組蛋白去乙?；敢种苿?duì)呼吸道合胞病毒感染誘發(fā)的氣道炎性反應(yīng)作用機(jī)制

馮秋琴，黃 歡，楊 眉，田 曼

(1.珠海市婦幼保健院，廣東 珠海 519000；2.南京市兒童醫(yī)院呼吸內(nèi)科 南京 醫(yī)科大學(xué)，江蘇 南京 210008)

呼吸道合胞病毒(RSV)是毛細(xì)支氣管炎和肺炎的主要原因，除了直接損傷上皮細(xì)胞，RSV病毒感染患兒和免疫缺陷患者通常會(huì)有嚴(yán)重的呼吸道炎性反應(yīng)[1]，包括促炎因子分泌、支氣管和血管中炎性反應(yīng)細(xì)胞增加和黏液生成。針對(duì)RSV感染，診斷干預(yù)措施對(duì)臨床結(jié)局的影響不大，除了支持措施，如氧療、對(duì)癥支持外，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有具體的藥物治療方法。因此，毛細(xì)支氣管炎是一個(gè)臨床難題，是臨床及研究人員面臨的重大挑戰(zhàn)。

蛋白質(zhì)乙?；且环N重要的表觀遺傳修飾模式，在宿主防御病毒感染中起著關(guān)鍵作用。組蛋白去乙酰化酶(HDAC)是從組蛋白上的特定賴氨酸殘基去除乙?；糠忠哉{(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的酶，通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)-DNA相互作用的變化，起到控制不同的細(xì)胞功能的作用[2]。

組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)被證實(shí)在很多疾病中有抑制疾病發(fā)展的作用，HDACi起初因作為抗癌藥物的潛在用途而受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)HDACi類藥物曲古抑菌素A(TSA)對(duì)對(duì)乳腺癌細(xì)胞株增殖周期起到抑制作用[3-4]。TSA可能是調(diào)節(jié)呼吸道RSV誘導(dǎo)的毛細(xì)支氣管炎的一種新的治療方法，為臨床新治療手段提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。除具有抗癌活性外，HDAC抑制劑被發(fā)現(xiàn)還具有有效的抗炎特性，如TSA可以抑制甲肝病毒的復(fù)制從而降低丙肝感染風(fēng)險(xiǎn)[5]，其治療效果還在膿毒性休克、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化和哮喘等炎性疾病中得到證實(shí)[6-8]。而HDACi在調(diào)節(jié)呼吸道疾病中的研究除了哮喘以外其余疾病研究很少。

本研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，旨在從細(xì)胞水平探索HDACi代表藥物TSA在RSV復(fù)制中的功能，并確定TSA對(duì)RSV病毒炎性反應(yīng)的影響及對(duì)氧化應(yīng)激的影響。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料：化學(xué)品和材料：人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B購(gòu)自American Type Culture Collection(ATCC；Rockville，MD，USA)；藥品TSA、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)購(gòu)自St.Louis，MO，USA；細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Carlsbad，CA，USA；白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)自Shanghai Ex Cell Biology Inc(中國(guó)上海)；丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)ELISA試劑盒購(gòu)自 Jiancheng Bioengineering Institute(中國(guó)南京)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、RSV病毒處理和藥物毒力檢測(cè)：人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B在補(bǔ)充有胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)[9]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將BEAS-2B細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏蠕伆逵糜隗w外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，并在實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞生長(zhǎng)36 h，后使用各種劑量[感染復(fù)數(shù)(MOI= 5、1、0.5、0.1、0.01)]RSV進(jìn)行感染處理，再將指定濃度的TSA加入培養(yǎng)的BEAS-2B中，以確定TSA對(duì)細(xì)胞活力的影響，進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定的目的是確定藥物TSA對(duì)培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞的潛在毒性作用。可見(jiàn)用500 nmol/L TSA處理BEAS-2B細(xì)胞不影響細(xì)胞生長(zhǎng)活力，表明TSA抗病毒作用不是由于細(xì)胞毒性作用。

1.2.2Western印跡檢測(cè)RSV作用后的BEASE-2B細(xì)胞HDAC2水平變化：體外培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞生長(zhǎng)36 h，本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為對(duì)照組和不同劑量RSV處理組，用不同劑量的RSV(MOI=5、1、0.5、0.1、0.01)感染BEAS-2B細(xì)胞，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析評(píng)估各組HDAC2的表達(dá)水平。

1.2.3Western印跡檢測(cè)TSA作用RSV感染后的BEASE-2B細(xì)胞乙?；M蛋白(Ac-H3)水平變化：體外培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B，在實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞生長(zhǎng)36 h，本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為對(duì)照組、TSA處理組、RSV處理組、藥物TSA+RSV病毒處理組，首先運(yùn)用Western印跡檢測(cè)不同劑量RSV病毒高劑量[(MOI=1)或低劑量(MOI= 0.1)]對(duì)細(xì)胞乙?；M蛋白表達(dá)的影響，后用TSA處理RSV感染的BEAS-2B細(xì)胞[高劑量(MOI=1)或低劑量(MOI=0.1)]，24 h后運(yùn)用蛋白印跡方法檢測(cè)藥物TSA加入后對(duì)RSV感染誘導(dǎo)的Ac-H3的表達(dá)水平。

1.2.4聚合酶鏈反應(yīng)(q-PCR)技術(shù)檢測(cè)HDACi兩種代表藥物TSA/SAHA對(duì)RSV病毒復(fù)制的影響：體外培養(yǎng)BEASE-2B細(xì)胞，將BEAS-2B細(xì)胞與500 nmol/L TSA或SAHA預(yù)孵育，RSV濃度MOI設(shè)置為0.5，處理24 h，通過(guò)q-PCR技術(shù)方法測(cè)定RSV病毒復(fù)制水平。

1.2.5ELISA檢測(cè)炎性因子、氧化應(yīng)激因子水平：體外培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B，在實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞生長(zhǎng)36 h，用500 nmol/L TSA處理BEAS-2B細(xì)胞，并用各種劑量的RSV(MOI = 0.1或1)感染BEAS-2B，在感染后24 h收獲細(xì)胞上清液，通過(guò)ELISA測(cè)量IL-6和IL-8的產(chǎn)生。同時(shí)使用特定試劑盒測(cè)量氧化應(yīng)激相關(guān)分子(MDA與NO)釋放。

2 結(jié)果

2.1RSV感染通過(guò)影響HDAC2表達(dá)改變組蛋白乙酰化水平:RSV感染的BEAS-2B細(xì)胞以MOI依賴性方式導(dǎo)致HDAC2的表達(dá)增加(見(jiàn)圖1)。為了分析RSV感染誘導(dǎo)異常HDAC2表達(dá)是否是直接改變的組蛋白乙?；^(guò)程，將TSA用于RSV感染的氣道上皮細(xì)胞(AEC)，結(jié)果顯示，用500 nmol/L TSA處理RSV感染的氣道上皮細(xì)胞導(dǎo)致HDAC2表達(dá)顯著降低，其與組蛋白H3乙酰化水平呈反相關(guān)關(guān)系(見(jiàn)圖2)。該結(jié)果表明RSV誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞中的組蛋白乙?；惓Ｊ峭ㄟ^(guò)改變HDAC2的表達(dá)，并且這種作用被去乙?；敢种苿㏕SA逆轉(zhuǎn)。

圖1 RSV感染通過(guò)影響HDAC2表達(dá)改變組蛋白乙酰化水平

圖2 TSA處理RSV感染的BEAS-2B細(xì)胞測(cè)定Ac-H3表達(dá)

2.2HDACi可抑制RSV復(fù)制:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用TSA及SAHA處理RSV感染的BEAS-2B細(xì)胞病毒復(fù)制水平分別為(3.62±1.22)PFO/ml和(3.40±1.03)PFO/ml，較未干預(yù)BEAS-2B細(xì)胞病毒復(fù)制水平[(4.65±1.02)PFO/ml]明顯降低，表明均可顯著抑制RSV感染，表明HDACi可抑制RSV復(fù)制。

2.3用HDACi處理BEAS-2B細(xì)胞降低RSV誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子釋放和氧化應(yīng)激水平:RSV感染氣道上皮細(xì)胞24 h后IL-6和IL-8釋放增加，而運(yùn)用TSA預(yù)處理的組BEAS-2B細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的IL-6和IL-8產(chǎn)生明顯減少(見(jiàn)表1)。另外，結(jié)果顯示RSV感染會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激分子NO和MDA的釋放，用HDACi類藥物TSA處理減輕這一損傷(見(jiàn)表2)。表明TSA可以抑制RSV誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子的釋放和氧化應(yīng)激損傷。

表1 ELISA測(cè)量IL-6、IL-8釋放水平

表2 測(cè)定氧化應(yīng)激相關(guān)分子(MDA、NO)水平

3 討論

盡管進(jìn)行了深入研究，RSV感染的病理機(jī)制仍不清楚。其中一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是RSV感染后出現(xiàn)不同臨床癥狀的個(gè)體，有些人只有輕微的上呼吸道感染癥狀，不需要特殊治療，而在另一些人中，RSV感染可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的疾病，包括毛細(xì)支氣管炎或肺炎，這些疾病可能致命，需要住院治療[10]。

HDAC在基因表達(dá)調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，因?yàn)樗ㄟ^(guò)乙酰化和去乙酰化組蛋白來(lái)調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，作為組蛋白乙?；闹饕{(diào)節(jié)劑，HDAC是轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，之前研究證實(shí)組蛋白乙酰化控制某些病毒感染[11]。在感染人類的諸多病原體中，HDAC與病毒復(fù)制和發(fā)病有關(guān)，包括皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、柯薩奇病毒、乙型肝炎、丙肝病毒(HCV)和人類免疫缺陷病毒HIV-1[12]。如在HCV感染期間，HDACi SAHA通過(guò)改變宿主細(xì)胞中基因(如OPN和Apo-A1)的表達(dá)而對(duì)HCV復(fù)制發(fā)揮抑制作用。在本研究中，目的是確定組蛋白乙?；欠裨赗SV復(fù)制和病毒誘導(dǎo)的氣道炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起作用。

研究發(fā)現(xiàn)HDAC2對(duì)于肺部氣道炎性反應(yīng)的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。HDAC2的異常表達(dá)介導(dǎo)了哮喘或慢性阻塞性肺病(COPD)患者甾體抗性作用[13]。鑒于嚴(yán)重的RSV感染誘發(fā)的毛細(xì)支氣管炎、哮喘和COPD存在密切關(guān)系，本文首先分析RSV感染對(duì)HDAC2表達(dá)的影響，證明了RSV引起HDAC2表達(dá)增加，并且RSV感染后組蛋白H3乙酰化被下調(diào)，用TSA治療RSV感染的氣道上皮細(xì)胞完全逆轉(zhuǎn)了這些作用。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞AEC暴露于TSA預(yù)處理后，觀察到RSV病毒復(fù)制明顯減少?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明RSV對(duì)HDAC2表達(dá)的上調(diào)可能是促進(jìn)病毒復(fù)制的重要機(jī)制，而組蛋白乙?；脑鰪?qiáng)水平可以抑制病毒復(fù)制。

HDAC抑制劑在體外和體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)具有發(fā)揮抗炎的作用。本研究發(fā)現(xiàn)使用TSA或SAHA可顯著減輕RSV誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括IL-6和IL-8。另外，氧化應(yīng)激相關(guān)因子可能由氣道上皮細(xì)胞AEC和氣道內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，參與多種形式的組織損傷，包括對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等細(xì)胞成分的損害[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，RSV感染可以誘導(dǎo)AEC活性氧(ROS)的產(chǎn)生[15]，抗氧化酶的表達(dá)和活性降低可能有助于減輕這種損傷。在本研究中，RSV感染的AEC中NO、MDA產(chǎn)生明顯增加，說(shuō)明抑制氧化應(yīng)激作用也是HDACi類藥物在RSV感染過(guò)程中發(fā)揮的作用機(jī)制之一。

從本研究中可進(jìn)一步從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)延伸到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)甚至是臨床患者相關(guān)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確和驗(yàn)證去乙?；敢种苿〩DACi在RSV誘導(dǎo)的氣道炎性反應(yīng)中的作用機(jī)制，為HDACi類藥物將來(lái)進(jìn)入臨床治療呼吸道疾病提供重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。