益生菌調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫研究進(jìn)展

王 濤，田欣蕾，張 迪，李 娜，錢(qián)愛(ài)東，單曉楓，王春鳳，張冬星*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118;2.牡丹江市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，黑龍江 牡丹江 157020)

黏膜免疫系統(tǒng)作為抵御病原微生物入侵的第一道生理屏障，能阻止病原微生物和抗原等物質(zhì)通過(guò)黏膜位點(diǎn)侵入宿主。腸道作為巨大的免疫細(xì)胞庫(kù)，可識(shí)別外來(lái)抗原并抵御微生物入侵。此外，腸免疫細(xì)胞及其分泌的黏液可作為調(diào)節(jié)黏膜免疫功能的生物屏障，在阻斷病原侵襲過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)作用。上皮細(xì)胞通過(guò)病原識(shí)別受體將來(lái)自微生物群的信號(hào)傳遞給黏膜免疫細(xì)胞從而降低抗原與免疫細(xì)胞的過(guò)度接觸，進(jìn)而調(diào)節(jié)黏膜感染、炎癥和穩(wěn)態(tài)等相關(guān)免疫反應(yīng)[1]。腸道微生物與腸上皮免疫細(xì)胞的互作對(duì)腸道免疫穩(wěn)態(tài)具有重要意義。諸多研究證實(shí)，益生菌具有免疫調(diào)節(jié)特性，能改善黏膜上皮屏障功能，調(diào)節(jié)腸道菌群，并增強(qiáng)黏膜固有層中免疫相關(guān)細(xì)胞的活性，修復(fù)上皮細(xì)胞炎癥并增強(qiáng)黏膜免疫功能[2]。據(jù)報(bào)道，腸道菌群與宿主健康、疾病密切相關(guān)，益生菌在調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、代謝及免疫學(xué)等領(lǐng)域中發(fā)揮作用，因此對(duì)研究腸道菌群具有重要意義[3]。

1 黏膜上皮屏障

1.1 柱狀上皮細(xì)胞柱狀腸上皮細(xì)胞是絨毛上皮中的主要細(xì)胞之一，其功能是吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并維持黏膜屏障的完整性。此外，由緊密連接相關(guān)蛋白、封閉蛋白及連接黏附分子組成的緊密連接分布于腸上皮細(xì)胞間隙，能阻止親水溶質(zhì)與細(xì)菌進(jìn)入黏膜固有層。細(xì)胞間緊密連接的破壞會(huì)增加上皮細(xì)胞通透性，導(dǎo)致共生微生物移位至黏膜固有層，其代謝產(chǎn)物可能會(huì)引起宿主急性或慢性炎癥反應(yīng)。上皮細(xì)胞通過(guò)與淋巴細(xì)胞、微生物之間的相互作用，可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和相關(guān)免疫細(xì)胞，激活局部黏膜免疫應(yīng)答從而有效緩解炎癥與感染[4]。

1.2 杯狀細(xì)胞杯狀細(xì)胞是分泌型腸上皮細(xì)胞，可分泌黏液覆蓋于黏膜表面，利于腸黏膜潤(rùn)滑和內(nèi)容物轉(zhuǎn)運(yùn)。黏液層能有效防止細(xì)菌與上皮細(xì)胞表面過(guò)度接觸，進(jìn)而減少病原的侵襲感染。黏液中富含黏蛋白，此類蛋白可自主形成保護(hù)性黏液層，覆蓋于上皮細(xì)胞表面[5]。腸內(nèi)共生菌可誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白并調(diào)節(jié)共生菌比例。黏蛋白2(mucin 2,MUC2)是杯狀細(xì)胞分泌最豐富的黏蛋白之一[4]。OLIVIER等[6]利用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型探究腸上皮細(xì)胞對(duì)特異性AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的保護(hù)機(jī)制，該研究發(fā)現(xiàn)杯狀細(xì)胞的數(shù)量依賴于muc2基因表達(dá)的調(diào)控。

杯狀相關(guān)抗原通道(goblet-associated antigen passages,GAPs)是杯狀細(xì)胞具有非專職抗原遞呈細(xì)胞作用的通道(圖1)。研究證實(shí)，當(dāng)小鼠缺乏杯狀細(xì)胞時(shí)，樹(shù)突細(xì)胞顯示出對(duì)T細(xì)胞的管腔抗原呈遞減少[7]。GAPs利用杯狀細(xì)胞將腔內(nèi)可溶性低相對(duì)分子質(zhì)量的抗原傳遞至腸上皮表面的樹(shù)突細(xì)胞。

圖1 腸黏膜免疫細(xì)胞

1.3 Paneth細(xì)胞Paneth細(xì)胞位于小腸隱窩底部干細(xì)胞間隙，是腸道黏膜防御系統(tǒng)中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞之一。Paneth細(xì)胞產(chǎn)生的抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)分布于黏液層中，可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物群的結(jié)構(gòu)與豐度保護(hù)腸道上皮免受外來(lái)病原體的侵害。防御素家族蛋白中α-防御素(在小鼠中也稱為隱窩蛋白)在Paneth細(xì)胞中表達(dá)量最高，其中α-防御素5和α-防御素6已被證實(shí)可激活黏膜免疫反應(yīng)[8]。AYABE等[9]研究表明，健康小鼠腸道隱窩中防御素質(zhì)量濃度可達(dá)15～100 g/L，高于體外最小殺菌濃度1 000倍，該結(jié)果表明防御素可能在維持腸隱窩無(wú)菌環(huán)境與保護(hù)局部干細(xì)胞等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

此外，Paneth細(xì)胞中的髓樣分化因子(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)可調(diào)節(jié)胰島再生源蛋白(regenerating islet-derived protein,Reg)家族RegⅢγ的產(chǎn)生。RegⅢ家族蛋白是C型凝集素，其通過(guò)與細(xì)胞壁肽聚糖結(jié)合形成六聚體膜透性寡聚孔，從而對(duì)革蘭陽(yáng)性菌產(chǎn)生抗菌作用。據(jù)報(bào)道，小鼠體內(nèi)缺乏RegⅢγ會(huì)導(dǎo)致自發(fā)性結(jié)腸炎[10]。

1.4 Tuft細(xì)胞Tuft細(xì)胞在腸道抗寄生蟲(chóng)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可在寄生蟲(chóng)感染期間迅速做出黏膜免疫應(yīng)答。SPITS等[11]和GERBE等[12]研究發(fā)現(xiàn)，隨著蠕蟲(chóng)感染和過(guò)敏原沉積，導(dǎo)致Tuft細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量迅速增加，同時(shí)促進(jìn)了小鼠腸道內(nèi)Tuft細(xì)胞分泌IL-25，通過(guò)激活局部2型固有淋巴細(xì)胞(type 2 innate lymphoid cells,ILC2s)分泌IL-13，誘導(dǎo)黏蛋白產(chǎn)生從而有效清除蠕蟲(chóng)。

1.5 微褶皺細(xì)胞(M細(xì)胞)腸上皮含有多個(gè)用于主動(dòng)跨細(xì)胞或攝取腔內(nèi)微生物的細(xì)胞通道和途徑。位于派伊爾氏集合淋巴小結(jié)(Peyer’s patch,PP)的濾泡相關(guān)上皮(follicle associated epithelial,FAE)中的M細(xì)胞是跨細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)和啟動(dòng)抗原特異性反應(yīng)的核心細(xì)胞。M細(xì)胞具有頂部短而不規(guī)則微絨毛的特征，該結(jié)構(gòu)易于接觸腸腔內(nèi)抗原[13]。

M細(xì)胞可將抗原從腸腔遞呈至下方的淋巴組織從而誘導(dǎo)黏膜免疫。此外，具有胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用的M細(xì)胞和基底外側(cè)淋巴細(xì)胞能將大分子物質(zhì)從腸腔遞呈至PP內(nèi)部[14]。如圖1所示PP結(jié)中的樹(shù)突狀細(xì)胞可通過(guò)M細(xì)胞的跨細(xì)胞孔進(jìn)入腸腔，表明該過(guò)程需要抗原遞呈細(xì)胞和處理細(xì)胞(分別為M細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞)之間的相互作用，以協(xié)調(diào)抗原從腸腔到PP結(jié)內(nèi)，從而啟動(dòng)抗原特異性黏膜免疫反應(yīng)(如分泌特異性sIgA)[15]。

研究表明，小鼠感染腸沙門(mén)菌(Salmonellaenterica)后，M細(xì)胞的糖蛋白2(glycoprotein 2,GP2)作為抗原攝取受體可通過(guò)激活T細(xì)胞來(lái)促進(jìn)黏膜免疫反應(yīng)[16]。HASK等[17]構(gòu)建重組菌株攜帶GP2，使得細(xì)菌抗原有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至M細(xì)胞中并啟動(dòng)抗原特異性黏膜免疫反應(yīng)。SHIMA等[18]將抗GP2融合蛋白(鏈霉親和素與抗鼠GP2抗體的抗原結(jié)合區(qū)融合)與鼠傷寒沙門(mén)菌的生物素化裂解物共同給藥可有效誘導(dǎo)黏膜免疫反應(yīng)。

1.6 腸內(nèi)分泌細(xì)胞腸內(nèi)分泌細(xì)胞可分泌多種激素，約占腸上皮細(xì)胞總數(shù)的1%。腸嗜鉻細(xì)胞(enterochromaffin cells,EC)是腸內(nèi)分泌細(xì)胞的最大群體，可合成并釋放5羥色胺(5-HT)，EC細(xì)胞含有人體90%以上的5-HT。SPOHN等[19]發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)5-HT4上皮細(xì)胞的激活可有效保護(hù)黏膜組織并促進(jìn)損傷組織修復(fù)。在健康動(dòng)物中阻斷5-HT4會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸炎和腸道屏障細(xì)菌移位。SHAJIB等[20]研究表明,5-HT受體可在多數(shù)免疫細(xì)胞中表達(dá)，蠕蟲(chóng)感染后5-HT水平增加可通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞激活先天免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

1.7 共生菌群共生微生物群統(tǒng)稱為腸道微生物區(qū)系，可激活腸道免疫系統(tǒng)保護(hù)宿主免受病原菌的干擾。共生菌在腸道相關(guān)淋巴組織(gut associated lymphoid tissue,GALT)內(nèi)定居，也被稱為淋巴組織駐留共生菌(lymphoid-tissue-resident commensal bacteria,LRC)。LRC在發(fā)展和維持與協(xié)調(diào)腸黏膜免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。LRC通過(guò)遞呈細(xì)胞(dendritic cell,DC)，刺激天然淋巴細(xì)胞ILC3，隨后誘導(dǎo)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cells,ILCs)分泌抗菌肽。因此，LRC通過(guò)間接刺激抗菌肽的產(chǎn)生來(lái)維持免疫反應(yīng)[21]。

共生細(xì)菌可誘導(dǎo)腸道產(chǎn)生分泌型免疫球蛋白(secretory Immunoglobulin A,sIgA)。該抗體由固有層漿細(xì)胞產(chǎn)生，是腸黏膜免疫系統(tǒng)特有的免疫球蛋白[22]。sIgA通過(guò)結(jié)合病原體表面抗原并中和其毒素進(jìn)而保護(hù)腸道屏障，也能限制致病菌穿越腸上皮細(xì)胞引發(fā)的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，sIgA也可通過(guò)抑制病原生物膜形成，預(yù)防上皮屏障的細(xì)菌易位。

2 益生菌

益生菌是指“當(dāng)給予適宜的量時(shí)，賦予宿主健康益處的活微生物”。益生菌可防止病原體定殖和黏膜感染。另一方面，還可通過(guò)穩(wěn)定腸黏膜、增加黏液分泌和改善腸道蠕動(dòng)來(lái)保護(hù)并治療腸道疾病。本團(tuán)隊(duì)在健康鯽魚(yú)中分離出具有優(yōu)良特性的貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，口服接種鯽魚(yú)后上調(diào)了腸道、頭腎等組織中IL-1β、IL-10及TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)水平，且促進(jìn)了血清與腸黏液中特異性免疫球蛋白IgM的分泌。研究結(jié)果表明，該菌通過(guò)維持腸道屏障功能可有效抵御致病性維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)的感染(保護(hù)率75.0%)[23]。

多種益生菌具有保守的微生物相關(guān)分子模式，可被某些模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRRs)識(shí)別并激活信號(hào)通路，同時(shí)也可誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子和其他效應(yīng)分子的產(chǎn)生，從而激活宿主的免疫反應(yīng)[24](表1)。在養(yǎng)殖中應(yīng)用益生菌可有效改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能、免疫應(yīng)答和抗病性，被視為抗生素的替代品之一。

表1 益生菌的相關(guān)免疫作用

傳統(tǒng)益生菌在預(yù)防或治療疾病中的主要限制是其定植能力低，與病原體競(jìng)爭(zhēng)和發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的能力較弱[32]。為克服傳統(tǒng)益生菌的局限性，近年來(lái)諸多研究開(kāi)發(fā)了新功能型益生菌作為疫苗或藥物遞送載體，用于致病菌的預(yù)防或治療領(lǐng)域。這類益生菌具備以下優(yōu)點(diǎn)：(1)能夠在黏膜表面定植；(2)對(duì)胃酸和腸液具有較強(qiáng)耐受性，使其能夠長(zhǎng)期存活于消化道環(huán)境；(3)持續(xù)定植并持續(xù)表達(dá)保護(hù)性抗原提供長(zhǎng)期保護(hù)[33]。

DROLIA等[34]研究發(fā)現(xiàn)，使用靶向病原體基因產(chǎn)物可增強(qiáng)益生菌對(duì)黏膜表面的黏附能力，達(dá)到與病原菌競(jìng)爭(zhēng)黏附位點(diǎn)的目的。通過(guò)構(gòu)建重組副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)，表達(dá)單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)的黏附蛋白基因，進(jìn)而降低致病性Lm 的黏膜定植和全身擴(kuò)散，顯著提高了小鼠存活率。PICHET等[31]對(duì)大腸桿菌Nissle 1917(EscherichiacoliNissle 1917,EcN)進(jìn)行基因工程改造，觀察到工程益生菌EcN對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的保護(hù)作用增強(qiáng)，并促進(jìn)上皮修復(fù)和緊密連接蛋白的表達(dá)。

3 益生菌的作用機(jī)制

3.1 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)體內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)被視為益生菌預(yù)防病原體侵襲的主要方式之一。腸道上皮細(xì)胞表面的一些受體可與表達(dá)黏附相關(guān)蛋白的益生菌相結(jié)合進(jìn)而與病原菌競(jìng)爭(zhēng)受體結(jié)合位點(diǎn),可拮抗病原體并減少定植[35]。DROLIA等[32]利用工程乳酸桿菌益生菌(bioengineeredLactobacillusprobiotics,BLP)在干酪乳桿菌表面表達(dá)Lm黏附蛋白(Listeriaadhesion protein,LAP)(圖2)，結(jié)果證實(shí)BLP菌株在腸道內(nèi)可持續(xù)定植，并減少李斯特菌的黏膜定植和系統(tǒng)性擴(kuò)散，提高小鼠免存活率。此外，研究發(fā)現(xiàn)工程菌表達(dá)的黏附蛋白能與宿主腸上皮細(xì)胞受體熱休克蛋白60(heat shock protein60,Hsp60)互作，競(jìng)爭(zhēng)性地排斥致Lm，并通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路和肌球蛋白輕鏈激酶介導(dǎo)的主要上皮連接蛋白的重新分布來(lái)改善致病性Lm引起的腸屏障功能障礙。

圖2 BLP通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)預(yù)防致病李斯特菌的感染[32]

3.2 調(diào)節(jié)黏液層腸上皮細(xì)胞由黏液層覆蓋，避免過(guò)量細(xì)菌黏附于上皮細(xì)胞，從而防止其侵入黏膜固有層引發(fā)炎癥。特定的益生菌已被證明可調(diào)節(jié)黏蛋白的表達(dá)，從而影響?zhàn)ひ簩拥慕Y(jié)構(gòu)，并間接調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)。MACK等[36]研究報(bào)道，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)299v菌株能抑制致病性大腸桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞HT-29的黏附作用。Lactobacillusplantarum299v可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌黏蛋白，減少腸道致病菌與黏膜上皮細(xì)胞的結(jié)合數(shù)量。此外，益生菌EcN也被證實(shí)可改變黏蛋白基因的表達(dá)，特別是可提升HT-29細(xì)胞中MUC2、MUC3和MUC5AC基因的表達(dá)水平[37]。

3.3 調(diào)節(jié)緊密連接腸黏膜上皮外部環(huán)境和宿主免疫系統(tǒng)之間建立的物理屏障，能有效保護(hù)宿主免受外界威脅。黏膜上皮的完整性依賴緊密連接TJs(tight junctions,TJs)的多蛋白復(fù)合體。在TJ蛋白的表達(dá)或定位改變后，腸道物理屏障的功能被破壞，導(dǎo)致腸道通透性升高，誘發(fā)腸道疾病如炎癥性腸道疾病(inflammatory bowel disease,IBD)、腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)和糜爛性疾病。UKENA等[38]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌EcN1917能持續(xù)定植于小鼠腸道，促進(jìn)小鼠腸上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)。將其應(yīng)用于小鼠結(jié)腸炎模型時(shí)，可觀察到ZO-1表達(dá)顯著上調(diào)，通過(guò)調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞間通透性而改善腸上皮的屏障功能。鼠李糖乳桿菌LGG(LactobacillusrhamnosusLGG)對(duì)腸出血性大腸桿菌O157:H7感染具有保護(hù)作用，經(jīng)LGG處理的上皮細(xì)胞可使其保持表達(dá)較高水平的ZO-1[39]。

3.4 調(diào)節(jié)免疫與炎癥先天免疫反應(yīng)作為抗感染的第一道防線，保護(hù)宿主機(jī)體免受傳染病感染。LABARRERE等[40]研究發(fā)現(xiàn)飼喂丁酸梭菌的虹鱒魚(yú)可通過(guò)改變白細(xì)胞吞噬活性抵御弧菌感染。本團(tuán)隊(duì)以魚(yú)源干酪乳桿菌CC16為遞送載體構(gòu)建表達(dá)維氏氣單胞菌外膜蛋白基因(OmpAI)的工程益生菌，將其接種鯉魚(yú)后可促進(jìn)腸道、頭腎等組織內(nèi)炎性細(xì)胞因子IL-β、IFN-γ及TNF-α基因表達(dá)，并能有效抵御維氏氣單胞菌的感染[41]。為進(jìn)一步提升工程菌的免疫效果，項(xiàng)目組在此基礎(chǔ)上插入鯉魚(yú)補(bǔ)體基因C5-I，使其作為分子佐劑與外膜蛋白融合表達(dá)，結(jié)果顯示新型工程菌可顯著提升魚(yú)類的局部黏膜免疫應(yīng)答[42]。

此外，干酪乳桿菌Shirota可通過(guò)抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的小鼠慢性IBD細(xì)胞中IL-6和IFN-γ的合成而發(fā)揮抗炎作用[43]。德氏乳桿菌對(duì)大腸固有層單核細(xì)胞NF-κB通路具有抑制作用，在接受益生菌治療之后，可抑制小鼠潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)疾病擴(kuò)散并且防止黏膜侵襲[44]。用含有嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和鏈球菌的復(fù)合益生菌產(chǎn)品治療2個(gè)月后，顯示益生菌可通過(guò)降低促炎因子IL-1β的表達(dá)，提升抗炎因子IL-10的表達(dá)及特異性抗體的分泌，緩解UC癥狀及結(jié)腸黏膜的損傷[45]。

4 展望

腸上皮屏障包括柱狀上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和Paneth細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，對(duì)腸道免疫穩(wěn)態(tài)平衡具有重要作用。腸道黏膜由黏蛋白覆蓋以抵御腸腔內(nèi)病原菌。抗菌肽和sIgA可刺激腸道免疫反應(yīng)，M細(xì)胞和杯狀細(xì)胞攝取的微生物轉(zhuǎn)移至腸組織則促進(jìn)了黏膜免疫反應(yīng)。腸道內(nèi)的共生菌群可調(diào)節(jié)局部黏膜免疫應(yīng)答。研究人員需進(jìn)一步探究腸道共生微生物群的關(guān)鍵作用，并對(duì)益生菌與黏膜免疫之間的相互關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)性研究，為益生菌治療、修復(fù)黏膜上皮屏障機(jī)制等研究提供基礎(chǔ)。而對(duì)宿主和病原體互作研究的不斷深入，也促進(jìn)了用于新型靶向工程益生菌的開(kāi)發(fā)。還可研究篩選更加有效的分子佐劑及受體靶向型益生菌，提高工程菌的抗原遞呈能力與異源蛋白表達(dá)量。另外，此類工程菌應(yīng)用抗生素作為篩選標(biāo)記的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，易造成抗性基因轉(zhuǎn)移、威脅生態(tài)環(huán)境等風(fēng)險(xiǎn)。目前，利用無(wú)痕突變技術(shù)(例如溫敏型質(zhì)粒pG+host9，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)整合和敲除靶標(biāo)基因)基因組編輯系統(tǒng)構(gòu)建工程菌是未來(lái)微生態(tài)制劑研發(fā)的重要方向之一。此外，工程菌株在人體或動(dòng)物臨床中的應(yīng)用，可能受宿主飲食習(xí)慣和腸道菌群等多方面因素的影響。因此，全面開(kāi)發(fā)安全、有效的工程益生菌，將為腸道相關(guān)疾病的治療和預(yù)防提供更好的選擇。