睪酮對(duì)梅花鹿鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖與分化的影響

姚雪原，李柏余，張巧玲，岳占碰，楊占清，郭 斌

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

鹿茸角是哺乳動(dòng)物唯一每年可進(jìn)行周期性脫落和再生的雄性附屬器官，再生過(guò)程圍繞其位于頭部頂端的生長(zhǎng)中心進(jìn)行[1]。處于快速生長(zhǎng)階段的鹿茸，其間充質(zhì)層細(xì)胞的分裂增殖發(fā)揮主要作用[2]。該時(shí)期內(nèi)的茸角生長(zhǎng)非常迅速，細(xì)胞增殖速度遠(yuǎn)超某些癌細(xì)胞[3]，但該過(guò)程卻能準(zhǔn)確無(wú)誤地進(jìn)行而不發(fā)生癌變，因此鹿茸角可作為理想的動(dòng)物模型應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。

睪酮(testosterone，T)作為哺乳動(dòng)物體內(nèi)最主要的雄激素，可通過(guò)與雄激素受體(androgen receptor，AR)結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用，參與骨骼的生長(zhǎng)和重塑過(guò)程[4]。有研究表明，鹿角的再生過(guò)程受體內(nèi)睪酮含量的調(diào)節(jié)[5]。鹿血清中的睪酮含量在茸角再生過(guò)程中呈現(xiàn)周期性的變化，睪酮質(zhì)量濃度在鹿茸角早期生長(zhǎng)過(guò)程中維持較低水平，在茸皮脫落和鹿角骨化過(guò)程中迅速增加，并在發(fā)情期達(dá)到最大值，當(dāng)睪酮含量降低到特定閾值時(shí)，觸發(fā)茸角脫落并進(jìn)行新一輪的茸角再生[6]。據(jù)報(bào)道，睪酮對(duì)鹿茸角頂端細(xì)胞具有誘導(dǎo)增殖和分化的作用[7]。而間充質(zhì)細(xì)胞是茸角頂端重要的一種細(xì)胞，但有關(guān)睪酮在鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖與分化中的作用目前尚不清楚。本試驗(yàn)通過(guò)原位雜交檢測(cè)梅花鹿茸角中AR的表達(dá)情況，體外分離培養(yǎng)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)適當(dāng)質(zhì)量濃度的睪酮作用后，分別采用MTS和熒光定量PCR方法，研究睪酮對(duì)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖與分化的影響，為進(jìn)一步闡明睪酮在茸角再生過(guò)程中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞試驗(yàn)所用的細(xì)胞為鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞，取自2～3歲健康雄性梅花鹿生長(zhǎng)約60 d的鹿茸角。

1.2 主要試劑DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基購(gòu)自康寧公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自ScienCell公司；胰蛋白酶購(gòu)自AMRESCO公司；Ⅰ型膠原酶購(gòu)自Worthington公司；睪酮購(gòu)自MERCK公司；熒光定量試劑盒和地高辛RNA標(biāo)記試劑盒購(gòu)自Roche公司；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自ABI公司；MTS細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自BioVision 公司；TRIzol試劑盒購(gòu)自MRC公司。

1.3 鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)將體外分離的鹿茸間充質(zhì)組織碎塊用含雙抗的PBS清洗后，Ⅰ型膠原酶消化并離心，獲取含有鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞的懸液。將細(xì)胞懸液均勻接種于培養(yǎng)瓶中，獲得原代培養(yǎng)的鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化、液氮凍存后用于后續(xù)的試驗(yàn)。

1.4 梅花鹿AR探針的制備及原位雜交根據(jù)GenBank中已有的相似種屬動(dòng)物AR基因序列設(shè)計(jì)合成引物。AR正向引物P1：5′-TCTCCGGAAATGCTATGAAG-3′,反向引物P2：5′-TCCAGGAGTACTGAATGACT-3′；擴(kuò)增片段大小為380 bp。提取鹿茸組織的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增和提純后，將其產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，利用PCR和基因測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒的插入方向。正義和反義cRNA探針的制備依據(jù)Roche公司地高辛RNA標(biāo)記(T7/SP6)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。原位雜交中涉及的相關(guān)試劑的配制和具體步驟參照本實(shí)驗(yàn)室已有方法[8]。

1.5 MTS法測(cè)定細(xì)胞增殖將分離的鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞均勻接種于96孔板中，待貼壁細(xì)胞匯合度為60%～70%時(shí)，在培養(yǎng)基中添加用乙醇配制的終質(zhì)量濃度為10-6g/L的睪酮，對(duì)照組加入相同體積的乙醇。睪酮處理48 h后，每孔滴加20 μL MTS，37℃避光孵育3 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定其D值。

1.6 熒光定量PCR提取睪酮處理后的鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，在LightCycler 96熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)軟骨細(xì)胞標(biāo)志物ColⅡ、AGC和COMP mRNA的表達(dá)水平，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系、擴(kuò)增條件及數(shù)據(jù)處理參照本實(shí)驗(yàn)室已有方法進(jìn)行[9]。

表1 PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)分析運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行，組間方差分析采用One-Way ANOVA或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行。P<0.05表示差異顯著，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 AR基因的PCR擴(kuò)增提取梅花鹿鹿茸頂部組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增出與預(yù)期一致約為380 bp的目的基因片段(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker；1.AR基因擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 AR擴(kuò)增片段插入方向的鑒定將擴(kuò)增所得目的基因片段與克隆載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板、挑取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒后，利用PCR對(duì)其插入載體的方向進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，T7-SP6、T7-AR上游引物、SP6-AR下游引物和AR上游引物-AR下游引物擴(kuò)增后均有相應(yīng)長(zhǎng)度片段，提示AR擴(kuò)增片段反向插入質(zhì)粒(圖2)。將含有AR片段重組質(zhì)粒的菌液進(jìn)行測(cè)序，利用Gene Runner軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果與目的基因全序列，結(jié)果顯示，AR擴(kuò)增片段的同源性為98%，說(shuō)明目的基因成功插入載體中，插入方向與PCR鑒定結(jié)果相一致(圖3)。

1.T7-SP6；2.T7-AR上游引物；3.T7-AR下游引物；4.SP6-AR上游引物；5.SP6-AR下游引物；6.AR上游引物-AR下游引物；M.DL2000 DNA Marker

圖3 AR片段重組質(zhì)粒的菌液測(cè)序結(jié)果

2.3 AR在梅花鹿茸角中的表達(dá)使用地高辛標(biāo)記的反義cRNA探針進(jìn)行原位雜交，檢測(cè)AR mRNA在梅花鹿茸角中的表達(dá)情況，棕色為陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)果顯示，AR mRNA在梅花鹿茸角的表皮層、真皮層和間充質(zhì)層內(nèi)均有表達(dá)，但在不同部位的表達(dá)強(qiáng)度存在差異，AR mRNA在表皮層的表達(dá)水平較低，在真皮成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)水平較高，而在毛囊和皮脂腺內(nèi)未見(jiàn)明顯陽(yáng)性信號(hào)(圖4)。

A.鹿茸表皮和真皮(×40)；B.鹿茸表皮和真皮(×100)；C.鹿茸間充質(zhì)層(×40)；D.鹿茸間充質(zhì)層(×100)

2.4 睪酮對(duì)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響將睪酮用無(wú)水乙醇溶解，用質(zhì)量濃度為10-6g/L的睪酮處理鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞48 h后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，睪酮對(duì)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞的增殖活性未見(jiàn)明顯影響(圖5)。

圖5 睪酮對(duì)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響

2.5 睪酮對(duì)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞分化的影響鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞用終質(zhì)量濃度為10-6g/L睪酮處理，通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)睪酮作用24，48，72 h后，鹿茸軟骨細(xì)胞標(biāo)志物ColⅡ、AGC和COMP mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，睪酮可顯著促進(jìn)ColⅡ、AGC和COMP的表達(dá)，且隨著睪酮作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ColⅡ、AGC和COMP的表達(dá)水平呈逐漸上升的趨勢(shì)，在72 h時(shí)表達(dá)水平達(dá)到最大值(圖6)。

*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)

3 討論

梅花鹿鹿茸角的再生方式非常獨(dú)特，鹿茸角的再生過(guò)程是以茸角干細(xì)胞為基礎(chǔ)的復(fù)雜的形成過(guò)程[10]。茸角頂端間充質(zhì)層內(nèi)的鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞具有旺盛的增殖和分化能力，可發(fā)育為軟骨組織[11]。鹿茸角的快速生長(zhǎng)和周期性脫落的特性使得鹿茸角成為研究骨骼形成及器官再生的理想模型。

眾所周知，多種激素參與了鹿茸角的快速發(fā)育過(guò)程，它們共同調(diào)控鹿的角柄發(fā)生和茸角的快速生長(zhǎng)，而雄激素在該過(guò)程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。睪酮作為體內(nèi)雄激素的主要存在形式，通過(guò)AR介導(dǎo)鹿的角柄和茸角的發(fā)育過(guò)程[12]。由于角柄和茸角對(duì)睪酮的敏感性不同，致使鹿茸角在高質(zhì)量濃度的睪酮作用下會(huì)發(fā)生完全的骨化，而鹿的角柄卻能持續(xù)發(fā)育，并能在下一個(gè)生茸周期啟動(dòng)新茸角的再生過(guò)程[13]。

鹿體內(nèi)睪酮水平的周期性變化與鹿茸的周期性生長(zhǎng)、骨化及茸皮脫落過(guò)程有關(guān)，鹿體內(nèi)的睪酮水平在鹿茸角快速生長(zhǎng)期和脫落期含量較低，而在鹿茸角骨化階段含量較高[14]。據(jù)報(bào)道，處于快速生長(zhǎng)期的茸角，低濃度的睪酮可通過(guò)調(diào)控茸角頂端細(xì)胞的有絲分裂來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞的增殖，而高濃度的睪酮?jiǎng)t會(huì)促進(jìn)體內(nèi)鈣鹽的沉積，加快茸角的骨化過(guò)程而抑制其生長(zhǎng)[15]。同時(shí)，內(nèi)源性睪酮可通過(guò)影響茸角的脫落時(shí)間來(lái)決定次年再生茸角的大小，體內(nèi)睪酮濃度降低至閾值水平，則會(huì)激活破骨細(xì)胞的活性，促使鹿角提前脫落，因而在繁殖季節(jié)開(kāi)始前有更多的時(shí)間長(zhǎng)出新的茸角[16]。目前，關(guān)于睪酮在鹿體內(nèi)發(fā)揮作用的機(jī)制主要有3種：第1種是通過(guò)睪酮部分轉(zhuǎn)化為雌激素后促進(jìn)鹿茸軟骨細(xì)胞的成熟；第2種是通過(guò)增強(qiáng)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞及軟骨細(xì)胞對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)的敏感性，介導(dǎo)其對(duì)兩者的促增殖效應(yīng)[17]；第3種是通過(guò)促進(jìn)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)茸角生長(zhǎng)的作用[18]?？傊?，睪酮與鹿茸角的周期性脫落與再生過(guò)程密切相關(guān)，而關(guān)于睪酮對(duì)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖與分化的影響目前尚不明確。

本試驗(yàn)利用原位雜交方法研究了AR mRNA在梅花鹿茸角中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示AR mRNA在鹿茸組織的多個(gè)部位均有表達(dá)，其中在鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量較高，提示雄激素可能在鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞的增殖與分化過(guò)程發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步研究睪酮對(duì)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖的影響，本試驗(yàn)用質(zhì)量濃度為10-6g/L的睪酮處理鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞48 h后，MTS結(jié)果顯示，睪酮對(duì)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞增殖的作用并不明顯；而熒光定量PCR檢測(cè)了軟骨細(xì)胞標(biāo)志物ColⅡ、AGC和COMP后發(fā)現(xiàn)，這3種軟骨細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)水平均隨睪酮作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出表達(dá)量顯著增加的趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，睪酮可能在鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

綜上，睪酮對(duì)梅花鹿鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響，但能促進(jìn)鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化進(jìn)程。但有關(guān)睪酮在鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。