉海坤等[16]研究表明，氯氣對大豆種子滅菌效果非常理想。

為了探究組織培養(yǎng)體系中綠豆種子滅菌的最佳方式，本研究利用75%乙醇、30%次氯酸鈉、4%過碳酸鈉和氯氣作為滅菌劑，組合搭配8種滅菌方式對綠豆種子進(jìn)行滅菌處理。對異常株數(shù)、萌發(fā)率、污染率及叢生芽分化率等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析及綜合評價，旨在選出適宜的滅菌劑及滅菌時間。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

綠豆品種為冀綠7號，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所保存。使用基本培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)用于綠豆萌發(fā)、生長情況調(diào)查及制備外植體前的萌發(fā)。綠豆分化使用B5+抗生素作為分化培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理

選取健康、飽滿、無破損、大小均勻的綠豆種子分別按照表1進(jìn)行處理。處理后的種子用無菌水沖洗3～4次，去除殘留滅菌劑。

表1 不同滅菌處理方法分組

1.2.2 種子萌發(fā)

將滅菌處理后的種子接種到MS培養(yǎng)基中，每組3瓶，每瓶10粒。每天統(tǒng)計不同處理下綠豆的萌發(fā)情況(以下胚軸露出種皮1/2種子大小記為萌發(fā))及污染情況。對生長7 d后不同處理下綠豆植株的主根長、莖長、生物量及異常株數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2.3 外植體制備

將不同處理的綠豆種子種于MS培養(yǎng)基中，加少量無菌水促進(jìn)萌發(fā)。2 d后，將綠豆的種皮剝下，用刀片切除部分下胚軸(約留子葉節(jié)以下1 mm)，沿種臍縱切豆子，將胚和子葉一分為二，使用去掉真葉和葉芽后的部分作為外植體，接種至分化培養(yǎng)基，每組3皿、每皿15個外植體。從3 d開始每隔2 d對不同處理后外植體的污染率進(jìn)行統(tǒng)計，并及時將未污染的外植體轉(zhuǎn)接至新的分化培養(yǎng)基中，用于統(tǒng)計外植體的污染情況，同時在第2周統(tǒng)計叢生芽分化率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

接種后定期觀察，統(tǒng)計萌發(fā)率、污染率及叢生芽分化率：

萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)/接種種子數(shù)×100%；污染率=污染種子數(shù)/接種種子數(shù)×100%；叢生芽分化率=叢生芽數(shù)/接種種子數(shù)×100%。

采用Excel 2019和IBM SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖。

1.4 培養(yǎng)基及滅菌劑的配制

MS培養(yǎng)基，調(diào)pH至5.8，分裝至組培瓶作為萌發(fā)培養(yǎng)基。3.16 g·L-1B5，0.59 g·L-1MES 緩沖液，30 g·L-1蔗糖配制分化培養(yǎng)基，調(diào)pH至5.7，高壓蒸汽式滅菌121 ℃ 20 min，滅菌后加1 mg·L-16-芐基腺嘌呤，100 mg·L-1特美汀，100 mg·L-1頭孢噻肟鈉，6 m·L-1草銨膦。

次氯酸鈉用30%濃度，過碳酸鈉用4%濃度。氯氣滅菌方法：將100 mL次氯酸鈉倒進(jìn)250 mL的錐形瓶中，并將裝有綠豆的平皿放入干燥器中，在干燥器蓋沿磨砂處涂抹凡士林，將蓋子邊沿留有縫隙；使用量筒量取20 mL濃HCl滴定到次氯酸鈉溶液中，留一點濃鹽酸液封，立即密封好干燥器，滅菌3、6 h；帶好手套、口罩，待滅菌完成后，將裝有滅菌綠豆的平皿放置在無菌超凈臺上吹除剩余的氯氣(30 min)，密封好滅菌好的豆子，放置備用。

1.5 處理設(shè)計

設(shè)置不同滅菌劑及時間共8組，處理后用無菌水洗3遍，接種于MS培養(yǎng)基，用于萌發(fā)長勢及污染率對比。另接種30粒左右于MS培養(yǎng)基并加少量無菌水促進(jìn)萌發(fā)，2 d后，制備外植體接種到分化培養(yǎng)基，觀察外植體的污染及分化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌方法對綠豆種子滅菌效果的比較

在所有設(shè)置的8種處理組中，只有過碳酸鈉處理的2組在綠豆萌發(fā)3 d時出現(xiàn)污染，至7 d污染率分別達(dá)到了83%和67%(表2)。這一結(jié)果表明，4%的過碳酸鈉不適合用作綠豆滅菌劑。除此之外，只有T3處理組的1個重復(fù)中出現(xiàn)了污染，其他均無污染。

2.2 不同滅菌處理對綠豆種子萌發(fā)的影響

在處理4 d時，除氯氣處理的2組(T7和T8)各有2粒未萌發(fā)外，其余6組處理均全部萌發(fā)，且這2組至7 d仍未萌發(fā)(圖1、表3)。在接種1 d時，T8處理組未萌發(fā)，而T7萌發(fā)了3%。這一結(jié)果表明，氯氣對綠豆種子傷害較大，影響其萌發(fā)，且處理時間越長，對萌發(fā)的影響越大。接種1 d時，T1、T3分別比T2、T4發(fā)芽率高且T1比T3以及T2比T4萌發(fā)率也較高，結(jié)果表明，次氯酸鈉、乙醇處理時間的延長，均會導(dǎo)致綠豆萌發(fā)的延遲。同時在接種1 d時，T5處理組的萌發(fā)率比T6高，結(jié)果表明，過碳酸鈉溶液處理時間的延長也會對綠豆的萌發(fā)產(chǎn)生影響。綜上所述，不同處理方法對綠豆萌發(fā)的影響不同，且同一種滅菌劑隨著處理時間的延長都會導(dǎo)致綠豆萌發(fā)的延遲。

表2 不同滅菌方法下綠豆種子的污染率 單位：%

圖1 綠豆種子萌發(fā)

表3 不同滅菌處理綠豆種子的萌發(fā)率單位：%

2.3 不同滅菌處理對綠豆幼苗生長的影響

T2、T4處理組中綠豆幼苗的主根長及莖長比T1、T3處理下長且生物量也不低于后者，表明在乙醇處理時間相同的條件下，次氯酸鈉滅菌時間的延長不會影響綠豆幼苗的生長(表4)。T3處理組的主根長小于T1處理，然而T4處理組的主根長及莖長大于T2處理，且這4種處理條件下綠豆幼苗生物量之間無顯著差異。此外，過碳酸鈉處理組15 min比30 min長勢好，氯氣處理組2個時間點無顯著差異。這一結(jié)果表明，過碳酸鈉處理時間的延長會影響綠豆幼苗的生長，而氯氣處理時間的長短對綠豆幼苗影響較小。

表4 不同滅菌處理對綠豆幼苗生長的影響

在綠豆萌發(fā)過程中，幾乎所有處理組中都出現(xiàn)一部分種子萌發(fā)后下胚軸生長至2～3 cm后停止發(fā)育的現(xiàn)象(圖2、圖3)。次氯酸鈉處理30 min的T2、T4組較同等乙醇處理時間的T1、T3組異常株更多，同時T1比T3處理組且T2比T4處理組的異常株數(shù)少，說明隨著乙醇和次氯酸鈉處理時間的延長，均會對綠豆的正常生長產(chǎn)生影響。因此，為了保證綠豆植株的正常生長，在控制污染率的基礎(chǔ)上，應(yīng)盡量縮短滅菌時間以降低滅菌處理對綠豆生長發(fā)育的影響。氯氣處理的T7、T8組也出現(xiàn)了33%和20%的異常株，過碳酸鈉處理的T5、T6組存在60%以上的污染及發(fā)育異常，因此，不是綠豆種子有效的滅菌劑。

柱上無相同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖4 同。圖2 綠豆萌發(fā)過程中異常株比率

圖3 綠豆種子萌發(fā)異常株

2.4 不同滅菌處理對綠豆外植體的滅菌效果比較

T5、T6、T7組污染較嚴(yán)重，都在80%以上(表5)。其中T6組污染情況最嚴(yán)重，在11 d時已經(jīng)全部污染。這一結(jié)果表明，過碳酸鈉和氯氣對綠豆種子滅菌效果較差。T2組最終污染率為4%，是8組中污染率最低的。

表5 不同滅菌處理綠豆外植體的污染率 單位：%

2.5 不同滅菌處理對綠豆外植體叢生芽分化的影響

T6處理組在統(tǒng)計之前就已全部污染，所以未統(tǒng)計其叢生芽分化率。T1～T4處理組叢生芽分化率達(dá)到60%以上，其中，T2組最高，分化率達(dá)到了82%(圖4～5)。T5、T7污染嚴(yán)重且分化率低，T8分化率為80%，但污染率較高且存在未完全萌發(fā)的狀況。因此，使用75%乙醇和30%次氯酸鈉組合對綠豆種子進(jìn)行滅菌處理能夠在控制污染條件下保證叢生芽的分化率。T2組最終污染率為4%，在8組中污染率最低(表5)。因此，用75%乙醇30 s+30%次氯酸鈉30 min對綠豆種子進(jìn)行滅菌處理是最適合的綠豆種子滅菌方法。

圖4 不同滅菌處理對綠豆外植體叢生芽分化率的影響

圖5 綠豆外植體叢生芽分化

3 小結(jié)與討論

在植物組織培養(yǎng)中，對滅菌劑的效果評價指標(biāo)最主要的是萌發(fā)、污染及外植體分化3個方面，本研究分為萌發(fā)試驗及外植體分化試驗兩大部分。從萌發(fā)試驗來看，2組用過碳酸鈉做滅菌劑的幼苗污染嚴(yán)重，氯氣滅菌會造成種子延遲萌發(fā)或不萌發(fā)。從外植體試驗來看，過碳酸鈉仍會造成大量的污染，氯氣處理組也出現(xiàn)了污染，處理3 h比6 h污染率高，且處理6 h污染率也高達(dá)38%，若要繼續(xù)延長滅菌時間，必定會引起萌發(fā)率降低及發(fā)育異常等情況。因此，本研究認(rèn)為過碳酸鈉及氯氣均不適合作為綠豆種子的滅菌劑。

乙醇加次氯酸鈉滅菌法是常用的聯(lián)合滅菌法[9]，75%乙醇+30%次氯酸鈉的滅菌方式在本研究中各項指標(biāo)均較好，單從萌發(fā)試驗來看，T2、T3的萌發(fā)速度較T1、T4高，T4存在較多異常株，可能是滅菌時間過長導(dǎo)致。外植體分化試驗中T2、T3組在外植體污染率方面較為突出，T3組在萌發(fā)試驗中存在27%的異常株，應(yīng)為乙醇滅菌時間過長導(dǎo)致，綜上所述，T2組75%乙醇30 s+30%次氯酸鈉30 min是較好的綠豆種子滅菌方式。

組織培養(yǎng)成功的重要因素是降低污染率，對外植體材料的滅菌是關(guān)鍵前提，滅菌時間短會造成污染量大，滅菌不徹底的狀況，滅菌時間過長則會導(dǎo)致萌發(fā)延遲、發(fā)育異常、分化率低等情況。氯化汞雖滅菌效果好，但毒性也大，會對種子造成傷害影響其生長[17]。4%過碳酸鈉水溶液在煙草種子中滅菌效果良好[13]，但本研究發(fā)現(xiàn)，在綠豆種子的滅菌中滅菌效果極差，污染率很高。本研究發(fā)現(xiàn)，75%乙醇30 s+30%次氯酸鈉30 min是較為安全有效的綠豆種子滅菌方式。