Sn受體N端V-set結(jié)構(gòu)域和CD163受體SRCR5結(jié)構(gòu)域在PRRSV-ADE感染中的作用

張留君，師瑞龍，王煥弟，趙 磊，王大勝，葉春妹，郭敏娜，劉德義*，夏平安

(1.安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起豬的最重要的傳染病之一，也是導(dǎo)致我國養(yǎng)豬業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失的頭號疫病。PRRSV是動脈炎病毒(Artervirus)，其為有包膜的單股正鏈RNA病毒，可以在豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)中復(fù)制，也可在Marc-145細(xì)胞中增殖[1]。PRRSV主要依靠受體進(jìn)入宿主細(xì)胞。唾液酸黏附素(Sn)受體和CD163受體已被證實(shí)是PRRSV的2種重要病毒受體。Sn受體也被稱作CD169或者Siglec-1，歸屬于免疫球蛋白(Ig)超家族，是一種典型的Ⅰ型跨膜糖基化蛋白，由17個重復(fù)的胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域、1個疏水跨膜區(qū)和1個短的細(xì)胞質(zhì)尾部組成。Sn受體的胞外Ig樣結(jié)構(gòu)域又進(jìn)一步被細(xì)分成1個N端V-set結(jié)構(gòu)域和16個C2-set結(jié)構(gòu)域[2]。CD163受體(又名M130蛋白)在1987年首次被鑒定，是一種相對分子質(zhì)量約為130 kDa的Ⅰ型跨膜糖基化蛋白，屬于富含半胱氨酸清道夫受體(SRCR)超家族[3]。人和哺乳動物的CD163受體由1個短的信號肽、1個包含9個SRCR結(jié)構(gòu)域的大胞外區(qū)、1個疏水性的跨膜區(qū)域和1個短的細(xì)胞漿尾部組成[4]。

在PRRSV感染過程中，Sn受體先借助其N端V-set結(jié)構(gòu)域黏附、內(nèi)化病毒粒子，而CD163受體隨后通過其SRCR5結(jié)構(gòu)域協(xié)助病毒粒子脫衣殼、釋放基因組RNA[5-6]。PRRSV感染豬后雖然能夠快速地誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，但是病毒感染早期誘導(dǎo)產(chǎn)生的主要是不具備中和活性的非中和抗體，而具有中和活性的中和抗體產(chǎn)生時(shí)間相對滯后且水平低下，并且非中和抗體或亞中和水平抗體還可增強(qiáng)PRRSV復(fù)制，該現(xiàn)象即為抗體依賴性增強(qiáng)作用(antibody dependent enhancement,ADE)[7]。ADE在促進(jìn)PRRSV持續(xù)性感染的同時(shí)，也使得PRRS難以通過以產(chǎn)生抗體為主的常規(guī)疫苗進(jìn)行有效防控[8]。因此，設(shè)計(jì)新型PRRS疫苗或研制新型抗PRRSV藥物迫在眉睫，但其首要解決的核心科學(xué)問題是闡明PRRSV-ADE感染機(jī)制。

早期研究發(fā)現(xiàn)，病毒的Sn受體和CD163受體參與PRRSV-ADE感染，但其發(fā)揮功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域并不清楚[9-10]。本試驗(yàn)通過研究Sn受體N端V-set結(jié)構(gòu)域和CD163受體SRCR5結(jié)構(gòu)域在PRRSV-ADE感染中是否發(fā)揮作用，為進(jìn)一步理解PRRSV-ADE感染的作用機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和抗體美洲型PRRSV HeN-3毒株(GenBank登錄號：FJ237420)和非洲綠猴腎細(xì)胞系Marc-145細(xì)胞由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院夏平安教授饋贈；豬原代PAMs分離自4～6周齡PRRSV抗原和抗體均為陰性的健康仔豬，具體方法參考文獻(xiàn)[11]；豬抗PRRSV高免血清(ELISA效價(jià)：6 400)由本實(shí)驗(yàn)室制備并純化成IgG(豬抗PRRSV特異性IgG)；豬陰性IgG(PNI)純化自PRRSV抗原和抗體雙陰性的健康仔豬血清；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自美國Earthox公司。

1.2 菌株、載體和試驗(yàn)動物原核表達(dá)菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京Solarbio公司；原核表達(dá)載體pET-32a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存；清潔級新西蘭大白兔(體質(zhì)量約1.5 kg)購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.3 主要試劑和儀器膠回收、質(zhì)粒提取、普通PCR、核酸和蛋白質(zhì)電泳等相關(guān)試劑及試劑盒均購自上海生工公司；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR等相關(guān)試劑均購自TaKaRa公司；Western blot試劑、DAB顯色試劑盒等均購自北京Solarbio公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.4 感染性PRRSV-抗體免疫復(fù)合物的制作將豬抗PRRSV特異性IgG(850 mg/L)與等體積的PRRSV懸液(2 000 TCID50/mL)混合均勻后在37℃孵育1 h，以制備成感染性病毒-抗體免疫復(fù)合物(PRRSV+ICs)。同時(shí)，將豬陰性IgG(850 mg/L)與等體積的PRRSV懸液(2 000 TCID50/mL)混合均勻后37℃孵育1 h，以制備成陰性對照(PRRSV+PNI)。

1.5 目的基因的PCR擴(kuò)增使用TRIzol試劑從PAMs中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后作為模板PCR擴(kuò)增出Sn受體N端V-set結(jié)構(gòu)域(Sn-N-V-set)和CD163受體SRCR5結(jié)構(gòu)域(CD163-SRCR5)的基因片段。引物序列見表1(斜體、加粗部分為保護(hù)性堿基,字符邊框內(nèi)部分為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn))。擴(kuò)增體系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL,引物F、引物R各1 μL，cDNA模板2 μL，去離子水21 μL，總體積50 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃4 min；94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,30個循環(huán)；最后72℃10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 PCR擴(kuò)增目的基因的引物序列

1.6 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定使用膠回收試劑盒對Sn-N-V-set和CD163-SRCR5結(jié)構(gòu)域基因片段進(jìn)行回收、純化，雙酶切后與pET-32a(+)載體連接，以構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-Sn-N-V-set和pET-32a-CD163-SRCR5。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，并涂布于含有氨芐青霉素(100 mg/L)的LB固體平板上，過夜培養(yǎng)后挑取單個菌落在LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),隨后依次進(jìn)行菌液PCR、雙酶切及測序鑒定。

1.7 重組目的蛋白的原核表達(dá)與純化對BL21(DE3)重組表達(dá)菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，摸索最佳IPTG誘導(dǎo)劑濃度和最佳誘導(dǎo)時(shí)間,分析重組蛋白的可溶性，并對重組蛋白進(jìn)行大量表達(dá)與純化。

1.8 多克隆抗體的制備與純化將已純化重組蛋白與弗氏佐劑混合乳化后免疫新西蘭大白兔，以制備針對重組蛋白的兔源特異性多克隆抗體。通過間接ELISA試驗(yàn)檢測多克隆抗體的效價(jià)。同時(shí)，采用常規(guī)方法進(jìn)行Western blot分析多克隆抗體的特異性，其中重組蛋白作為抗原電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，多克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體作為二抗。最后，利用飽和硫酸銨鹽析法和DEAE-52 離子交換層析技術(shù)將效價(jià)符合要求、特異性較強(qiáng)的多克隆抗體純化成IgG，并經(jīng)10%SDS-PAGE電泳進(jìn)行純度鑒定。

1.9 PRRSV-ADE感染試驗(yàn)將200 μL PRRSV+ICs復(fù)合物、PRRSV+PNI復(fù)合物或PRRSV懸液(200 TCID50)接種到24孔培養(yǎng)板中的單層PAMs上，37℃孵育1 h后棄掉未吸附的復(fù)合物，并用滅菌PBS溶液洗滌1次，然后加入500 μL的完全培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)12，24，36，48，60，72 h后分別收集上清液，用參考文獻(xiàn)[12]建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法測定上清中PRRSV的RNA拷貝數(shù)，同時(shí)參照文獻(xiàn)[13]表述的方法在Marc-145細(xì)胞中測定上清中PRRSV的病毒滴度。

1.10 Sn受體N端V-set結(jié)構(gòu)域和CD163受體SRCR5結(jié)構(gòu)域的封閉對PRRSV-ADE感染的影響將200 μL的兔抗豬Sn受體N端V-set結(jié)構(gòu)域IgG(Anti-Sn-N-V-set IgG)(2.0 g/L)、兔抗豬CD163受體SRCR5結(jié)構(gòu)域IgG(Anti-CD163-SRCR5 IgG)(2.0 g/L)或兔陰性IgG(Negative IgG)(2.0 g/L)加入到24孔培養(yǎng)板中的單層PAMs上，37℃孵育1 h后棄掉多余的IgG，并用滅菌PBS溶液洗滌1次。然后再加入200 μL的PRRSV+ICs復(fù)合物，37℃孵育1 h后棄掉未吸附的復(fù)合物，用滅菌PBS溶液再洗滌1次，最后加入500 μL的完全培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)12，24，36，48，60，72 h 后分別收集上清液，并測定上清中PRRSV的RNA拷貝數(shù)及病毒滴度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用GraphPad Prism 5.0 軟件，采用雙因素方差分析法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)P值小于0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，***表示P<0.001，**表示P< 0.01，*表示P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增Sn-N-V-set和CD163-SRCR5的結(jié)構(gòu)域基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示目的條帶位置與預(yù)期片段大小相一致(圖1)。

A.Sn-N-V-set結(jié)構(gòu)域基因片段的擴(kuò)增結(jié)果；B.CD163-SRCR5結(jié)構(gòu)域基因片段的擴(kuò)增結(jié)果。M.DNA Marker；A1,B1.PCR產(chǎn)物

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定將pET-32a-Sn-N-V-set和pET-32a-CD163-SRCR5重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切片段條帶大小符合預(yù)期結(jié)果(圖2),并且測序結(jié)果也顯示2個重組質(zhì)粒均構(gòu)建正確。

A.重組質(zhì)粒pET-32a-Sn-N-V-set的雙酶切鑒定結(jié)果;B.重組質(zhì)粒pET-32a-CD163-SRCR5的雙酶切鑒定結(jié)果。M1.DL2000 DNA Marker;M2.DL10000 DNA Marker；A1,B1.菌液PCR產(chǎn)物；A2,B2.雙酶切產(chǎn)物

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定與純化經(jīng)不斷優(yōu)化，pET-32a-Sn-N-V-set和pET-32a-CD163-SRCR5等2種重組質(zhì)粒的最佳誘導(dǎo)表達(dá)溫度為37℃、最佳IPTG誘導(dǎo)劑濃度為0.2 mmol/L、最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，2種重組蛋白均以包涵體形式表達(dá)，通過使用尿素法純化后獲得了高純度的目的蛋白(圖3)。

M.蛋白Marker；1.Sn-N-V-set結(jié)構(gòu)域重組蛋白；2.CD163-SRCR5結(jié)構(gòu)域重組蛋白

2.4 兔源多克隆抗體的制備與純化使用Sn-N-V-set和CD163-SRCR5的結(jié)構(gòu)域重組蛋白免疫大白兔后制備出了兔抗2種重組蛋白的多克隆抗體，經(jīng)ELISA檢測其抗體效價(jià)均在12 800以上。Western blot結(jié)果顯示，2種兔源多克隆抗體均可與相對應(yīng)的重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，免疫印跡條帶大小與預(yù)期大小相吻合(圖4)。通過對多克隆抗體進(jìn)行純化，獲得了兔抗2種重組蛋白的高純度特異性IgG(圖5)。

A.兔抗Sn-N-V-set結(jié)構(gòu)域重組蛋白多克隆抗體的Western blot分析；B.兔抗CD163-SRCR5結(jié)構(gòu)域重組蛋白多克隆抗體的Western blot分析。M.蛋白Marker；A1,B1.Western blot分析結(jié)果

M.蛋白Marker；1.Anti-Sn-N-V-set IgG；2.Anti-CD163-SRCR5 IgG

2.5 PRRSV-ADE感染試驗(yàn)結(jié)果與PRRSV+PNI復(fù)合物已感染PAMs組(對照組)相比，PRRSV+ICs復(fù)合物在感染PAMs后12～72 h，其被感染細(xì)胞上清液中PRRSV的RNA拷貝數(shù)和滴度均顯著升高，其中病毒RNA拷貝數(shù)升高了19.72～38.97倍，病毒滴度升高了15.06～33.91倍(圖6)。結(jié)果表明，豬抗PRRSV特異性抗體(IgG)在體外能夠增強(qiáng)PRRSV對宿主細(xì)胞PAMs的感染能力，即介導(dǎo)ADE感染。

A.豬抗PRRSV特異性IgG對PRRSV RNA拷貝數(shù)的影響；B.豬抗PRRSV特異性IgG對PRRSV滴度的影響。***表示P<0.001，下同

2.6 Sn受體N端V-set結(jié)構(gòu)域和CD163受體SRCR5結(jié)構(gòu)域的封閉對PRRSV-ADE感染的影響感染后12～72 h，與預(yù)先用兔Negative IgG處理后再被PRRSV+ICs復(fù)合物感染PAMs組(對照組)相比，預(yù)先用兔Anti-Sn-N-V-set IgG封閉后再被PRRSV+ICs復(fù)合物感染PAMs和預(yù)先用兔Anti-CD163-SRCR5 IgG封閉后再被PRRSV+ICs復(fù)合物感染PAMs培養(yǎng)上清液中PRRSV的RNA拷貝數(shù)及滴度均顯著降低(圖7)。結(jié)果表明，Sn受體N端V-set結(jié)構(gòu)域和CD163受體SRCR5結(jié)構(gòu)域的封閉能夠抑制PAMs中的PRRSV-ADE感染。

A.Sn受體N端V-set結(jié)構(gòu)域和CD163受體SRCR5結(jié)構(gòu)域的封閉對ADE感染中PRRSV RNA拷貝數(shù)的影響；B.Sn受體N端V-set結(jié)構(gòu)域和CD163受體SRCR5結(jié)構(gòu)域的封閉對ADE感染中PRRSV滴度的影響。**表示P<0.01

3 討論

PRRSV-ADE感染的作用機(jī)制一直是國內(nèi)外獸醫(yī)病毒學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域研究的核心科學(xué)問題。早期研究認(rèn)為：病毒與其特異性抗體形成的感染性病毒-抗體免疫復(fù)合物，可借助抗體(IgG)的Fc部分與表達(dá)在宿主細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)膜表面的Fc受體發(fā)生特異性的相互結(jié)合，一方面增強(qiáng)對病毒的黏附和內(nèi)吞，另一方面下調(diào)Ⅰ型干擾素等抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)水平來抑制天然抗病毒免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致病毒感染性增強(qiáng)并有助于病毒持續(xù)性感染[7,14-16]。但是，該機(jī)制無法對以下2種現(xiàn)象做出解釋：第一，病毒與其特異性中和水平抗體形成的病毒-抗體免疫復(fù)合物通過表達(dá)在宿主免疫細(xì)胞膜表面的Fc受體進(jìn)入到宿主免疫細(xì)胞胞內(nèi)后再無法復(fù)制，而是被宿主免疫細(xì)胞的溶酶體系統(tǒng)完全地消化并降解掉；第二，那些僅能夠感染非免疫細(xì)胞的病毒，其特異性的非中和抗體或亞中和水平的抗體與其形成的病毒-抗體免疫復(fù)合物當(dāng)通過表達(dá)在非宿主免疫細(xì)胞膜表面的Fc受體進(jìn)入到免疫細(xì)胞中后，最終會被非宿主免疫細(xì)胞中的溶酶體系統(tǒng)完全地降解并清除掉。這2種現(xiàn)象表明，當(dāng)前關(guān)于PRRSV-ADE感染的機(jī)制存在明顯不足，需要對其進(jìn)行進(jìn)一步地深入研究與完善。

TAKEDA等[17]早期在對人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)：HIV-1-ADE感染不僅需要Fc受體參與，還需要病毒受體CD4的參與。據(jù)報(bào)道，病毒受體ACE2能夠參與Fcγ受體依賴的新冠病毒ADE感染[18]。這些研究表明，宿主細(xì)胞膜表面的病毒天然受體在病毒ADE感染過程中可能發(fā)揮重要作用。先前，我們已經(jīng)報(bào)道Fc受體參與PRRSV-ADE感染[15]。本試驗(yàn)中我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Sn受體的N端V-set結(jié)構(gòu)域和CD163受體的SRCR5結(jié)構(gòu)域也參與PRRSV-ADE感染。分析其原因，可能是由于針對病毒的特異性非中和抗體和亞中和水平的抗體，沒有完全封閉住存在于病毒粒子表面并與感染宿主細(xì)胞密切相關(guān)的抗原結(jié)合表位，造成在PRRSV-ADE感染中，感染性的病毒-抗體免疫復(fù)合物既可以利用免疫復(fù)合物中抗體(IgG)的Fc部分與表達(dá)在宿主細(xì)胞膜表面的Fc受體相互結(jié)合，同時(shí)又能夠通過病毒粒子表面沒有被病毒特異性抗體封閉住的抗原結(jié)合表位與表達(dá)在宿主細(xì)胞膜表面的病毒受體的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域(Sn受體N端V-set結(jié)構(gòu)域和CD163受體SRCR5結(jié)構(gòu)域)特異性結(jié)合，從而引起病毒復(fù)制。總之，本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步完善了PRRSV-ADE感染的分子機(jī)制，增強(qiáng)了人們對ADE現(xiàn)象的理解，對新型PRRS疫苗設(shè)計(jì)或新型抗PRRSV藥物研制具有指導(dǎo)意義。