SFN通過Nrf2信號通路緩解ACAC誘導的奶牛乳腺上皮細胞氧化應激

唐 燕，羅勝繽，孫旭東，徐 闖

(黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319)

酮病是奶牛圍產(chǎn)期常見的代謝性疾病，由于泌乳所需能量增加而干物質攝入量(dry matter intake，DMI)降低，通常表現(xiàn)出能量負平衡(negative energy balance，NEB)[1]。為適應NEB，機體啟動脂肪動員產(chǎn)生大量游離脂肪酸以滿足能量需求[2]，進而產(chǎn)生大量酮體，導致高酮血癥從而引發(fā)酮病。酮病奶牛處于氧化應激狀態(tài)，且與酮病奶牛代謝產(chǎn)生的高濃度酮體密切相關。此外，高濃度的酮體可引起奶牛乳腺組織氧化應激并造成氧化損傷[3]，進而影響奶牛乳腺組織的泌乳功能，最終導致產(chǎn)奶量降低和乳品質下降，嚴重制約我國奶業(yè)的發(fā)展。乙酰乙酸(acetoacetic acid,ACAC)是奶牛體內酮體的主要形式之一，高濃度的ACAC可促進ROS的產(chǎn)生誘導氧化應激[4]。乳腺上皮細胞是奶牛乳腺組織泌乳的基本功能單位，維持其正常生理功能對奶牛生產(chǎn)性能至關重要。因此，如何緩解奶牛乳腺上皮細胞氧化損傷并探索其潛在治療靶點及藥物是我國奶業(yè)發(fā)展的迫切需求。

核轉錄因子NF-E2相關因子2(nuclear factor E2-reated factor 2,Nrf2)是一種參與調控細胞氧化還原平衡的轉錄激活因子[5]。目前，Nrf2是研究細胞保護反應分子機制的熱門靶點。通常，Nrf2與細胞質中的Kelch-like ECH相關蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)以復合物形式存在[6]。在細胞發(fā)生氧化應激時，Nrf2從Keap1中釋放出來并移位到細胞核，與抗氧化反應元件(antioxidant responseelement，ARE)結合，激活包括NQO1和HO-1在內的細胞抗氧化基因的轉錄[7-8]，從而發(fā)揮抗氧化作用。據(jù)報道，激活Nrf2信號通路可以緩解H2O2誘導的奶牛乳腺上皮細胞氧化應激[9-10]。

蘿卜硫素(SFN)是存在于花椰菜等十字花科蔬菜中的一種天然的異硫氰酸酯，在抗氧化、抗炎等細胞保護反應中發(fā)揮著重要作用[11]。此外，SFN是Nrf2的天然植物化學激活劑，因其對氧化應激和慢性炎癥引起的疾病可起到預防和治療作用[12]，被廣泛應用于食品添加劑。與其他植物源性的化學補充劑(如姜黃素、水飛薊素和白藜蘆醇)相比，SFN可以更有效地激活Nrf2，誘導一系列細胞保護基因的表達[13]。發(fā)生氧化應激時，SFN可激活Nrf2/ARE抗氧化途徑，從而促進抗氧化基因的表達，如HO-1和NQO1等[14]。研究表明，SFN可通過促進Nrf2的核移位來緩解H2O2誘導的人肝細胞氧化應激損傷[15]。這些研究說明SFN可以通過激活Nrf2信號通路從而緩解氧化應激，但尚不清楚SFN是否可以通過激活Nrf2信號通路從而緩解ACAC誘導的奶牛乳腺上皮細胞氧化應激。

因此，本試驗通過對奶牛乳腺上皮細胞系MAC-T添加不同濃度的ACAC，建立酮病奶牛氧化應激模型，并添加10 μmol/L的SFN，檢測Nrf2蛋白相對表達情況及其下游基因HO-1和NQO1基因表達水平，并檢測ROS和MDA的含量及SOD和GSH-Px的活性，旨在探討SFN保護奶牛乳腺上皮細胞免受ACAC誘導的氧化應激的分子調控機制，為防治酮病奶牛代謝應激導致的乳腺組織氧化損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器DMEM-F12培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(CLARK公司)；RIPA細胞組織裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒和ROS檢測試劑盒均購自碧云天公司；TRIzol和RNA反轉錄試劑盒購自TaKaRa；SYBR green plus(Roche，Norwalk，CT)；MDA含量檢測試劑盒及SOD和GSH-Px活性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Nrf2抗體(Abcam)；GAPDH抗體(absin)；二抗(博士德)；ECL化學發(fā)光溶液(Pierce Biotechnology Inc.)；流式細胞儀(FACSCalibur，Becton Dickinson)；722N分光光度計(上海精密儀器有限公司)；熒光定量PCR儀(7500 Real-Time PCR系統(tǒng)Applied Biosystems)；Amersham Imager 600化學發(fā)光成像儀(美國GE的Fujifilm光學系統(tǒng))。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理本試驗使用的奶牛乳腺上皮細胞系(MAC-T)購自上海傳秋生物科技有限公司。用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)MAC-T，每隔24 h更換培養(yǎng)基1次。用0，0.6，1.2，1.8 mmol/L ACAC分別處理MAC-T細胞24 h。用10 μmol/L SFN處理MAC-T細胞24 h后再用1.2 mmol/L ACAC處理24 h。

1.3 檢測指標

1.3.1ROS的測定 采用DCFH-DA染色法檢測ROS。用25 μmol/L DCFH-DA處理細胞并孵育20 min,然后用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3次，收集細胞重新懸浮于臺式液中，使用流式細胞儀測定熒光,細胞內ROS濃度為相對熒光。

1.3.2氧化應激指標的測定 將原細胞培養(yǎng)液棄掉后每孔加入1 mL PBS清洗，然后收集細胞，按照試劑盒說明書測定細胞中MDA的含量，使用722N分光光度計在532 nm(MDA)處讀取D值；根據(jù)試劑盒說明書檢測GSH-Px和SOD的活性，分別在560 nm(SOD)和420 nm(GSH-Px)處讀取D值。

1.3.3RNA分離和實時定量PCR(qPCR) 細胞在六孔板中處理結束后，按照每孔1 mL的量加入TRIzol，用移液槍吹打數(shù)次并收集細胞于無RNA酶的EP管中。之后按照加入氯仿抽提—離心—加入異丙醇沉淀—離心—酒精洗滌—離心的步驟提取細胞總RNA。根據(jù)RNA濃度，將1 μg RNA樣品使用試劑盒反轉錄為cDNA。使用SYBR green plus試劑盒在7500 Real-Time PCR系統(tǒng)檢查靶基因的表達量；在Excel軟件中用2-△△Ct方法計算目的基因的表達水平。本研究中所用全部引物見表1。

表1 Real-time PCR分析所用引物

1.3.4Western blot 細胞處理結束后收集細胞，加入適量細胞組織裂解液RIPA，振蕩后在冰上靜置，10 min/次，共振蕩3次。振蕩結束后將懸液離心并收集上清液，按照BCA法的步驟測定蛋白質量濃度并調整質量濃度加入loading buffer制成蛋白樣品。使用10%濃度的SDS-PAGE將30 μg蛋白在80 V、30 min和120 V、60 min條件下電泳分離。將完成電泳后的目的蛋白轉至PVDF膜上，然后將膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫條件下封閉2 h。4℃搖床孵育一抗過夜。一抗孵育結束后，使用含1%Tween 20和10%TBS的TBST緩沖溶液洗滌5次，每次5 min；然后在室溫條件下水平搖床孵育二抗1 h；TBST洗滌5次，每次5 min；最后在Amersham Imager 600化學發(fā)光成像儀中將膜曝光成像。將得到的目的蛋白條帶進行灰度分析，并進行統(tǒng)計學比較后制作成柱狀圖。

1.4 統(tǒng)計學分析采用IBM SPSS Statistics 26.0軟件對各組試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，各組間的顯著性差異用字母表示(P<0.05)，數(shù)據(jù)表示形式為平均數(shù)±標準誤。

2 結果

2.1 ACAC誘導奶牛乳腺上皮細胞氧化應激與對照組相比，1.2，1.8 mmol/L ACAC處理組MAC-T細胞中ROS和MDA含量顯著升高(圖1，P<0.05)，而SOD和GSH-Px的活性顯著降低(圖2，P<0.05)。

A.ROS含量；B.MDA含量。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 SFN預處理緩解ACAC對Nrf2信號通路活性的抑制作用與DMSO組相比，ACAC+DMSO處理組的Nrf2蛋白水平顯著降低(圖3A，B;P<0.05)。然而，與DMSO組相比，SFN處理組Nrf2蛋白表達水平顯著升高(圖3，P<0.05)。與ACAC+DMSO處理組相比，ACAC+SFN處理組Nrf2蛋白表達水平顯著升高(圖3,P<0.05)。與DMSO組相比，ACAC+DMSO處理組的Nrf2下游基因HO-1和NQO1 mRNA表達量顯著降低(圖4,P<0.05)。與DMSO組相比，SFN處理組HO-1和NQO1 mRNA的表達量顯著升高(圖4,P<0.05)；與ACAC+DMSO處理組相比，ACAC+SFN處理組HO-1和NQO1 mRNA表達量顯著升高(圖4A,B；P<0.05)。

A.Nrf2蛋白表達；B.Nrf2蛋白相對水平

A.HO-1基因表達水平；B.NQO1基因表達水平

2.3 SFN預處理緩解ACAC誘導的氧化應激與DMSO組相比，ACAC+DMSO處理組的MAC-T細胞中的ROS和MDA含量顯著升高(圖5,P<0.05)，而SOD和GSH-Px的活性顯著降低(圖6,P<0.05)。與ACAC+DMSO處理組相比，ACAC+SFN處理組的MAC-T細胞中的ROS和MDA的含量顯著降低(圖5,P<0.05)，而SOD和GSH-Px的活性顯著升高(圖6,P<0.05)。

A.ROS含量；B.MDA含量。

A.SOD活性；B.GSH-Px活性

3 討論

酮病奶牛乳腺組織存在嚴重的氧化應激，導致乳腺上皮細胞氧化損傷，降低奶牛泌乳性能[3]。因此，增強奶牛乳腺組織的抗氧化能力是緩解氧化應激導致的氧化損傷以及增強泌乳性能的有效治療策略。SFN是一種廣泛存在于十字花科蔬菜家族的Nrf2的天然激活劑，具有很強的抗氧化作用[16]。本試驗結果表明，SFN具有激活Nrf2信號通路來抵抗ACAC誘導的氧化應激的生物學活性。因此，我們推測SFN可能是一種潛在的預防和治療反芻動物氧化損傷的藥物。

酮病奶牛泌乳早期因發(fā)生NEB存在嚴重的代謝應激[17]。此時，因泌乳所需能量大幅提高，大量游離脂肪酸和酮體隨血液進入乳腺組織以滿足能量需求[18]。ACAC是酮體的主要形式之一，高濃度酮體導致奶牛乳腺組織氧化損傷[19-20]，損害乳腺泌乳功能。這是由于大量酮體誘導過量的ROS產(chǎn)生導致抗氧化能力降低造成氧化還原失衡從而引發(fā)氧化應激，最終導致細胞脂質、蛋白質和DNA發(fā)生氧化對周圍組織造成實質性的損害[21]。因此，對于圍產(chǎn)期奶牛而言，維持細胞內氧化還原平衡是抵御氧化應激相關疾病的關鍵所在。SFN是一種PhaseⅡ型酶的天然誘導劑，能有效地誘導HO-1和NQO1等抗氧化酶，增強細胞和器官抵御各種氧化應激損傷的抗氧化能力[22-23]。本試驗結果表明，SFN預處理緩解了ACAC對抗氧化酶SOD和GSH-Px活性的抑制作用，并增強了HO-1和NQO1基因的表達，這些結果強調了SFN有益于增強細胞抗氧化系統(tǒng)的防御能力。此外，ROS和MDA濃度降低也說明了SFN可增強奶牛乳腺上皮細胞的抗氧化能力，從而緩解ACAC誘導的氧化應激。然而，目前尚不清楚ACAC誘導的MAC-T氧化應激模型是否能夠模擬圍產(chǎn)期酮病奶牛體內的氧化應激狀態(tài)。因此，應進一步研究SFN對酮病奶牛乳腺組織氧化還原狀態(tài)的調節(jié)作用。

SFN的抗氧化能力源于激活Nrf2信號通路以促進抗氧化基因的轉錄[24]。內源性抗氧化防御機制包括SOD、GSH-Px和HO-1等多種Ⅱ相抗氧化酶[25-26]。這些抗氧化酶的表達受抗氧化反應原件ARE啟動子序列的調控，而ARE受Nrf2轉錄因子的調控[27]。Nrf2必須移位到細胞核中與ARE結合才能啟動Ⅱ相抗氧化酶的轉錄[28]。有研究表明，SFN通過激活Nrf2-ARE途徑，上調抗氧化酶基因的表達清除過多的ROS，來保護顆粒細胞免受氧化應激損傷[29]。ZHAO等[30]發(fā)現(xiàn),SFN通過激活Nrf2來激活HO-1，減輕膿毒癥導致的氧化應激，從而緩解大鼠急性肺損傷。CHEN等[31]研究表明，SFN通過誘導Nrf2介導的抗氧化反應保護神經(jīng)嵴細胞抵御乙醇誘導的氧化應激。以上結果都強調了SFN通過激活Nrf2途徑來抑制氧化應激誘導的氧化損傷的作用。在本試驗中，SFN預處理減弱了ACAC對Nrf2的表達以及Nrf2下游基因HO-1和NQO1的mRNA水平的抑制作用,并且SFN預處理降低了活性氧ROS和細胞毒性產(chǎn)物MDA含量，也提升了細胞的抗氧化酶活性。這些結果說明SFN可以通過激活Nrf2，從而增強奶牛乳腺上皮細胞的抗氧化能力來緩解氧化應激，與其他研究的結果是一致的。因此，本試驗的結果表明SFN通過激活Nrf2增加抗氧化酶活性來減輕ACAC誘導的奶牛乳腺上皮細胞氧化應激。目前，SFN提取純化工藝的發(fā)展日益成熟，可實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[32]。因此SFN作為天然植物的抗氧化性膳食補充劑，具備良好的市場應用前景并為未來奶牛臨床疾病的防治提供了新的方向和手段。

本試驗結果表明，SFN可以緩解ACAC誘導的奶牛乳腺上皮細胞氧化應激。SFN通過增加Nrf2的蛋白表達及其下游基因HO-1和NQO1的mRNA水平，并增強抗氧化酶活性，降低ROS和細胞毒性產(chǎn)物MDA的含量，從而發(fā)揮抗氧化作用。綜上，SFN通過激活Nrf2信號通路，增加抗氧化基因的表達并增強奶牛乳腺上皮細胞的抗氧化能力，緩解ACAC誘導的奶牛乳腺上皮細胞氧化應激。