馬泰勒蟲(chóng)AMA1基因的真核表達(dá)與鑒定

范士龍，蘆 星，王水怡，劉丹丹，王金明，李思媛，劉明明，劉雨桐，巴音查汗，張 偉

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

馬泰勒蟲(chóng)(Theileriaequi,T.equi)是一種寄生在馬屬動(dòng)物紅細(xì)胞及網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)、由硬蜱傳播的血液性原蟲(chóng)，與馬駑巴貝斯蟲(chóng)(Babesiacaballi)一起統(tǒng)稱馬梨形蟲(chóng)[1]。馬梨形蟲(chóng)病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)于2008年將其列為B類疫病，屬法定報(bào)告疫病，我國(guó)于1999年將其列為二類疫病[2]。該病典型臨床癥狀包括貧血、黃疸、體溫升高、呼吸困難和多器官衰竭，嚴(yán)重者導(dǎo)致馬屬動(dòng)物死亡[3]。該病多呈急性經(jīng)過(guò)，對(duì)引進(jìn)賽馬、純種馬以及幼駒的危害較大[4]，成為困擾馬匹規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)擴(kuò)大發(fā)展的制約因素之一。目前，對(duì)馬梨形蟲(chóng)病的防治尚無(wú)有效的治療方法，主要依靠化學(xué)藥物，但因化學(xué)藥物毒性較大且易產(chǎn)生耐藥性，治療效果不佳[5]。

頂復(fù)門原蟲(chóng)的頂膜抗原1(apical membrane antigen 1，AMA1)由微線體分泌，存在于多種頂復(fù)門原蟲(chóng)中，是一種高度保守的入侵相關(guān)蛋白，在裂殖子和子孢子入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中起重要作用[6]。大量研究表明，頂復(fù)門原蟲(chóng)AMA1胞外區(qū)與棒狀體頸部蛋白2(rhoptry neck protein 2)結(jié)合后，能夠繼續(xù)結(jié)合其他棒狀體頸部蛋白連接形成復(fù)合物，進(jìn)而形成運(yùn)動(dòng)連接環(huán)(moving juction，MJ)結(jié)構(gòu)，直接介導(dǎo)蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞過(guò)程[7-8]。因此阻斷兩者之間的相互作用可為抑制蟲(chóng)體的入侵提供新的參考思路[9]。研究發(fā)現(xiàn)，AMA1抗體通過(guò)破壞其與RONs的相互作用從而達(dá)到抑制裂殖子入侵，且相關(guān)研究已在瘧原蟲(chóng)(Plasmodium)和弓形蟲(chóng)(Toxoplasma)中得到了驗(yàn)證，AMA1蛋白也因此被視為重要的疫苗候選抗原[10-11]。但T.equiAMA1蛋白是否可作為預(yù)防蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞的保護(hù)性抗原，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

為了探究T.equiAMA1基因及其編碼的蛋白功能和結(jié)構(gòu)，本試驗(yàn)以GenBank中公布的美國(guó)WA株AMA1基因序列為目的基因設(shè)計(jì)特異性引物，以采集自新疆地區(qū)的T.equi樣本基因組DNA為模板，擴(kuò)增出AMA1目的基因片段后并在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行真核表達(dá)，利用AMA1原核重組蛋白制備多克隆抗體通過(guò)間接免疫熒光和Western blot鑒定AMA1真核重組蛋白的表達(dá)，研究結(jié)果為進(jìn)一步利用AMA1蛋白開(kāi)展T.equi抗蟲(chóng)疫苗研發(fā)和入侵宿主機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品、細(xì)胞及主要試劑T.equi陽(yáng)性抗凝馬全血采自新疆塔城地區(qū)。pEGFP-N1載體、pMD19-T、E.coliDH5α、Prime STAR Max Premix(2×)、T4DNA連接酶、XhoⅠ、EcoRⅠ、DNA Marker等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；人胚腎細(xì)胞(HEK293T)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;Lipfectamine 2000 Transfection Kit購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；DNA片段純化回收試劑、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA生物試劑公司；血液/組織 DNA 提取試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗馬IgG、DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成用GenBank中公布的T.equistrain WA(XM_004833042.1)AMA1基因序列為目標(biāo)，下載Theileriaorientalis(NC_025260.1)、Theileriaannulata(KX231671.1)、Theileriaparva(NC_007344.1)基因組數(shù)據(jù)后，進(jìn)行本地BLAST比對(duì)，獲得泰勒蟲(chóng)屬AMA1保守基因序列。利用 Primer Premier 5.0 軟件針對(duì)該基因片段設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，其中劃線部分為酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和XhoⅠ，送上海生工生物工程公司合成。

表1 AMA1基因引物序列

1.3AMA1基因克隆及測(cè)序按照動(dòng)物全血基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取T.equi基因組DNA。以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、回收后與載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，將PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子送往上海生工生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4AMA1基因核苷酸和氨基酸序列相似性分析利用MEGA 7.0軟件分析T.equi新疆株與其他頂復(fù)門原蟲(chóng)AMA1基因的核苷酸序列，構(gòu)建Maximum parsimany(MP)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，分析以AMA1基因?yàn)闃?biāo)記的頂復(fù)門原蟲(chóng)分類進(jìn)化關(guān)系。此外，用DNAStar Lasergene v7.1軟件分別對(duì)AMA1基因的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，分析其核苷酸和氨基酸序列相似性。

1.5AMA1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建利用XhoⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶分別酶切基因和載體，回收后進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，對(duì)菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取以及測(cè)序和酶切鑒定，構(gòu)建pEGFP-N1-AMA1真核表達(dá)質(zhì)粒。

1.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染參考Lipfectamine 2000 Transfection Kit說(shuō)明書，將pEGFP-N1-AMA1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到6孔板培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中。將細(xì)胞培養(yǎng)板于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，更換為不完全DMEM培養(yǎng)基(含4%胎牛血清，不含雙抗)，繼續(xù)培養(yǎng)36～48 h后進(jìn)行下一步檢測(cè)。

1.7 間接免疫熒光與Western bolt 驗(yàn)證轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-AMA1 重組質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后，使用5%多聚甲醛固定15 min，1%Triton X-100室溫下處理15 min，PBS 洗滌3～5次。用5%脫脂乳 4℃封閉過(guò)夜，PBST 洗滌3～5 次。以鼠抗GFP單抗作為一抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌3～5次。用1∶500稀釋的CoraLite594山羊抗鼠二抗室溫孵育1 h，用PBST洗滌3～5次。DAPI孵育10 min,PBST洗滌3～5次，倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

收集轉(zhuǎn)染 48 h 后pEGFP-N1-AMA1組和pEGFP-N1組細(xì)胞，加入WIP裂解液(PMSF∶RIPA=1∶100)，置于冰上裂解細(xì)胞 25 min，每隔 5 min 吹打以充分裂解細(xì)胞。裂解后于 4℃、12 000 r/min 離心15 min 收上清。將處理的蛋白樣品進(jìn)行 Western blot分析，200 mA恒流、35 min 濕轉(zhuǎn)印到 PVDF 膜上。加入 5%脫脂奶粉溶液，放置4℃ 封閉過(guò)夜，加入 GFP單抗和 AMA1鼠多抗室溫?fù)u床反應(yīng) 2 h；經(jīng) PBST 充分洗滌后，再加入 HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠二抗室溫?fù)u床反應(yīng) 1 h，充分洗滌后進(jìn)行 DAB顯色。

1.8 多克隆抗體制備GST-AMA1重組蛋白已在前期試驗(yàn)中制備并純化，具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。將前期純化好的GST-AMA1重組蛋白用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)濃度，步驟參照說(shuō)明書；與相同體積的弗氏完全佐劑混合，以50 μg/只的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行皮下注射，共進(jìn)行4次；4次免疫后7 d收集動(dòng)物血液，分離血清，收集并分裝上清，即得抗GST-AMA1的多克隆抗體，存放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.9 多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定及Western blot 鑒定利用間接 ELISA方法測(cè)定所產(chǎn)生多抗的效價(jià)，采用方陣滴定法篩選抗原包被的最佳濃度后加入酶標(biāo)板各孔中，4℃過(guò)夜包被后，封閉液封閉2 h，洗滌3 次；用封閉液將上述收集的免疫后小鼠血清做 1∶100 稀釋后，再做倍比稀釋，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(免疫前小鼠血清)及空白對(duì)照(封閉液)，封板，37℃孵育 1 h；加入稀釋過(guò)的二抗(HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG)，37℃孵育 1 h；加入底物顯色液顯色 10 min，每孔加入終止液 100 μL，測(cè)定D450 nm值?？贵w樣品孔的讀數(shù)值除以陰性孔的讀數(shù)值，結(jié)果大于該值即可判定為陽(yáng)性。

SDS-PAGE結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜上并進(jìn)行封閉，將小鼠多抗血清按 1∶200 的比例稀釋作為一抗，二抗使用 HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG，使用DAB顯色液進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1T.equiAMA1基因克隆及真核表達(dá)載體的鑒定結(jié)果對(duì)pMD19T-AMA1菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得約為768 bp目的片段(圖1A)；將陽(yáng)性菌液進(jìn)行測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果顯示，與GenBank收錄的T.equi美國(guó)WA株AMA1基因(XM_004833042.1)核苷酸和氨基酸序列同源性分別為76.34%和78.64%。雙酶切結(jié)果顯示，AMA1目的基因插入的大小和pEGFP-N1載體位置均正確，表明AMA1基因已正確克隆到真核表達(dá)載體上(圖1B)。

A.pMD19T-AMA1菌液PCR結(jié)果；B.pEGFP-AMA1酶切結(jié)果。M.DL2000 DNA Marker；A1,A2.樣品；B1.樣品；B2.空載

2.2AMA1基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果以AMA1基因?yàn)闃?biāo)記的進(jìn)化樹(shù)聚類關(guān)系符合物種分類，核苷酸與氨基酸進(jìn)化關(guān)系一致，不同種屬的原蟲(chóng)被分為3個(gè)分支，在進(jìn)化關(guān)系上T.equi新疆株聚類到泰勒蟲(chóng)屬，與T.equi美國(guó)WA株位于同一支，兩者進(jìn)化關(guān)系最為接近(圖2,3)。

圖2 基于AMA1基因核苷酸DNA序列構(gòu)建的頂復(fù)門原蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 基于AMA1蛋白氨基酸序列構(gòu)建的頂復(fù)門原蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

2.3T.equiAMA1真核重組蛋白間接免疫熒光與Western bolt 鑒定結(jié)果間接免疫熒光結(jié)果顯示，pEGFP-N1-AMA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中可觀察到GFP自帶的綠色熒光信號(hào)，以鼠抗GFP單抗作為一抗時(shí)，可在594 nm光源下觀察到紅色熒光信號(hào)(圖4)。Western blot檢測(cè) AMA1 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示(圖5)，在以鼠抗GFP單抗作為一抗時(shí)，空載對(duì)照組在約30 kDa出現(xiàn)條帶；以鼠抗GST-AMA1多克隆抗體作為一抗時(shí)pEGFP-N1-AMA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在約55 kDa處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期大小相符。結(jié)果表明，AMA1蛋白已經(jīng)在293T細(xì)胞中正確表達(dá)。

A.GFP綠色熒光；B.間接免疫Cy3熒光；C.紫色熒光；D.無(wú)熒光

A.EGFP標(biāo)簽Western blot結(jié)果；B.GFP-AMA1 Western blot結(jié)果。M.120 kDa 蛋白 Marker；A1.EGFP標(biāo)簽；B1.EGFP-AMA1蛋白

2.4 GST-AMA1多克隆抗體效價(jià)測(cè)定及Western blot 鑒定結(jié)果以2 mg/L重組抗原包被酶標(biāo)板，利用間接ELISA檢測(cè)其血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯示陰性血清的平均值為0.150，根據(jù)P/N2.1計(jì)算陽(yáng)性的臨界值為0.315，其效價(jià)約是1∶819 200(圖6)。Western blot結(jié)果顯示，在約60 kDa處有一明顯條帶(圖7)，表明T.equi GST-AMA1重組蛋白可與其免疫小鼠獲得的多克隆抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)。

圖6 AMA1重組蛋白小鼠免疫后效價(jià)檢測(cè)

M.蛋白 Marker；1.樣品

3 討論

AMA1蛋白是一種由頂復(fù)門原蟲(chóng)微線體分泌的蛋白，在蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞時(shí)，釋放并暴露在整個(gè)蟲(chóng)體表面[13]。研究發(fā)現(xiàn)，頂復(fù)門原蟲(chóng)在與宿主細(xì)胞膜接觸后，所釋放的微線體蛋白直接參與入侵宿主細(xì)胞的識(shí)別、黏附以及入侵過(guò)程[14]。目前，關(guān)于梨形蟲(chóng)AMA1蛋白報(bào)道較少，其具體功能還未深入探究，僅在東方巴貝斯蟲(chóng)(Babesiaorientalis)和牛巴貝斯蟲(chóng)(Babesiaboives)中有過(guò)相關(guān)AMA1蛋白的報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)在上述2種巴貝斯蟲(chóng)中，通過(guò)制備AMA1蛋白的多克隆抗體，將巴貝斯蟲(chóng)裂殖子與AMA1重組蛋白多克隆抗體孵育之后，可使裂殖子對(duì)紅細(xì)胞的侵襲效率明顯降低[15-16]。

本試驗(yàn)成功獲得T.equiAMA1真核重組蛋白(約為55 kDa)，其可與多克隆抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)，多克隆抗體效價(jià)為1∶819 200，具有良好的抗原性。AMA1蛋白優(yōu)良的免疫保護(hù)效果已經(jīng)在許多頂復(fù)門原蟲(chóng)中得到了驗(yàn)證，而且多種與之相關(guān)的疫苗相繼被研究報(bào)道。HOAN等[17]和王曄等[18]曾利用真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-Et AMA1、pVAX1-Eb AMA1以及原核AMA1重組蛋白觀察AMA1蛋白抗球蟲(chóng)的免疫保護(hù)試驗(yàn)，證明AMA1蛋白對(duì)雞球蟲(chóng)感染均具有一定的免疫保護(hù)力，真核質(zhì)粒組的卵囊減少率為74.55%，AMA1重組蛋白組的卵囊減少率為47.74%；使用真核質(zhì)粒EtMIC2-pcDNA免疫后的試驗(yàn)結(jié)果顯示，雞體質(zhì)量增加且雞球蟲(chóng)卵囊孵化率降低[19]。此外，基于AMA1抗原的瘧原蟲(chóng)疫苗已經(jīng)在非洲瘧疾流行地區(qū)進(jìn)行了2期臨床試驗(yàn)[20]。研究證明，AMA1免疫能促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生，比MIC2、M2AP基因免疫有更好的保護(hù)效果[21]，且AMA1為交叉抗原，可利用其構(gòu)建弓形蟲(chóng)與新孢子蟲(chóng)(Neosporacaninum)聯(lián)合疫苗[22-23]。以上研究表明，AMA1蛋白在頂復(fù)門原蟲(chóng)病的防治工作中具有良好的研究前景，因此，開(kāi)展T.equiAMA1蛋白的免疫保護(hù)相關(guān)研究，對(duì)于進(jìn)一步研制抗T.equi疫苗具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，關(guān)于T.equiAMA1蛋白的特異性抗體是否能夠與其他頂復(fù)門原蟲(chóng)一樣，可以對(duì)宿主起到保護(hù)作用，還有待于進(jìn)一步研究探索。

此外，研究發(fā)現(xiàn)AMA1蛋白在頂復(fù)門原蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。王旭[9]和MICHELLE等[24]曾分別在柔嫩艾美爾球蟲(chóng)(Eimeriatenella)、分歧巴貝斯蟲(chóng)(Babesiadivergens)和新孢子蟲(chóng)中，通過(guò)免疫共沉淀、雙分子熒光、pull down和酵母雙雜交試驗(yàn)驗(yàn)證了AMA1和RON2相互作用關(guān)系。并且在剛地弓形蟲(chóng)和瘧原蟲(chóng)中，通過(guò)AMA1蛋白和RON2蛋白制備的多克隆抗體，成功在天然蟲(chóng)體中定位到這兩個(gè)蛋白，并證實(shí)兩者產(chǎn)生了互作[20，25]。T.equiAMA1蛋白是否與其他頂復(fù)門原蟲(chóng)的AMA1蛋白一樣，參與到蟲(chóng)體對(duì)宿主細(xì)胞的入侵過(guò)程中，并且與它們產(chǎn)生相互作用，還有待于進(jìn)一步研究。

綜上，本試驗(yàn)成功獲得T.equi新疆株AMA1基因片段，并且成功在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并鑒定；獲得的AMA1真核重組蛋白可與多克隆抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)，且多克隆抗體效價(jià)水平較高，可將AMA1蛋白作為抗T.equi候選保護(hù)性抗原。本研究為今后T.equi疫苗開(kāi)發(fā)提供了候選靶點(diǎn)，為探究T.equi入侵宿主細(xì)胞機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。