血清環(huán)狀FoxO3a在宮頸鱗癌患者中的 表達及其臨床意義

陳 婷

（張家港市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 蘇州 215600）

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，其早期癥狀主要是局限于宮頸，還沒有向周圍其他組織蔓延，因此患者往往沒有明顯癥狀，隨著腫瘤的增大，壓迫和侵犯臨近器官組織才會出現(xiàn)相應(yīng)癥狀，并嚴(yán)重威脅女性的健康和生命。宮頸癌病理類型有鱗狀細胞癌、腺癌等，以宮頸鱗狀細胞癌（squamous cervical cancer， SCC）最為常見[1]。宮頸癌的早期篩查，可以及時發(fā)現(xiàn)癌變細胞并進行治療，能夠提高患者預(yù)后效果。鱗狀細胞癌抗原（SCC-Ag）是目前最常用的鱗狀細胞癌標(biāo)志物，在肺癌、食管癌及頭頸部腫瘤中被證實可用于評估腫瘤的惡性程度，預(yù)測患者的生存預(yù)后，但是SCC-Ag的特異性較差[2]，因此迫切需要探索新的無創(chuàng)血清生物標(biāo)志物，以更準(zhǔn)確地預(yù)測SCC患者的預(yù)后。非編碼RNA是真核生物體內(nèi)廣泛存在的一類能夠調(diào)控遺傳物質(zhì)正常轉(zhuǎn)錄和翻譯表達的小分子物質(zhì)，在多種疾病包括惡性腫瘤、心腦血管疾病及正常組織發(fā)育和分化過程中扮演重要角色。圓形叉頭盒O3a（FoxO3a）被證實是一種重要的腫瘤抑制因子，在多種惡性腫瘤組織中表達下調(diào)，并且參與細胞增殖和細胞周期；同時，也有研究表示FoxO3a可以作為非小細胞肺癌患者的早期診斷、治療監(jiān)測及預(yù)后的標(biāo)志物[3-4]。本研究旨在探討SCC患者血清環(huán)狀FoxO3a與腫瘤病理特征的關(guān)系，及其對預(yù)測患者預(yù)后的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2018年5月至2020年5月張家港市第一人民醫(yī)院收治的98例SCC患者（SCC組）的臨床資料，另回顧性分析30例宮頸上皮內(nèi)瘤變患者（瘤變組）和30例健康體檢志愿者（健康組）的臨床資料。其中健康組研究對象年齡45～74歲，平均（56.5±7.1）歲；瘤變組患者年齡46～73歲，平均（55.8±6.7）歲；SCC組患者年齡44～76歲，平均（57.6±7.3）歲。3組研究對象年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），組間具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：SCC組患者符合《宮頸癌及癌前病變規(guī)范化診療指南（試行）》[5]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，宮頸活檢及術(shù)后病理診斷為宮頸鱗狀細胞癌；瘤變組患者符合《婦產(chǎn)科學(xué)》[6]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；術(shù)前無放化療及其他干預(yù)性治療者；患者臨床資料完整等。排除標(biāo)準(zhǔn)：入組前6個月內(nèi)存在宮頸病變并接受過治療者；合并其他部位原發(fā)惡性腫瘤者；嚴(yán)重肝、腎功能障礙或自身免疫性疾病者等。本研究經(jīng)過院內(nèi)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法 ①采集所有研究對象外周靜脈血10 mL于抗凝管中，根據(jù)檢測試劑盒（美國Invitrogen公司）提示步驟依次完成血清分離、冷凍、復(fù)蘇及提純等，采用超微量分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司，型號：Nano-Drop-2000）測定核糖核酸（RNA）濃度。收集RNA（2 μg）在37 °C和3 U/μg RNase R（上海震中生物技術(shù)有限公司）孵育15 min去除線性RNA，純化環(huán)狀FoxO3a；然后使用實時熒光定量PCR系統(tǒng)（美國賽默飛世爾abi公司，型號：7500 Fast Real-Time PCR）和SYBR Green熒光定量PCR試劑盒（中國大連Takara有限公司）進行逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）。引物購自中國上海桑光生物科技有限公司，序列為：FoxO3a（F）5'-ATTGCCAGAGAGGCCGCGCGG-3'，（R）5'-GTGGAACTGGTGCTAG-3'；GAPDH（F）5'-GTCTCCTGTCAGCGCGCGAG-3'，（R）5'-ACCCTTGTCAGCA-3'。根據(jù)擴增試劑盒提示配置恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)體系和設(shè)置擴增參數(shù)，結(jié)束后電泳進行產(chǎn)物鑒定。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算FoxO3a的相對表達量。②采用受試者工作特征（ROC）曲線分析FoxO3a對SCC患者預(yù)后的診斷價值。③以ROC曲線最佳截斷值0.23為臨界值，將患者劃分為高FoxO3a組（58例，F(xiàn)oxO3a≥ 0.23）與低FoxO3a組（40例，F(xiàn)oxO3a＜0.23），對比分析高FoxO3a組和低FoxO3a組患者的臨床資料。臨床資料主要包括年齡（＜58歲、≥ 58歲）、TNM分期（Ⅰ ～ Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ期）、腫瘤直徑（≤ 4 cm、＞4 cm）、淋巴血管侵犯（陰性、陽性）、間質(zhì)浸潤深度（＜1/2、≥ 1/2）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（陰性、陽性）。④所有患者均進行隨訪追蹤至死亡日期或術(shù)后5.0～26.0個月，隨訪方式為電話或門診，頻率為1次/3個月，記錄患者術(shù)后的生存情況，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并行Log-rank檢驗進行生存分析。⑤采用Cox比例風(fēng)險模型分析影響SCC患者術(shù)后預(yù)后的相關(guān)因素。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料均符合正態(tài)分布且方差齊，以(±s)表示，行t檢驗；計數(shù)資料以[例(%)]表示，采用χ2檢驗；采用ROC曲線分析FoxO3a對SCC患者術(shù)后預(yù)后的診斷價值；采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，行Log-rankχ2檢驗；采用Cox比例風(fēng)險模型分析影響SCC患者術(shù)后預(yù)后的相關(guān)因素。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組研究對象血清FoxO3a相對表達量比較 健康組、瘤變組、SCC組研究對象FoxO3a相對表達量分別為（0.89±0.09）、（0.90±0.11）、（0.44±0.08），SCC組顯著低于健康組、瘤變組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=26.170、25.104，均P＜0.05），但健康組、瘤變組研究對象血清FoxO3a相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.385，P＞0.05）。

2.2 FoxO3a預(yù)測SCC患者預(yù)后的ROC曲線 所有患者隨訪5.0～26.0個月，中位時間18.5個月，隨訪期間SCC組患者中死亡10例，死亡率為10.2%（10/98）；ROC曲線分析顯示，F(xiàn)oxO3a預(yù)測SCC患者預(yù)后的AUC值為0.856（95%CI：0.798～0.899），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），敏感度為81.20%，特異性為73.60%，最佳截斷值為0.23，見圖1。死亡患者、生存患者血清FoxO3a相對表達量分別為（0.18±0.02）、（0.62±0.11），死亡患者血清FoxO3a相對表達量顯著低于生存患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.570，P＜0.05）。

圖1 FoxO3a預(yù)測SCC患者預(yù)后的ROC曲線

2.3 高FoxO3a組和低FoxO3a組患者臨床資料比較 低FoxO3a組中Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑＞4 cm、淋巴血管侵犯陽性、間質(zhì)浸潤深度≥ 1/2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者占比均顯著高于高FoxO3a組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 高FoxO3a組和低FoxO3a組患者 臨床資料比較[例(%)]

2.4 高FoxO3a組和低FoxO3a組患者Kaplan-Meier生存曲線分析 低FoxO3a組累積生存率顯著低于高FoxO3a組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Log-rankχ2=5.659，P＜0.05），見圖2。

圖2 高FoxO3a組和低FoxO3a組患者 Kaplan-Meier生存曲線圖

2.5 影響SCC患者預(yù)后的Cox比例風(fēng)險模型分析 單因素和多因素Cox分析結(jié)果顯示，淋巴血管侵犯陽性、間質(zhì)浸潤深度≥ 1/2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、FoxO3a＜0.23均是影響SCC患者預(yù)后的危險因素，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 影響SCC患者預(yù)后的Cox比例風(fēng)險模型分析

3 討論

SCC是宮頸癌的一種病理類型，腫瘤來源于宮頸鱗狀上皮細胞，如果腫瘤分化程度比較低，可以看到角化珠和組織間橋的話，則異型性比較低，細胞的倍增時間也比較長，發(fā)展速度也就相對慢一些。宮頸癌鱗癌的患者需要接受以手術(shù)治療為主、放化療為輔助的綜合性治療，手術(shù)切除范圍需要根據(jù)腫瘤的大小和侵犯范圍來決定，晚期患者預(yù)后較差，因此早期發(fā)現(xiàn)并進行治療，預(yù)后效果更好。

環(huán)狀RNA是新近發(fā)現(xiàn)的一種非編碼RNA，可通過miRNA海綿樣效應(yīng)或與蛋白相互作用在乳腺癌、肝細胞癌、結(jié)直腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。FoxO3是著名的轉(zhuǎn)錄因子家族成員，通常以抑癌作用為主，腫瘤組織高表達FoxO3a患者預(yù)后通常較好[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCC組患者血清FoxO3a相對表達量顯著低于健康組、瘤變組，SCC組中死亡患者血清FoxO3a相對表達量顯著低于生存患者，提示SCC患者血清FoxO3a相對表達量同樣呈現(xiàn)低表達，并且死亡患者表達更低。TIAN等[10]研究指出，低表達FOXO3a與宮頸癌預(yù)后不良相關(guān)，并通過WNT/β-catenin信號通路促進細胞侵襲和遷移等行為。本研究中，ROC曲線分析顯示，F(xiàn)oxO3a預(yù)測SCC患者預(yù)后的AUC值為0.856，敏感度為81.20%，特異性為73.60%，最佳截斷值為0.23；低FoxO3a組中Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑＞4 cm、淋巴血管侵犯陽性、間質(zhì)浸潤深度≥ 1/2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者占比均顯著高于高FoxO3a組，提示FoxO3a相對表達量與SCC患者預(yù)后密切相關(guān)。FoxO3a是FOXM1轉(zhuǎn)錄因子的上游調(diào)節(jié)基因，也是磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路的重要下游效應(yīng)物，F(xiàn)OXM1/FoxO3a信號通路可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移、血管生成來控制惡性腫瘤的嚴(yán)重程度，也可影響腫瘤的病理 特征[11]。

本研究中，單因素和多因素Cox分析結(jié)果顯示，淋巴血管侵犯陽性、間質(zhì)浸潤深度≥ 1/2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、FoxO3a＜0.23均是影響SCC患者預(yù)后的危險因素，可見FoxO3a＜0.23與SCC患者預(yù)后不良密切相關(guān)。無論是腫瘤TNM分期升高、腫瘤直徑增大、淋巴血管侵犯陽性、間質(zhì)浸潤深度增加，還是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性均提示腫瘤惡性程度較高，均出現(xiàn)血清FoxO3a相對表達量降低，也說明FoxO3a表達下調(diào)后釋放入血濃度降低，發(fā)揮抑癌效應(yīng)減弱，進而出現(xiàn)腫瘤惡性侵襲。FOXO3a是一種重要的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，廣泛參與多種生物學(xué)過程，包括增殖、細胞周期調(diào)節(jié)、存活、凋亡及自噬等，同時還與氧化應(yīng)激、DNA損傷相關(guān)[12]。FOXO3a是PI3K/AKT信號通路的重要下游信號傳導(dǎo)分子之一，當(dāng)PI3K/AKT信號通路被激活時，AKT被磷酸化，活化的AKT可使其下游信號傳導(dǎo)分子FOXO3a的3個磷酸化位點被磷酸化，磷酸化的FOXO3a轉(zhuǎn)錄因子與胞核內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白特異性結(jié)合，使FOXO3a從細胞核內(nèi)移入細胞質(zhì)中，抑制FOXO3a的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進腫瘤細胞增殖、分化，加重SCC患者病情，不利于預(yù)后 恢復(fù)[13]。

綜上，術(shù)前FoxO3a相對表達量與SCC患者術(shù)后預(yù)后密切相關(guān)，其對SCC患者術(shù)后預(yù)后評估亦具有較高的預(yù)測價值，且淋巴血管侵犯陽性、間質(zhì)浸潤深度≥ 1/2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、FoxO3a＜0.23均是SCC患者術(shù)后預(yù)后不良的危險因素。但研究不足是樣本量較小，隨訪時間較短，可能出現(xiàn)選擇性偏倚和統(tǒng)計誤差。