冷暴露對(duì)小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)源性凋亡的影響

李東倪，薛琳琳，鄭小雪，徐 彬，郭景茹*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150111)

我國(guó)北方寒冷的氣候能夠降低動(dòng)物的生產(chǎn)與繁殖性能，也會(huì)對(duì)動(dòng)物的抗氧化、自身免疫等功能產(chǎn)生影響，這大大制約著我國(guó)北方地區(qū)畜牧業(yè)以及養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，產(chǎn)生了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失[1-4]。肝臟是機(jī)體重要的消化腺，同時(shí)作為代謝穩(wěn)態(tài)的中樞器官，與各項(xiàng)生命活動(dòng)都密切相關(guān),比如糖脂代謝、蛋白質(zhì)的合成與分解等，因此更易受到寒冷刺激的影響[5]。據(jù)報(bào)道，當(dāng)機(jī)體持續(xù)處于低溫環(huán)境下，能夠誘發(fā)肝硬化、肝炎等多種肝臟疾病的發(fā)生[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是機(jī)體感受外界環(huán)境變化的細(xì)胞器，蛋白質(zhì)合成與分解主要依靠于ER[7-8]。ER同時(shí)也具有維持鈣離子穩(wěn)態(tài)、參與蛋白質(zhì)的修飾與加工等功能。當(dāng)機(jī)體受到各種因素作用時(shí)，可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被破壞，從而影響蛋白的正確折疊，引起未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress，ERS)[9]。

ERS是發(fā)生在真核細(xì)胞中的一種具有保護(hù)作用的反應(yīng)機(jī)制。已有研究表明，ERS在肝臟損傷與肝臟疾病中能夠發(fā)揮重要作用，例如調(diào)控非酒精性脂肪肝、炎癥性急性肝功能衰竭等疾病中肝細(xì)胞的凋亡[10-11]。當(dāng)發(fā)生ERS時(shí)，首先引起未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。UPR主要由3條交聯(lián)的信號(hào)通路組成：蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)通路、肌醇需求酶1(IRE1)通路、轉(zhuǎn)錄活化因子6(ATF6)通路[12]。一定程度的ERS可啟動(dòng)細(xì)胞保護(hù)的效應(yīng)機(jī)制，減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷并重新對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)進(jìn)行維持[13]。若ER持續(xù)處在應(yīng)激狀態(tài)，UPR繼而通過(guò)上述3條信號(hào)通路激活下游的促凋亡信號(hào)分子，最終可引起內(nèi)源性凋亡[13]。肝細(xì)胞的各項(xiàng)生命活動(dòng)都是以線粒體功能為基礎(chǔ)的，線粒體參與肝細(xì)胞內(nèi)跨膜運(yùn)輸、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡等過(guò)程[14]。在線粒體介導(dǎo)的凋亡中，膜電位的下降是內(nèi)源性凋亡的早期標(biāo)志[9]。近年來(lái)的研究表明，位于線粒體內(nèi)外膜之間的細(xì)胞色素C(Cyt C)是線粒體凋亡信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白[15]，Cyt C被釋放到細(xì)胞質(zhì)是引起細(xì)胞凋亡的重要步驟。Cyt C結(jié)合細(xì)胞凋亡活化因子Apaf-1和Pro-Caspase-9，啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng),激活下游的Caspase家族蛋白[16]，使凋亡進(jìn)行下去，繼而激活由線粒體所介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡[17]。此外，也有研究證實(shí)Bcl-2家族也參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡過(guò)程[18]。促凋亡蛋白廣泛分布在細(xì)胞漿內(nèi)，當(dāng)促凋亡蛋白轉(zhuǎn)移至線粒體時(shí)能夠激活線粒體凋亡通路；抗凋亡蛋白定位在線粒體外膜上，參與調(diào)控Cyt C的釋放[18-19]。據(jù)此，本試驗(yàn)旨在探討冷暴露對(duì)小鼠肝臟ERS與內(nèi)源性凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑5周齡C57BL/6型雄性小鼠，體質(zhì)量23～25 g，購(gòu)自北京維通利華Charles River公司；GRP78、CHOP、XBP1、Bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-3、β-actin一抗、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、組織線粒體分離試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒、顯影發(fā)光液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器酶標(biāo)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))；ChemiDoc +化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))；CEA540Ge型人工智能氣候室(濟(jì)南旭邦電子科技有限公司)；MM400型混合型球磨儀(Retsch,德國(guó))；Micro17微型離心機(jī)(Thermo Scientific)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理C57BL/6型雄性小鼠在人工智能氣候室內(nèi)預(yù)飼7 d，飼養(yǎng)條件如下：溫度為(24±2)℃，濕度為40%，光照晝夜12 h交替。將試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為室溫對(duì)照組和冷暴露組，室溫對(duì)照組小鼠刺激刺溫度為(24±2)℃，濕度為40%。冷暴露組的刺激條件如下:溫度為(4±1)℃，濕度為40%，每天冷暴露 3 h，連續(xù)刺激3周。

1.4 樣品采集小鼠腹腔注射戊巴比妥進(jìn)行麻醉，頸椎脫臼處死，分離肝臟組織并采集樣品，樣品用于制備肝臟組織HE染色切片、Masson染色切片、透射電鏡切片和檢測(cè)肝臟組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)源性凋亡相關(guān)途徑蛋白表達(dá)變化。

1.5 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè)肝臟樣品經(jīng)過(guò)4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明化處理、石蠟浸蠟與包埋制作成連續(xù)切片；切片經(jīng)過(guò)二甲苯與乙醇處理后，制成HE與Masson染色切片，最后常規(guī)脫水、透明、封片。(1)HE染色：經(jīng)上述方法處理后，置于蘇木素染液中染色5 min，用水沖洗后置于乙醇中分化10 min，經(jīng)氨水返藍(lán)后，置于伊紅染液中染色2～3 min，染色后的切片經(jīng)不同梯度酒精脫水、透明、中性樹脂封片，然后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察肝臟組織病理學(xué)形態(tài)變化。(2)Masson染色：切片脫蠟、水洗，蘇木精液染色6 min，乙醇分化；切片經(jīng)麗春紅染色5 min后取出，經(jīng)磷鉬酸水溶液分化3 min，苯胺藍(lán)染色2 min，冰醋酸分化1 min，染色后的切片經(jīng)酒精脫水、封片，然后顯微鏡下觀察肝臟纖維組織變性情況。

1.6 肝臟組織透射電鏡觀察肝臟樣品經(jīng)戊二醛固定、磷酸漂洗液漂洗、乙醇脫水、包埋固化處理后制作成切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，然后通過(guò)透射電鏡觀察肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.7 Western blot檢測(cè)肝臟組織相關(guān)蛋白的表達(dá)取新鮮肝臟組織樣品并剪碎后放入1.5 mL離心管中，提取組織線粒體蛋白，根據(jù)分離試劑盒說(shuō)明書加入含PMSF的線粒體分離試劑A(線粒體分離試劑A與PMSF的比例為10∶1)；樣品經(jīng)混合球磨儀勻漿至完全裂解后，4℃、600×g離心5 min；提取管中上清液，4℃、1 000×g離心10 min；保留沉淀部分，沉淀即為分離得到的線粒體；管中加入蛋白上樣緩沖液，煮沸蛋白使其變性，隨后將蛋白樣品加入到10%、12%聚丙烯胺凝膠中進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)PVDF膜，5%蛋白免疫印跡封閉液室溫封閉1 h，洗膜后加入按比例稀釋的一抗，置于4℃下孵育過(guò)夜；次日，洗膜后加入按比例稀釋的二抗，室溫孵育1 h，按說(shuō)明配制ECL顯影液，使用凝膠成像系統(tǒng)(Image Lab)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析本試驗(yàn)使用Graphpad Prism 7.0軟件(Graphpad software，San Diego，CA，USA)計(jì)算各組的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以P<0.05為具有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟組織病理學(xué)變化HE染色結(jié)果顯示，室溫對(duì)照組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，未見明顯腫脹變性；冷暴露組小鼠肝臟發(fā)生輕微水樣變性，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。Masson染色結(jié)果顯示，室溫對(duì)照組小鼠肝臟細(xì)胞間質(zhì)未見明顯藍(lán)染；冷暴露組小鼠肝組織可見輕微的膠原纖維沉積(圖1)。

圖1 室溫對(duì)照組和冷暴露組小鼠肝臟組織學(xué)形態(tài)(10×40)

2.2 小鼠肝臟細(xì)胞透射電鏡觀察結(jié)果分析透射電鏡結(jié)果見圖2，紅色箭頭表示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，黑色箭頭表示線粒體)，冷暴露組小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞，線粒體發(fā)生輕微損傷。

圖2 透射電鏡觀察室溫對(duì)照組和冷暴露組小鼠肝細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體形態(tài)

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，冷暴露組小鼠肝臟組織內(nèi)GRP78、XBP1、CHOP蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)(圖3)。

A.對(duì)照組和冷暴露組小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)量的Western blot檢測(cè)結(jié)果；B～D.分別為GRP78、XBP1、CHOP與內(nèi)參β-actin比值分析結(jié)果。*P<0.05表示有顯著性差異

2.4 線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平通過(guò)Western blot檢測(cè)Caspase-3、Bax、Bcl-2、Cyt C的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，冷暴露組小鼠肝臟組織內(nèi)Cyt C蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)；Bax/Bcl-2、Cleaved-Caspase-3/Pro-Caspase-3表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)(圖4)。

A.對(duì)照組和冷暴露組小鼠肝臟線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的Western blot檢測(cè)結(jié)果；B～D.分別為Cyt C、Bax/Bcl-2、活化的Caspase-3/Caspase-3前體的表達(dá)變化。**P<0.01表示有極顯著性差異

3 討論

在畜牧業(yè)發(fā)展過(guò)程中，寒冷會(huì)引起機(jī)體免疫功能下降，影響機(jī)體生產(chǎn)、繁殖性能，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，是阻礙我國(guó)北方地區(qū)畜牧經(jīng)濟(jì)健康平穩(wěn)發(fā)展的直接因素之一[1]。肝臟作為機(jī)體的重要器官，與動(dòng)物機(jī)體各項(xiàng)生命活動(dòng)都密切相關(guān)，比如蛋白質(zhì)的合成與分解。除此之外，肝臟也具有吞噬和免疫功能，可以抵御外界有害物質(zhì)侵入機(jī)體[6]。冷暴露也容易影響肝臟的正常功能，加速肝糖原分解、導(dǎo)致糖異生[2]。在本試驗(yàn)中，我們通過(guò)病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)冷暴露組小鼠細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)學(xué)變化，肝臟受到損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體也受到破壞。有研究指出，肝臟中存在豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，當(dāng)肝臟長(zhǎng)期處于外界不良刺激下，會(huì)導(dǎo)致肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能發(fā)生紊亂，極易發(fā)生ERS；若肝臟長(zhǎng)期處于ERS，又可進(jìn)一步發(fā)生ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑[19-20]。

GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，與位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)錄因子ATF6發(fā)生解離，ATF6隨后通過(guò)囊泡的方式移動(dòng)至高爾基體，并被2個(gè)位點(diǎn)蛋白酶分割，從而激活轉(zhuǎn)錄因子X(jué)盒結(jié)合蛋白1(X box-binding protein 1，XBP1)以及下游促凋亡信號(hào)分子C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)，以達(dá)到促進(jìn)蛋白質(zhì)進(jìn)行正確折疊的目的[8]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，冷暴露組小鼠肝臟組織中ERS關(guān)鍵蛋白GRP78、XBP1、CHOP表達(dá)顯著上調(diào)，說(shuō)明冷暴露下機(jī)體肝臟組織發(fā)生了ERS。

當(dāng)ER持續(xù)處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，發(fā)生ERS的關(guān)鍵蛋白CHOP過(guò)量表達(dá)能夠促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性凋亡[5]。此外，常青等[21]的研究表明，位于線粒體膜間隙的Cyt C在正常情況下不能透過(guò)線粒體外膜進(jìn)入胞質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，能夠改變線粒體膜完整性，引起膜電位降低，隨后Cyt C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[22]，在細(xì)胞質(zhì)中與細(xì)胞凋亡活化因子Apaf-1以及Pro-Caspase-9結(jié)合，激活Pro-Caspase-9產(chǎn)生有活性的Caspase-9，再活化下游Caspase-3等蛋白，從而激活線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑[23-24]。Bcl-2家族也參與線粒體凋亡的調(diào)控過(guò)程[25]，當(dāng)該家族中的促凋亡蛋白移動(dòng)到線粒體時(shí)，線粒體通透性發(fā)生改變、膜電位降低，Cyt C進(jìn)入胞質(zhì)，從而激活線粒體凋亡途徑[26-27]。凋亡蛋白表達(dá)情況與凋亡程度密切相關(guān)。為進(jìn)一步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否激活了肝細(xì)胞的凋亡途徑，我們檢測(cè)了肝臟組織線粒體蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示Bax與Bcl-2的比值顯著升高，提示冷暴露進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生凋亡；活化的Caspase-3與Caspase-3前體比值顯著升高，Cyt C蛋白的表達(dá)水平也顯著提升，提示機(jī)體肝臟組織發(fā)生了內(nèi)源性線粒體介導(dǎo)的凋亡。

綜上，冷暴露能夠誘導(dǎo)小鼠肝臟發(fā)生ERS，導(dǎo)致線粒體凋亡的發(fā)生。因此線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑在ERS中發(fā)揮重要作用，這提示我們未來(lái)可以嘗試以線粒體為著手點(diǎn)，減輕肝臟ERS，預(yù)防肝臟損傷。