4例CHARGE綜合征新生兒的臨床表現(xiàn)及CHD7基因突變分析

魯藝，李紅，易麗君，段芳芳，蔣文星，胡清華

（江西省兒童醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，南昌 330006）

CHARGE綜合征（OMIM 214800）是一種常染色體顯性遺傳疾病，發(fā)病率大約在1/8500~1/15000[1]。以眼部缺損、心臟疾病、后鼻孔閉鎖、生長發(fā)育遲緩、泌尿生殖系統(tǒng)缺陷/性腺功能減退以及耳部畸形/耳聾為主要臨床癥狀[2-3]，腎臟異常、唇/腭裂和氣管食管瘺等也被頻繁報道[4]。CHD7基因是主要的致病基因，CHD7突變大約占總病例的60%[5]，并且在嚴(yán)格符合Blake或Verloes診斷標(biāo)準(zhǔn)[5-6]的患者中有90%~95%攜帶CHD7變異體[6]。因此，2016年Hale等人[7]建議將CHD7基因變異加入到主要診斷標(biāo)準(zhǔn)中，致病性CHD7突變加一個主要表現(xiàn)即可診斷CHARGE綜合征。隨著分子檢測技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的可疑病例可以及時得到基因檢測[8-9]，通過了解CHARGE綜合征的不同基因型，可以為愈來愈多的CHD7突變體明確基因型與表型的關(guān)聯(lián)；通過CHD7突變患兒臨床表型的分析，亦可以擴(kuò)大CHARGE綜合征的臨床表型。目前，國內(nèi)CHARGE綜合征報道相對較少，本文報道本院2018年至2019年收治的4例攜帶CHD7基因突變的患兒，對他們臨床表現(xiàn)進(jìn)行總結(jié)及CHD7基因突變進(jìn)行分析，以增加臨床醫(yī)生對CHARGE綜合征發(fā)展和臨床表現(xiàn)的了解，并及時診斷，從而更及時地進(jìn)行臨床護(hù)理和獲得基因咨詢。

1 對象與方法

1.1 對象 回顧性病例總結(jié)。納入2017年1月至2019年12月本院收治的4例（男1例、女3例）存在CHD7基因突變患兒為研究對象。正常組為265名新生兒常見遺傳病基因篩查樣本，患兒父母均簽署知情同意書，研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：JXSETYY-YXKY-20180015）。

1.2 方法 高通量測序及父母Sanger驗(yàn)證：采集患兒及父母靜脈血樣，提取患兒基因組DNA，使用Tagment DNA enzyme酶 切法(Illumina)將DNA打斷為100~200bp片段。采用IDTxGenExome V2全外顯子試劑盒(IDT)對靶向20000+目標(biāo)基因的外顯子區(qū)域進(jìn)行富集捕獲。捕獲文庫經(jīng)過Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument(Agilent)質(zhì)檢，確認(rèn)合格后采用Illumina Novaseq6000(Illumina)高通量測序儀測序。下機(jī)后測序原始數(shù)據(jù)以FastQC軟件進(jìn)行質(zhì)控分析，后續(xù)進(jìn)一步采用Sentieon(Sentieon)比對軟件將測序序列與人類基因組參考序列(GRch37/hg19)比對并分析單核苷酸變異和插入/缺失，最后將VCF格式的變異文件導(dǎo)入至FLIMS系統(tǒng)(Fulgent Genetics)，對變異位點(diǎn)根據(jù)致病性、表型和家系遺傳模式進(jìn)行篩選。通過ACMG標(biāo)準(zhǔn)對全部變異進(jìn)行分級。而后提取先證者父母的外周血DNA，對二代測序中檢測出的致病、可能致病與臨床意義不明3類突變位點(diǎn)進(jìn)行父母Sanger測序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 二代測序結(jié)果及父母Sanger驗(yàn)證結(jié)果4例先證者CHD7基因分別存在c.686ldelC(p.Y2288Tf-sTer9)、c.7192C>G(p.R2398G)、c.1366C>T(p.Q456X)和c.5210+3A>G雜合變異（見圖1）。Sanger測序驗(yàn)證結(jié)果顯示4例患兒的父母均未攜帶上述變異，4例先證者變異均為新發(fā)突變（見圖2）。c.686ldelC(p.Y2288TfsTer9)變異會導(dǎo)致所編碼的氨基酸提前截短，影響蛋白的正常功能，查閱HGMD數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)，該變異為未報道的新變異；c.7192C>G[10]、c.1366C>T[4]以及c.5210+3A>G[11]均已被報道過。在265名正常對照中未檢測到以上變異。本文報道的4個突變位點(diǎn)的區(qū)域均位于高度保守區(qū)（見圖3），故本文報道的變異區(qū)域在脊椎動物中可能具有重要作用，該區(qū)域的變更可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

圖1 CHD7蛋白結(jié)構(gòu)示意圖[12]CH：chromo結(jié)構(gòu)域；SNF2：ATP酶或解旋酶結(jié)構(gòu)域；Helicase_C：解旋酶結(jié)構(gòu)域；SANT：SANT結(jié)構(gòu)域；BRK：BRK結(jié)構(gòu)域。紅色箭頭為本文4例患兒氨基酸突變位置。

圖2 Sanger驗(yàn)證測序結(jié)果A,C和E分別為患兒1，患兒1父親和患兒1母親的測序圖；B,D和F分別為患兒2，患兒2父親和患兒2母親的測序圖；G,I和K分別為患兒3，患兒3父親和患兒3母親的測序圖；H,J和L分別為患兒4，患兒4父親和患兒4母親的測序圖。箭頭示基因變異位點(diǎn)，4例先證者的父母均未檢測到CHD7基因突變。

圖3 不同種屬間CHD 7蛋白序列保守性分析 蛋白質(zhì)序列下面的（*）表示保守序列、（:）表示保守變體、（.）表示半保守變體、（）表示非保守序列。紅色箭頭處分別為本文4例患兒突變位點(diǎn)。

2.2 臨床診斷分析及臨床癥狀特點(diǎn) 依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及Hale診斷標(biāo)準(zhǔn)，本文聯(lián)合臨床癥狀與基因檢測對本院4例存在CHD7基因突變患兒進(jìn)行診斷，其中3例可診斷為CHARGE綜合征，患兒2雖有檢測到CHD7基因可疑致病變異，但臨床癥狀不明顯，還不足以診斷為CHARGE綜合征。4例患兒臨床癥狀總結(jié)見表1。

表1 4例攜帶CHD7基因突變患兒的臨床特征

3 討論

CHD7基因突變聯(lián)合典型的臨床表型可明確診斷CHARGE綜合征[7]。CHD7廣泛表達(dá)于胚胎和成體多種組織細(xì)胞中，不僅影響神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的發(fā)育，還廣泛影響著眼、耳、心臟和骨骼等多個器官的發(fā)育，故CHARGE綜合征患者的表型具有典型的異質(zhì)性和復(fù)雜性[13]，這種臨床表現(xiàn)高度可變和缺乏強(qiáng)制性檢查因素造成該病的診斷困難。最近，一種由全身系統(tǒng)和年齡組成的新檢查表已被開發(fā)出來以幫助診斷CHARGE綜合征[14]，該檢查表主要回顧了歐洲國家CHARGE綜合征患者最常見的需要管理的問題，以及在這些患者的整個生命周期中醫(yī)生可能忽略的關(guān)鍵問題，但目前還沒有針對中國人群CHARGE綜合征檢查的全面指南。故本文報道4例存在CHD7基因突變患兒，總結(jié)其臨床癥狀，為以后制定中國人群CHARGE綜合征全面檢查表提供一定幫助。

我們主要依據(jù)Hale診斷標(biāo)準(zhǔn)，4例患兒中有3例可以診斷為CHARGE綜合征，其中患兒2現(xiàn)有的臨床癥狀還無法診斷為CHARGE綜合征，因該綜合征表型的顯著差異性，有些癥狀在新生兒期難以察覺，如視力、聽力、性腺發(fā)育不良等[15]，而該患兒亦未進(jìn)行詳細(xì)的全身檢查，如眼球及視力檢查、頭顱CT，聽力及半規(guī)管檢查等，因此該患兒也無法排除CHARGE綜合征，隨后對患兒2進(jìn)行的隨訪過程中，應(yīng)注意對應(yīng)CHARGE綜合征常見表征進(jìn)行隨訪?；純?有明顯的外耳畸形及聽力異常、先天性心臟病、骨骼發(fā)育異常及宮外發(fā)育遲緩，加上CHD7基因（c.6861delC）致病突變可診斷為CHARGE綜合征，c.6861delC為未報道過的新位點(diǎn)，該變異位點(diǎn)的檢出擴(kuò)展了CHD7基因的變異譜。據(jù)報道，80%～100%的CHARGE綜合征患者存在耳朵異常，大多數(shù)外耳異常包括垂耳或杯狀耳、耳廓低或垂直高度降低等[16-17]，半規(guī)管發(fā)育不全是公認(rèn)的CHARGE主要表征，可被認(rèn)為是內(nèi)耳畸形，在95%的CHARGE綜合征患者中有聽力損失表現(xiàn)，這些需通過CT或MRI檢查來確認(rèn)[18]。多數(shù)醫(yī)院，包括我們醫(yī)院，不使用CT或MRI作為初始篩查的一部分，除非有其他跡象證明需要[19]，這可能導(dǎo)致一些表征難以發(fā)覺。在本研究中，患兒1和患兒4存在外耳畸形和耳位低，僅有患兒1表現(xiàn)先天性耳聾，其他2例患兒聽力測試通過，這一比例低于文獻(xiàn)報道比例，可能與本研究病例數(shù)較少有關(guān)。先天性心臟缺陷存在于3/4 CHARGE綜合征患者中，其缺陷類型各不相同，從房室間隔缺損到主動脈弓畸形均有被報道[20]。本文報道的3例CHARGE綜合征患兒均有先天性心臟缺陷存在，3例患兒缺陷類型均有房間隔缺損（ASD）和動脈導(dǎo)管未閉（PDA）。此外，在患者1還發(fā)生第2足趾突出，前囟極小癥狀；患者3出現(xiàn)腎盂分離及生殖器發(fā)育不良；患兒4有消化道出血、新生兒腦病和雙側(cè)髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良，這些表征為CHARGE綜合征少見的臨床特征[21]。盡管CHARGE綜合征患者的表型不同，但值得注意的是3例CHARGE綜合征新生兒均出現(xiàn)先天性心臟缺陷、肺炎和先天性喉喘鳴，這表明當(dāng)這些癥狀同時出現(xiàn)時，可被認(rèn)為是CHARGE綜合征的臨床診斷線索之一。

本文總結(jié)4例攜帶CHD7基因雜合突變患者的臨床表型，我們的研究表明，肺炎合并先天性喉喘鳴尤其是當(dāng)它還伴有典型的結(jié)構(gòu)畸形時可被視為CHARGE綜合征的臨床診斷線索之一，我們充分利用了基因檢測的優(yōu)勢來診斷新生兒復(fù)雜的先天性疾病，這有助于醫(yī)生做出針對性的治療決策。本文報道的4例患者均為新生兒，CHARGE綜合征的新生兒期診斷可提前對患兒多個器官系統(tǒng)進(jìn)行評估與干預(yù)，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)和性腺軸中央激活情況，在隨后的青春期進(jìn)行早期干預(yù)、誘導(dǎo)，使其與同齡人同時發(fā)生第二性特征發(fā)育?；驒z測可增進(jìn)臨床醫(yī)生對CHARGE綜合征發(fā)展和臨床表現(xiàn)的了解，并可促進(jìn)及時診斷，早期的支持和矯正療法，特別是在控制感染，改善呼吸和進(jìn)食方面，對患者的預(yù)后至關(guān)重要。由于基因檢測的開展具有對CHARGE患者進(jìn)行快速診斷和方便進(jìn)行隨訪的好處，我們建議對不完全符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的可疑病例進(jìn)行基因檢測。