補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對耐甲氧西林金葡菌葡萄黃素的抑制作用

丁 穎，朱先鵬，李江波，劉 爽，于清平，王 琳*

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院/人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 130062；2.吉林金梓源生物科技有限公司，吉林 四平 136400；3.吉林省遼源市西安區(qū)農(nóng)林水利工程總站，吉林 遼源 136200；4.吉林省柳河縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，吉林 通化135300；5.吉林省通化縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，吉林 通化134100)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)屬于革蘭陽性菌，能夠引發(fā)大范圍的獲得性感染[1-2]。近年來，由于抗生素的廣泛使用及使用過程中存在的不規(guī)范操作，使得多藥耐藥菌株愈發(fā)增多。目前，死于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus,MRSA)感染的患者人數(shù)已經(jīng)超過死于艾滋病病毒感染的人數(shù)[3-4]。然而，目前治療和控制MRSA的方案卻非常有限[5]，因此針對MRSA的新型治療藥物的開發(fā)就顯得愈發(fā)迫切[6]。國際研究委員會研討會上提及的特異性中和細(xì)菌毒力因子以提高先天免疫系統(tǒng)對致病菌清除的方法即抗毒力策略越來越引起大家的關(guān)注[7]。

病原菌的毒力因子通常與細(xì)菌的生長無關(guān)，而是經(jīng)病原菌產(chǎn)生、分泌后幫助病原菌在各種條件下生存，因此針對不同的毒力因子找尋新的抑制劑成為研究熱點。葡萄黃素(staphyloxanthin，STX)是S.aureus的一個重要毒力因子，從S.aureus感染者分離的菌種中90%均可產(chǎn)生STX。STX是S.aureus的一種膜結(jié)合類胡蘿卜素，隨著不同菌種毒力呈現(xiàn)不同程度的黃色，主要呈現(xiàn)為淡橙紅色或金黃色，其生物結(jié)構(gòu)已經(jīng)被闡明[8]。研究表明，STX可以保護(hù)S.aureus免受氧化應(yīng)激傷害。CLAUDITZ等[9]研究了STX與活性氧物質(zhì)(ROS)的相互作用，證明STX可通過其共軛雙鍵清除自由基。由于STX位于細(xì)胞膜上，它可能主要保護(hù)脂質(zhì)，但也可能參與保護(hù)蛋白質(zhì)和DNA。STX生物合成需要經(jīng)過異戊二烯途徑由焦磷酸法尼基合成酶(IspA)[10]合成法尼基二磷酸作為底物，底物被脫水鯊烯合成酶(CrtM)、脫水鯊烯脫氫酶(CrtN)、氧化酶(CrtP)、還原酶(AldH)、糖基轉(zhuǎn)移酶(CrtQ)和脂肪酰轉(zhuǎn)移酶(CrtO)等一系列酶催化修飾后最終生成[11]。通過對野生型和等位基因crtM突變體的比較分析表明，野生型對過氧化氫、超氧自由基、羥基自由基、單線態(tài)氧和中性粒細(xì)胞殺傷作用的抵抗力以及在宿主體內(nèi)的適應(yīng)性和生存能力都比突變菌更強(qiáng)[9]。另據(jù)報道，萘替芬能夠通過競爭性抑制STX生成途徑中脫水鯊烯脫氫酶(CrtN)的作用而抑制STX的產(chǎn)生，并可在小鼠模型中有效降低多種S.aureus的毒力，抑制MRSA的感染[12]。

目前，國內(nèi)外針對STX抑制劑的研究主要集中在化學(xué)藥物。中藥小分子藥物取材天然，作用平穩(wěn)，毒副作用小。本研究是從實驗室提取的中藥醇提取物中篩選STX的有效抑制劑，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂醇提取物抑制效果最好，對其主要成分的抑制活性的分析發(fā)現(xiàn)其中幾種單體成分都可以有效抑制STX的產(chǎn)生，其中補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚的色素抑制作用尤為明顯，因此本試驗對該單體的抑制活性和機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的探討。補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚屬于異戊烯基黃酮類化合物，具有抗炎、平喘、抗氧化以及抗腫瘤等多種藥理作用[13]。本試驗結(jié)果證實了補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚能夠通過抑制STX生物合成中的關(guān)鍵基因的表達(dá)降低MRSA菌株的致病力，為開發(fā)治療MRSA感染的藥物提供了新的理論指導(dǎo)和先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 菌株與主要試劑S.aureus菌株USA300、Newman、ATCC 29213由吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)分子藥理學(xué)實驗室保存；中藥提取物由本實驗室制備并保存；TSB培養(yǎng)基購自青島海博有限公司；中藥材購自重慶市金乾農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚(Lot：drk-1842-950423，CAS NO：19879-30-2)，純度>98%，購自成都德銳可生物科技有限公司；甲醇(分析純)購自北京化學(xué)試劑公司；甲醇(色譜純)和乙腈(色譜純)購自Dikma公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；超高靈敏CCK-8檢測試劑盒購自上海尚寶生物科技有限公司。

1.2 補(bǔ)骨脂的醇提稱取20 g中藥補(bǔ)骨脂成熟干燥種子粉碎后的粉末置于圓底燒瓶中，向燒瓶中加入120 mL 100%甲醇溶液并混勻。使用冷凝回流裝置加熱萃取，回流2 h，過濾并收集萃取液，重復(fù)2次。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至40 mL，轉(zhuǎn)移至坩堝中攪拌加熱蒸發(fā)水分，最后將黏稠樣品置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中持續(xù)干燥最終獲得補(bǔ)骨脂醇提取物浸膏。

1.3 STX抑制劑的篩選將耐藥S.aureus與藥物共培養(yǎng)后，通過觀察色素生成多少來從中藥醇提物中篩選有效抑制劑。USA300菌株過夜培養(yǎng)物按照1∶100比例接種于2 mL TSB培養(yǎng)基中，加入中藥醇提物至終質(zhì)量濃度為16 mg/L，設(shè)置僅接種USA300并加入等量DMSO組作為對照，培養(yǎng)36 h，12 000 r/min 離心1 min后，通過菌體沉淀顏色觀察抑制效果。

1.4 STX抑制定量試驗使用有機(jī)溶劑萃取法萃取STX后通過測定吸光度確定色素含量。過夜培養(yǎng)USA300菌株1∶100比例接種于4 mL TSB培養(yǎng)基中，加入不同質(zhì)量濃度的待測藥物補(bǔ)骨脂醇提取物(終質(zhì)量濃度分別為0.25,1.00,4.00,16.00 mg/L)及補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚(終質(zhì)量濃度分別為0.25,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,16.00,32.00 mg/L)，設(shè)置僅接種菌株并加入等量DMSO組為對照。恒溫?fù)u床37℃、180 r/min培養(yǎng)36 h，12 000 r/min 離心1 min 收集培養(yǎng)物棄上清，觀察菌體沉淀顏色。使用0.01 mol/L PBS洗滌菌體2次，棄洗滌液，用1 mL甲醇分3次重懸菌體萃取色素。將3次萃取液混合，12 000 r/min 離心1 min使藥渣等雜質(zhì)沉淀，每管萃取液樣品取200 μL于96孔板中，450 nm波長處測定吸光值并繪制曲線，并通過GraphPad Prism 8.0軟件計算抑制劑的IC50。該試驗重復(fù)3次。

1.5 補(bǔ)骨脂醇提取物及補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚最小抑菌濃度(MIC)及生長曲線的測定

1.5.1最小抑菌濃度(MIC)的測定 MIC按照臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)中所述的微量肉湯稀釋法進(jìn)行。在96孔培養(yǎng)板的每1行的2～11孔中加入100 μL干凈的培養(yǎng)基，第1孔中加入質(zhì)量濃度為1 024 mg/L的待測中藥單體母液(DMSO<0.5%)，將體積補(bǔ)至200 μL混勻，從第1孔吸取100 μL 液體加入到第2孔中混勻后，取100 μL液體加入到第3孔中，以此類推倍比稀釋。以只加入肉湯培養(yǎng)基的孔作為陰性對照，以只加入DMSO的組為陽性對照。每種待測樣品進(jìn)行3次平行試驗。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金葡菌USA300菌液調(diào)節(jié)菌量至1×108CFU(D600 nm=0.1)加入到各個孔中，而后將96孔板放入37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以抑制細(xì)菌生長的最小濃度為該藥物的最小抑菌濃度。

1.5.2生長曲線的測定 過夜培養(yǎng)的USA300菌株按1∶100的比例在TSB培養(yǎng)基中擴(kuò)培，生長至D600 nm=0.3時分裝于40 mL小錐形瓶中，加入不同質(zhì)量濃度補(bǔ)骨脂醇提取物及補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚，設(shè)置不加藥物對照，恒溫?fù)u床37℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，每個樣品每隔1 h取1 mL菌液，使用紫外分光光度計測D600 nm值，記錄數(shù)據(jù)并繪制曲線。

1.6 高效液相色譜(HPLC)檢測利用HPLC檢測補(bǔ)骨脂醇提取物中抑制色素有效成分的含量，使用色譜純甲醇溶解補(bǔ)骨脂醇提取物(20 g/L)及單體補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚(100 mg/L)，用薄膜過濾器過濾后上樣。色譜條件：色譜柱為C18-WR(4.6 mm×250 mm，5 μm，WondaSil公司)，流動相組成：水(A泵)、乙腈(B泵)、甲醇(C泵)作為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫。程序設(shè)定：程序1時間設(shè)定0～10 min，乙腈(B泵)濃度變化10%→35%，甲醇(C泵)濃度變化80%→30%，洗脫液其他成分用水(A泵)調(diào)整補(bǔ)足；程序2時間設(shè)定10～30 min，乙腈(B泵)濃度變化35%→37.5%，甲醇(C泵)濃度變化30%→25%，洗脫液其他成分用水(A泵)調(diào)整補(bǔ)足；程序3時間設(shè)定30～40 min，乙腈(B泵)濃度變化37.5%→40%，甲醇(C泵)濃度變化25%→20%，洗脫液其他成分用水(A泵)調(diào)整補(bǔ)足。流速設(shè)置為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為30 μL；檢測波長設(shè)置為254 nm。

1.7 過氧化氫敏感性試驗過夜培養(yǎng)USA300菌株1∶100接種于2 mL TSB培養(yǎng)基中，加入藥物至質(zhì)量濃度為0.5，2.0，8.0 mg/L，設(shè)置等量DMSO組作為溶劑對照，恒溫?fù)u床37℃、轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)24 h。取500 μL菌液離心，收集菌體，使用0.01 mol/L PBS緩沖液洗滌2次，加入500 μL PBS重懸混勻菌體。吸取少量菌液加至1 500 μL PBS緩沖液中調(diào)整D600 nm=0.1，取250 μL調(diào)整好菌液于2 mL 離心管中，加入30%H2O2溶液至終濃度為1.5%，封口膜密封，37℃恒溫箱中孵育1 h。另取菌液250 μL加入等量無菌PBS作對照。孵育后菌液加入5 μL 20 000 U/mL無菌過氧化氫酶終止反應(yīng)。取100 μL反應(yīng)液至900 μL PBS中，取10 μL稀釋液點至TSA平板上進(jìn)行菌落計數(shù)。試驗重復(fù)3次。

1.8 細(xì)菌酸堿刺激存活試驗過夜培養(yǎng)USA300菌株1∶100擴(kuò)培至50 mL TSB培養(yǎng)基中，生長至D600 nm為1.0時，擴(kuò)培分裝至加入補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚(8 mg/L)或等量DMSO溶劑對照組的酸性TSB肉湯(pH5)、堿性TSB肉湯(pH9)及正常TSB(pH7)肉湯中，每8 h使用紫外分光光度計測定D600 nm值，通過繪制生長曲線測定細(xì)菌的生長情況。所有試驗重復(fù)3次。

1.9 CCK-8細(xì)胞活性試驗采用CCK-8法測定補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚的細(xì)胞毒性。取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，以20 000細(xì)胞/孔接種200 μL于96孔板中，于5%CO2、恒溫37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后，更換含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，并分別加入補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚至終質(zhì)量濃度1，2，4，8 mg/L于各孔中，設(shè)置溶劑DMSO及空白培養(yǎng)基作為對照，每個劑量設(shè)置3孔平行重復(fù)。恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃孵育6 h，每孔吸出100 μL上清培養(yǎng)液，在各孔加入10 μL CCK-8溶液，于37℃恒溫箱孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度，與不加藥僅加入培養(yǎng)基對照組數(shù)值比較，計算相對細(xì)胞活性。

1.10 細(xì)胞黏附試驗在24孔板中每孔接種2×105個A549細(xì)胞，并加入1 mL含有10%胎牛血清的 DMEM高糖培養(yǎng)基，放入5%CO2、恒溫37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，更換培養(yǎng)基混合USA300(MOI=20)感染細(xì)胞，并分別加入終質(zhì)量濃度1，2，4，8 mg/L的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚，設(shè)置DMSO對照，恒溫箱37℃孵育2 h。使用0.01 mol/L 無菌PBS緩沖液清洗細(xì)胞3次，加入1 mL無菌蒸餾水裂解細(xì)胞5 min，稀釋涂板，37℃恒溫箱中孵育12 h后記錄平板上菌落數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有試驗進(jìn)行3次重復(fù)。

1.11 RT-PCR過夜培養(yǎng)USA300菌株按照1∶100接種于含4 mL TSB培養(yǎng)基的試管中，加入補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚(8 mg/L)，設(shè)置等量DMSO作對照，恒溫?fù)u床37℃，轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)物12 000 r/min離心5 min收集菌體沉淀，加入Tris-HCL(pH8.0)200 μL重懸菌體，95℃金屬浴加熱20 min。待自然冷卻后加入50 μL 1 g/L溶菌酶混勻，置于37℃水浴鍋中5 h破壞細(xì)胞壁。加入1 mL TRIzol振蕩混勻，冰浴5 min，加入200 μL預(yù)冷的氯仿渦旋15 s混勻，冰浴5 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，管中液體分3層，小心吸取上層水相600 μL于無核酸酶1.5 mL EP管中，加入600 μL 預(yù)冷異丙醇振蕩混勻，冰浴10 min，4℃、12 000 r/min 離心10 min棄去管中液體，此時RNA經(jīng)離心已經(jīng)吸附至管壁及管底，加入1 mL使用DEPC水配置的75%乙醇洗滌沉淀，4℃、7 500 r/min離心 5 min，小心棄凈上清，室溫晾干5 min，加入20 μL DEPC水溶解RNA沉淀。通過吸光度比率(D260 nm/D280 nm)定量，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，根據(jù)NCBI上相關(guān)基因序列設(shè)計引物(表1)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，每個反應(yīng)重復(fù)3次。引物均由生工生物(上海)股份有限公司合成。結(jié)果采用相對定量法(2-ΔΔCt)分析。

表1 引物信息

1.12 試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用GraphPad Prism 8.0和SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。單因素方差分析用于STX抑制定量試驗、過氧化氫敏感性試驗、細(xì)菌酸堿刺激存活試驗、細(xì)胞活性試驗、細(xì)胞黏附試驗、RT-PCR各組間的差異；以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 多重耐藥S.aureusSTX抑制劑篩選為了使抑制劑的篩選更準(zhǔn)確高效，首先考察了不同菌株STX生成量隨培養(yǎng)時間的變化(圖1A)，選用色素產(chǎn)生明顯的USA300菌株作為研究對象，并將篩選STX抑制劑與菌株共培養(yǎng)時間確定為36 h。通過對本實驗室制備并保存的中藥材提取物庫進(jìn)行篩選，在中藥材醇提物中，發(fā)現(xiàn)16 mg/L的補(bǔ)骨脂醇提物的色素抑制效果最為明顯(圖1B)。

A.不同金葡菌生成STX量隨時間變化；B.16 mg/L中藥提取物抑制USA300菌株STX生成情況

2.2 補(bǔ)骨脂醇提物中多種成分抑制STX產(chǎn)生中藥材提取物成分復(fù)雜，據(jù)文獻(xiàn)報道補(bǔ)骨脂提取物中含有補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂甲素、補(bǔ)骨脂乙素、補(bǔ)骨脂定、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚、補(bǔ)骨脂酚等主要成分[14-15]。本試驗通過對補(bǔ)骨脂醇提物(圖2A)及其主要成分對STX的抑制作用的分析，發(fā)現(xiàn)其中補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對STX的抑制活性最為明顯(IC50=0.529 mg/L)(圖2B)。隨后，通過高效液相色譜法檢測了補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚在補(bǔ)骨脂醇提物中的含量，為1.83%(圖2C，D)。如上所述，本試驗選擇補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚作為后續(xù)研究的目標(biāo)化合物。

A.不同質(zhì)量濃度補(bǔ)骨脂提取物對STX的抑制活性；B.不同質(zhì)量濃度補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對STX的抑制活性；C.補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖(254 nm)；D.補(bǔ)骨脂醇提取物高效液相色譜圖(254 nm)。與不加藥對比，ns示差異不顯著(P>0.05)，**示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株生長的影響為了測定補(bǔ)骨脂醇提物及有效單體成分補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株生長的影響，本試驗進(jìn)行了MIC試驗和生長曲線的測定。結(jié)果顯示，補(bǔ)骨脂醇提物對USA300菌株24 h的MIC為32 mg/L，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株24 h的MIC大于512 mg/L。如圖3所示，補(bǔ)骨脂醇提物及補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株的生長未產(chǎn)生顯著影響，雖然高質(zhì)量濃度的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚在早期抑制菌株生長，但很快恢復(fù)至與正常菌株相同的生長速度。以上結(jié)果證明補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚在有效抑制STX的質(zhì)量濃度下不會對細(xì)菌生長產(chǎn)生影響。

圖3 不同濃度補(bǔ)骨脂醇提物(A)及補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚(B)對金葡菌USA300生長的影響

2.4 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對MRSA氧敏感性的影響葡萄黃素是一種抗氧化色素，為了進(jìn)一步確證補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對葡萄黃素的抑制作用，本試驗使用H2O2作為氧化劑對USA300菌株進(jìn)行殺傷刺激。如圖4A所示，氧敏感性試驗結(jié)果顯示，與未加補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對照組相比，藥物組USA300菌株對氧化劑殺傷更敏感，且其敏感性呈現(xiàn)劑量依賴性變化，即隨著補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚劑量增加，USA300菌株對過氧化氫的敏感性增加，存活率降低。

2.5 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對MRSA在酸堿脅迫刺激環(huán)境中的影響STX分布在S.aureus細(xì)胞膜上對病原菌產(chǎn)生保護(hù)作用，因此本試驗進(jìn)一步考察了STX除抗氧化性質(zhì)外，在酸堿脅迫刺激環(huán)境中對USA300菌株存活的影響。由圖4B可知，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚處理后的USA300菌株在酸性培養(yǎng)基(pH5.0)中對環(huán)境刺激的抵抗力下降(P<0.05)，而堿性培養(yǎng)基(pH9.0)中與對照組(pH7.0)差異并不顯著(P>0.05)，表明補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚能夠恢復(fù)耐藥S.aureus對酸刺激的敏感性。

A.補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株氧敏感性影響,與對照組相比，*示差異顯著(P<0.05)，**示差異極顯著(P<0.01)；B.補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株酸堿環(huán)境抗逆性影響，與不加藥組相比，**示差異極顯著(P<0.01)，ns示差異不顯著(P<0.05)。下同

2.6 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對USA300菌株感染A549細(xì)胞的影響為了檢測補(bǔ)骨脂二氫黃酮作為抗菌藥物的安全性，首先檢測其對細(xì)胞生長是否影響，由圖5A可知，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚在抑制STX的有效質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對A549細(xì)胞活性沒有影響(P>0.05)。結(jié)果2.2證明補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚質(zhì)量濃度在8 mg/L時對STX生產(chǎn)的抑制率可達(dá)90%以上，且藥物在8 mg/L時及以下并未對A549細(xì)胞活性造成影響。

細(xì)菌對宿主細(xì)胞的黏附是其侵入并感染細(xì)胞的前提，如圖5B所示，隨著補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚質(zhì)量濃度升高，細(xì)胞表面黏附菌量逐漸降低。質(zhì)量濃度4 mg/L 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚即可顯著降低USA300菌株對A549細(xì)胞的黏附能力，從而保護(hù)A549細(xì)胞不被細(xì)菌侵襲。

與對照組相比，無*或ns示差異不顯著(P>0.05)

2.7 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對STX生成途徑相關(guān)基因的調(diào)控為了探究補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚的作用機(jī)制，在轉(zhuǎn)錄水平上，本試驗通過RT-PCR檢測8 mg/L補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對MRSA STX生成相關(guān)基因表達(dá)的影響。與空白溶劑DMSO處理組相比，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚處理組葡萄黃素生成途徑中重要基因crtM、crtN、crtP、crtQ、crtO及葡萄黃素上游異戊二烯合成途徑相關(guān)基因ispA的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)(圖6)，表明補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚可能是通過抑制STX生成通路相關(guān)基因的表達(dá)從而表現(xiàn)出對其活性的抑制作用，進(jìn)而阻止耐藥S.aureus對細(xì)胞的黏附。

圖6 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對葡萄黃素生成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平影響

3 討論

隨著多重耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，病原菌耐藥性成為全球不得不面對的一大挑戰(zhàn)，抗生素研發(fā)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于耐藥菌株的頻繁迭代[16]。近年來以毒力因子為靶標(biāo)，在不對病原菌產(chǎn)生生存壓力的同時，通過機(jī)體免疫系統(tǒng)的協(xié)助清除病原菌的抗毒力策略引發(fā)國際社會的廣泛關(guān)注。本研究旨在從實驗室現(xiàn)有的植物提取物中篩選出S.aureusSTX的有效抑制劑，并對其抑制機(jī)制進(jìn)行初步的探討。

STX是S.aureus標(biāo)志性毒力因子之一，其產(chǎn)生受溫度，光照，時間等影響，藥物篩選過程中為了保證STX產(chǎn)生穩(wěn)定且易于觀察，選擇色素產(chǎn)生明顯的菌株USA300，并根據(jù)色素隨時間變化的曲線將收集色素的時間確定在36 h。因為葡萄黃素產(chǎn)生后眼觀可見，所以本試驗通過觀察菌體顏色的變化能夠快速高效的篩選出STX的抑制劑。本試驗對實驗室提取的中藥醇提物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂醇提物具有顯著的色素抑制作用，但中藥提取物成分構(gòu)成復(fù)雜，且存在難以準(zhǔn)確定量及后續(xù)機(jī)制研究困難等問題，因此結(jié)合現(xiàn)有報道[14]，通過對補(bǔ)骨脂醇提物分析，成功找到對STX有明顯抑制效果的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚。該化合物在較低質(zhì)量濃度下(IC50=0.529 mg/L)就有很顯著的色素抑制活性，8 mg/L 的藥物就能達(dá)到90%的抑制率，且在該質(zhì)量濃度水平下不影響USA300菌株的生長，不易引發(fā)S.aureus產(chǎn)生耐藥性。

STX分布在S.aureus表面保護(hù)S.aureus免受宿主免疫機(jī)制的影響。在體外通過檢測USA300菌株應(yīng)對脅迫刺激條件的存活情況考察補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚是否能有效降低耐藥S.aureus的防御力。氧化劑H2O2刺激及酸堿環(huán)境脅迫生長結(jié)果均表明藥物處理使USA300菌株對不良刺激更敏感，有望通過抑制色素降低病原菌自身對刺激的抵抗能力，提高其對機(jī)體免疫殺傷的敏感性進(jìn)而使病原體更易被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除。為了進(jìn)一步驗證藥物的開發(fā)潛力，本試驗對其安全性和在細(xì)胞體內(nèi)活性進(jìn)行了考察，其中A549細(xì)胞活性試驗表明補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚在抑制STX的有效質(zhì)量濃度內(nèi)使用安全。細(xì)胞黏附試驗證明補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚能夠顯著降低USA300菌株黏附細(xì)胞的能力，有進(jìn)一步體內(nèi)研究的價值。

S.aureusSTX是由三萜類胡蘿卜素經(jīng)一系列酶的反應(yīng)催化加工而成的C30鏈。通過RT-PCR在轉(zhuǎn)錄水平上對補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚處理后樣品的STX生成相關(guān)基因進(jìn)行檢測分析，STX上游途徑產(chǎn)物合成酶基因ispA，STX合成途徑中催化酶基因crtM、crtN、crtO、crtP、crtQ轉(zhuǎn)錄均受到抑制。推測這一結(jié)果產(chǎn)生的原因可能是由于補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚作用于STX產(chǎn)生途徑的上游調(diào)控機(jī)制，如sigB因子等而發(fā)揮作用的[17]，這有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

病原菌引發(fā)感染是一個復(fù)雜的過程，需要多種毒力因子的協(xié)同作用[18]?？苟玖λ幬锟蛇x擇性地遏制目標(biāo)菌的毒素表達(dá)、毒素傳遞、細(xì)菌黏附和細(xì)菌的免疫逃避等，從而降低細(xì)菌的致病性。這種抗菌策略阻止了由于生存壓力導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性。本研究篩選出的S.aureusSTX抑制劑補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚為新的抗生素的替代藥物和輔助藥物的開發(fā)提供可靠的理論基礎(chǔ)和優(yōu)秀的先導(dǎo)化合物。