非洲豬瘟病毒I226R蛋白原核表達(dá)及檢測(cè)I226R抗體間接ELISA方法的建立

柯軍男，張國(guó)軍，岳慧賢，張艷艷，齊 宇，蔣依倩，陳 騰，李 影，扈榮良*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長(zhǎng)春獸醫(yī)研究所,吉林 長(zhǎng)春 130122)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起豬的一種接觸性傳染的急性、熱性、高度致死性傳染病,給世界生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列入須通報(bào)的動(dòng)物疫病[1]。ASF于1921年在肯尼亞首次被發(fā)現(xiàn),隨后傳播到歐洲、美洲和亞洲其他國(guó)家[2]。該病2007年第2次跨大陸傳播到格魯吉亞，之后迅速傳播到俄羅斯等國(guó)，并繼續(xù)在這些地區(qū)傳播[3-4]。2018年8月,ASF在我國(guó)首次暴發(fā)[5-6]。隨后，在不到2年的時(shí)間里，迅速傳播到我國(guó)多個(gè)省份，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

為了防控本病，自20世紀(jì)60年代后期以來(lái)，全球科學(xué)家一直在努力開(kāi)發(fā)一種有效且安全的疫苗來(lái)保護(hù)豬免受 ASFV 感染[7-9]。然而，由于ASFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對(duì)病毒蛋白功能了解有限，目前世界尚未有可靠安全的商業(yè)化疫苗[10]。

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了缺失I226R基因的SY18△I226R減毒株，在接種后用致死劑量的ASFV SY18毒株攻擊，免疫的家豬均能達(dá)到100%保護(hù)，可以作為ASF疫苗候選株[11]。為了區(qū)別ASFV其他毒株和SY18△I226R減毒株，以便針對(duì)性檢測(cè)豬體內(nèi)的I226R抗體，本試驗(yàn)擬建立了以原核表達(dá)的重組蛋白pI226R作為包被抗原，檢測(cè)豬血清中I226R抗體的間接ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、原核表達(dá)載體pET-32a均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 豬原代肺泡巨噬細(xì)胞(primary alveolar macrophages，PAM)的制備取新鮮無(wú)菌無(wú)豬源性病毒(豬繁殖與呼吸綜合征病毒、流行性腹瀉病毒、豬細(xì)小病毒、經(jīng)典豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒和ASFV)污染的家豬肺臟組織，使用止血鉗或棉線結(jié)扎喉頭下方及主動(dòng)脈，在生物安全柜中經(jīng)喉管灌入滅菌PBS，至各肺葉全部隆起，輕拍表面 3～5 min 后，倒出灌洗液，收集于滅菌瓶中；重復(fù)3 次，收集第 2、3 次肺泡灌洗液；使用細(xì)胞濾器過(guò)濾收集灌洗液，將過(guò)濾后的細(xì)胞液收集至50 mL 離心管中，1 500 r/min離心 5 min；棄上清，將多管細(xì)胞富集于1管，加入細(xì)胞清洗液重懸，1 500 r/min 離心5 min；棄上清，使用3～5 倍體積的紅細(xì)胞裂解液吹懸細(xì)胞，再加入細(xì)胞清洗液至總體積40 mL，終止裂解,1 500 r/min離心5 min；重復(fù)此步驟2～3 次至紅細(xì)胞充分裂解。完成裂解后，使用40 mL的細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞，1 500 r/min 離心 5 min，重復(fù)清洗1～2 次。完成最后一次清洗后，棄去上清，使用配制好的原代細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，取混好的細(xì)胞液進(jìn)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。

1.3 病毒ASFV SY18毒株由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所于2018年8月在沈陽(yáng)某豬場(chǎng)病死豬中分離，在P3實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱中保存。

1.5 主要設(shè)備高電流電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像儀和化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自上海天能生命科學(xué)有限公司；吸收光酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.6 試驗(yàn)動(dòng)物2月齡雌性新西蘭大白兔購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。

1.7 ASFVI226R基因擴(kuò)增根據(jù)ASFV SY18毒株(登錄號(hào)：MH766894)中I226R基因序列和原核表達(dá)載體pET-32a(+)的XhoⅠ、NdeⅠ酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1，引物由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。以ASFV SY18毒株的基因組DNA為模板，用引物I226R-F、I226R-R擴(kuò)增I226R基因。PCR擴(kuò)增參數(shù)：預(yù)變性98℃ 1 min；98℃ 10 s，56℃ 20 s，72℃ 10 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃ 7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后，按AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒的說(shuō)明書(shū)對(duì)其進(jìn)行回收純化。

表1 I226R 基因擴(kuò)增引物序列

1.8I226R基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建將1.7中的產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，回收相應(yīng)片段。根據(jù)T4DNA連接酶的操作說(shuō)明，將pET-32a(+)和I226R酶切后的片段在16℃ 金屬恒溫儀中連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布到LB培養(yǎng)板過(guò)夜培養(yǎng)。挑選單菌落在LB培養(yǎng)基中于37℃、200 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)PCR鑒定的陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序鑒定，將陽(yáng)性克隆菌提取的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-I226R。

1.9 pI226R蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、可溶性分析及純化將pET-32a-I226R質(zhì)粒和pET-32a(+)空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)。分別挑取單菌落過(guò)夜培養(yǎng)后取200 μL菌液轉(zhuǎn)接到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)至D600 nm值為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 μmol/L，而后分別在培養(yǎng)到2,4 h時(shí)，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

按照以上摸索誘導(dǎo)表達(dá)條件誘導(dǎo)20 mL菌液，收集菌體加入2 mL的PBS重懸后超聲破碎至菌液清澈透明，離心收集沉淀和上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。重新誘導(dǎo)菌液500 mL后離心收集菌體，加入含8 mol/L尿素的平衡緩沖液重懸后超聲破碎30 min，離心取上清加入處理好的鎳柱中結(jié)合4 h；待鎳柱中的液體自然流出后依次用10,20,30 mmol/L 咪唑緩沖液對(duì)雜蛋白進(jìn)行洗脫，最后用200,500 mmol/L咪唑緩沖液分別洗脫3次目的蛋白，將純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,分析結(jié)果。

1.10 重組蛋白的反應(yīng)原性鑒定重組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，將目的蛋白用半干法轉(zhuǎn)印至NC膜，用TBST(含5%脫脂奶粉溶液)37℃封閉2.5 h；TBST洗3 次(10 min/次)，一抗用TBST稀釋的ASFV陽(yáng)性血清(1∶500)4℃過(guò)夜孵育；TBST洗3 次(10 min/次)，二抗用TBST稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗豬IgG(1∶12 000)室溫孵育1 h；TBST洗3 次(10 min/次)，將HRP化學(xué)發(fā)光底物A液與B液以1∶1比例分別加100 μL于1.5 mL EP管中混勻，在暗盒中滴加在NC膜涂勻后充分結(jié)合1 min，然后用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析設(shè)備進(jìn)行拍照分析。

在水庫(kù)水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中，浮游動(dòng)物的物種組成，數(shù)量，生物量及浮游動(dòng)物多樣性指數(shù)與水體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)密切相關(guān)，因此，調(diào)查研究水域中浮游動(dòng)物組成，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)意義[1]。如今利用浮游動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)特征的變化監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)河流、湖泊等水體污染程度和自凈作用，在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛[2]。有關(guān)汾河二庫(kù)的浮游動(dòng)物類(lèi)群研究報(bào)道極少。本文調(diào)查研究了春、夏季汾河二庫(kù)浮游動(dòng)物群落特征，并結(jié)合汾河二庫(kù)多樣性指數(shù)H、綜合營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)（TLI）及浮游動(dòng)物生物量對(duì)汾河二庫(kù)水質(zhì)進(jìn)行了分析研究，旨在為汾河二庫(kù)水環(huán)境評(píng)價(jià)與保護(hù)、漁業(yè)資源合理利用和可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1.11 兔抗pI226R多克隆抗體的制備和鑒定用純化后的蛋白免疫新西蘭白兔，制備兔抗pI226R蛋白多抗。第1次免疫將700 μg重組蛋白與弗氏完全佐劑按1∶1劑量混合并充分乳化，采用皮下注射的方法免疫白兔。首免后間隔14 d進(jìn)行二免，將500 μg重組蛋白與弗氏不完全佐劑按1∶1劑量混合并充分乳化后免疫白兔。二免后間隔14 d進(jìn)行三免，將500 μg重組蛋白與弗氏不完全佐劑乳化后免疫白兔。三免后10 d，耳緣靜脈采血，將血液經(jīng)37℃靜置1 h后4℃靜置過(guò)夜，8 000 r/min離心10 min 分離血清，于-80℃保存?zhèn)溆?。利用Western blot方法和間接免疫熒光方法鑒定該多克隆抗體。

1.12 基于pI226R蛋白的間接ELISA方法的建立采用方陣滴定法，來(lái)確定最佳抗原包被質(zhì)量濃度和最佳血清稀釋度。純化后用0.1 mol/L 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH9.6)分別將抗原蛋白稀釋至質(zhì)量濃度為1.0,2.5,5.0,10.0 g/L。并用此不同包被質(zhì)量濃度的包被液包被在酶標(biāo)板，每孔加100 μL,每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)2孔，4℃過(guò)夜包被；使用 PBST 溶液洗滌3 次，每孔加入300 μL封閉液(5%脫脂奶粉的PBST)，置于37℃溫箱封閉2 h；使用 PBST 溶液洗滌3 次，用抗體稀釋液(加入1%BSA的PBST)分別以樣品∶抗體稀釋液=1∶100,1∶200,1∶500,1∶1 000的比例稀釋ASF陽(yáng)性豬血清和陰性豬血清樣品，每孔100 μL,每個(gè)稀釋度重復(fù)2孔，25℃孵育1 h；使用 PBST 溶液洗滌3 次，每孔加100 μL用抗體稀釋液(1%BSA的PBST)1∶10 000 稀釋后的HRP標(biāo)記山羊抗豬IgG抗體，25℃孵育1 h；使用 PBST 溶液洗滌 3 次，每孔加50 μL 顯色液TMB，置室溫避光反應(yīng)10 min；每孔加入50 μL終止液(2 mol/L H2SO4)終止反應(yīng)，加完終止液后立即利用酶標(biāo)儀測(cè)D450 nm值。同時(shí)，用以上條件在同一板的其他孔以制備的兔抗pI226多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)為二抗，作為陽(yáng)性對(duì)照。以P/N值最大時(shí)的抗原包被質(zhì)量濃度和血清稀釋度確定為抗原的最佳包被質(zhì)量濃度和血清的最佳稀釋度。在蛋白最佳包被質(zhì)量濃度和血清的最佳稀釋度下對(duì)封閉液的選擇及作用時(shí)間、酶標(biāo)二抗最佳稀釋度等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.14 特異性試驗(yàn)用上述優(yōu)化的間接 ELISA 方法對(duì)PRRSV、PPV、CSFV和PCV抗體陽(yáng)性豬血清進(jìn)行檢測(cè)，每種血清設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)，評(píng)價(jià)該間接ELISA方法的特異性。

1.15 重復(fù)性試驗(yàn)選取同一批次包被的3塊酶標(biāo)板，用建立的間接 ELISA方法檢測(cè)5 份ASF抗體陽(yáng)性豬血清和5 份ASF抗體陰性豬血清，計(jì)算其變異系，評(píng)價(jià)該方法的批內(nèi)重復(fù)性。選取3 塊不同批次包被的酶標(biāo)板，用該方法檢測(cè)5 份ASF抗體陽(yáng)性豬血清和 5 份ASF抗體陰性豬血清，計(jì)算其變異系數(shù)，評(píng)價(jià)該方法的批間重復(fù)性。

1.16 臨床樣品檢測(cè)利用以上建立的間接ELISA方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存已知感染ASFV背景的臨床家豬血清樣本進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)用西班牙INGENASA(英吉納)ASF診斷試劑盒檢測(cè)相同樣品。

2 結(jié)果

2.1I226R原核表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定以ASFV SY18的毒株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到735 bpI226R基因片段(圖1A)。pET32a載體和I226R片段均用XhoⅠ、NdeⅠ限制性內(nèi)切酶酶切，獲得5 366 bp 線性化pET32a載體(圖1B)和700 bpI226R片段(圖1C)。在T4連接酶的作用下，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-I226R。對(duì)原核表達(dá)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后,檢測(cè)到大小為700 bp的目的片段(圖1D)。綜合測(cè)序結(jié)果,表明成功構(gòu)建了pET-32a-I226R原核表達(dá)重組質(zhì)粒。

A.ASFV I226R基因的PCR 擴(kuò)增; B.空載體pET-32a雙酶切;C.I226R基因雙酶切;D.pET-32a-I226R 重組質(zhì)粒酶切鑒定。M.DL5000 DNA Marker;1.ASFV I226R基因 PCR 產(chǎn)物; 2.空載體pET-28a雙酶切產(chǎn)物; 3.I226R基因雙酶切產(chǎn)物;4.pET-32a-I226R重組質(zhì)粒的雙酶切

2.2 pI226R蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析將pET-32a-I226R原核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色鑒定，發(fā)現(xiàn)在28 kDa左右出現(xiàn)蛋白條帶(圖2A)，且4 h時(shí)表達(dá)量較高，與預(yù)期結(jié)果一致。而后取誘導(dǎo)后菌液離心棄上清，加2 mL PBS重懸沉淀于冰上超聲破碎。離心分別收集沉淀和上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色鑒定(圖2B)，結(jié)果表明pI226R重組蛋白誘導(dǎo)成功且主要以包涵體形式表達(dá)。

A.重組蛋白pI226R的誘導(dǎo)表達(dá);B.pI226R 重組蛋白的可溶性分析。M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A1.誘導(dǎo)2 h的空載體菌體樣品；A2.誘導(dǎo)2 h的陽(yáng)性菌體樣品；A3.誘導(dǎo)4 h的空載體菌體樣品;A4.誘導(dǎo)4 h陽(yáng)性菌體；B1.誘導(dǎo)陽(yáng)性菌體裂解的上清；B2.誘導(dǎo)陽(yáng)性菌體裂解的沉淀；B3.誘導(dǎo)陽(yáng)性菌體

2.3 pI226R蛋白純化及Western blot鑒定利用Ni-NTA親和純化層析柱對(duì)重組蛋白I226R進(jìn)行純化，SDS-PAGE結(jié)果表明，獲得了單一的目的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為28 kDa(圖3A)。用陽(yáng)性ASF血清鑒定純化的重組蛋白I226R的免疫反應(yīng)原性，Western blot結(jié)果表明，陽(yáng)性ASF血清能識(shí)別重組蛋白pI226R，且空載體菌體不與陽(yáng)性ASF血清反應(yīng)，說(shuō)明重組蛋白pI226R具有良好的反應(yīng)原性(圖3B)。

A.重組蛋白pI226R的純化；B.重組蛋白pI226R的 Western blot 鑒定。M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); A1～A3.洗脫蛋白咪唑200 mmol/L；A4～A6.洗脫蛋白咪唑500 mmol/L；B1.pET-32a誘導(dǎo)后的菌液;B2.純化的pI226R重組蛋白

2.4 兔抗pI226R多克隆抗體的鑒定以制備的兔抗pI226R多克隆抗體血清及兔陰性血清為一抗，對(duì)純化后的原核表達(dá)重組蛋白pI226R進(jìn)行Western blot鑒定，對(duì)ASFV SY18株感染的PAM細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光鑒定。結(jié)果顯示，兔抗pI226R多抗血清能與重組蛋白pI226R發(fā)生特異性反應(yīng)，而未免疫pI226R重組蛋白的兔血清不能識(shí)別重組蛋白(圖4)。而且兔抗pI226R多抗能特異性識(shí)別ASFV SY18株感染PAM細(xì)胞中的pI226R蛋白(圖5)，且發(fā)現(xiàn)病毒中I226R基因表達(dá)位于胞漿中的病毒工廠中。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A1.陽(yáng)性血清；B1.陰性血清

A.感染 ASFV SY18 毒株的PAM細(xì)胞與陽(yáng)性血清相互作用;B.未感染ASFV SY18毒株的PAM細(xì)胞與陽(yáng)性血清相互作用

2.5 間接ELISA抗體檢測(cè)方法建立

2.5.1ELISA 最佳反應(yīng)條件的確定 利用方陣滴定法優(yōu)化間接 ELISA 的反應(yīng)條件，結(jié)果顯示當(dāng)抗原蛋白的包被質(zhì)量濃度為 2.5 g/L、血清稀釋度為 1∶500時(shí)P/N值最大(表2)。利用以上條件又篩選出二抗最佳稀釋度為1∶12 000，TMB顯色為室溫避光作用10 min。

2.5.3間接 ELISA 方法的特異性試驗(yàn) 利用初步建立的 ELISA 方法檢測(cè)PRRSV、PPV、CSFV和PCV抗體陽(yáng)性豬血清，每種血清進(jìn)行 3 個(gè)重復(fù)，結(jié)果顯示，只有ASF抗體陽(yáng)性對(duì)照D450 nm>0.381，其他血清樣品D450 nm值均小于 0.381，表明該方法具有良好的特異性(表3)。

表3 間接 ELISA 方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.4間接 ELISA 方法的敏感性試驗(yàn) 將ASF抗體陽(yáng)性豬血清從1∶100 開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)靡陨辖⒌腅LISA 方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判定陽(yáng)性血清的最大稀釋度，結(jié)果見(jiàn)表4。當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋度為1∶1 600 ,檢測(cè)的D450 nm值仍大于0.381，表明該方法能夠檢測(cè)的ASF陽(yáng)性血清的最大稀釋度為1∶1 600。

表4 間接 ELISA 方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.5間接 ELISA 方法的重復(fù)性試驗(yàn) 選取同一批次包被的酶標(biāo)板檢測(cè)5 份ASF抗體陽(yáng)性豬血清和5 份ASF抗體陰性豬血清，每份樣品進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，計(jì)算其變異系數(shù)(CV)，結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)均<10%(表5)。另外，用3個(gè)不同批次包被的酶標(biāo)板檢測(cè)5份ASF抗體陽(yáng)性豬血清和 5 份ASF抗體陰性豬血清，計(jì)算其變異系數(shù)，結(jié)果顯示批間變異系數(shù)均<10%，表明所建立的 ELISA方法重復(fù)性良好(表5)。

表5 間接 ELISA 方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.6臨床樣品的檢測(cè) 利用本試驗(yàn)建立的ELISA方法對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存已知感染ASFV背景的臨床家豬血清樣本進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)，利用西班牙INGENASA(英吉納)ASF診斷試劑盒檢測(cè)相同樣品。由表6可知，當(dāng)檢測(cè)樣品以pI226R為抗原的間接ELISA方法檢測(cè)結(jié)果判定為陽(yáng)性時(shí)，則說(shuō)明該樣品含有ASF抗體；當(dāng)此方法檢測(cè)結(jié)果為陰性，而其他抗原檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，則說(shuō)明該樣品含有ASF抗體但未有pI226R的抗體，進(jìn)而說(shuō)明該家豬體內(nèi)感染的毒株為缺失I226R基因的缺失株。所以，此方法可以有效檢測(cè)家豬體內(nèi)是否產(chǎn)生針對(duì)pI226R蛋白的抗體，并且在其他抗體檢測(cè)試劑盒配合下可有效區(qū)別I226R基因缺失株接種和其他毒株感染。

表6 間接ELISA方法與阻斷ELISA試劑盒結(jié)果對(duì)比

3 討論

ASFV是一種基因組170～193 kb的大型囊膜雙鏈DNA病毒，是非洲豬瘟病毒科目前已知唯一的代表種。病毒直徑為175～215 nm，包括125 kb的中心保守區(qū)域和2個(gè)多基因家族構(gòu)成的末端可變區(qū)域，含有150～167 個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼150～200種蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白50多種和非結(jié)構(gòu)蛋白100 多種，目前ASFV大多數(shù)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能還有待研究[12-13]。ASFV病毒粒子具有二十面體結(jié)構(gòu)，由里到外主要由5部分組成：含病毒基因組DNA的擬核、內(nèi)核芯殼、內(nèi)膜、衣殼和囊膜[14]。正因?yàn)锳SFV 結(jié)構(gòu)復(fù)雜、基因組龐大，制約了ASF疫苗和相關(guān)研究的開(kāi)展[15]。

本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了缺失I226R基因的SY18△I226R減毒株，高(107TCID50)和低(104TCID50)單劑量的SY18△I226R接種家豬21 d 后，無(wú)任何明顯癥狀，并產(chǎn)生較高水平的抗體。在用致死劑量的ASFV SY18毒株攻擊后，免疫豬均能達(dá)到100%保護(hù)，具有作為基因缺失疫苗的潛力。為了建立一種利用本試驗(yàn)方法和其他如p30抗體檢測(cè)試劑盒配合下，區(qū)別野毒感染和缺失I226R基因的減毒株接種的血清監(jiān)測(cè)方法，利用包被pI226R蛋白的方式，建立了一種檢測(cè)pI226R抗體的間接ELISA方法。盡管前期我們通過(guò)I226R基因缺失發(fā)現(xiàn)I226R基因?yàn)橐环N毒力相關(guān)基因，但通過(guò)針對(duì)血清樣品的檢測(cè)證明，在強(qiáng)毒感染耐過(guò)豬體內(nèi)和弱毒株感染過(guò)程中也產(chǎn)生了相應(yīng)的抗體，說(shuō)明這個(gè)間接ELISA抗體檢測(cè)的方法在臨床上應(yīng)用是可行的。檢測(cè)部分樣品用來(lái)模擬臨床樣品也說(shuō)明了該方法的實(shí)用性。

通過(guò)針對(duì)pI226R抗體檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果D450 nm值的分析，與ASFV其他蛋白抗體檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相比，pI226R蛋白產(chǎn)生的抗體水平相對(duì)較低。因此，大部分陽(yáng)性樣品的D450 nm值和陰性樣品的D450 nm值相差絕對(duì)值較小，較容易受檢測(cè)操作等客觀因素的影響。產(chǎn)生抗體水平較低的原因，一方面與I226R具有毒力相關(guān)性有關(guān)，另一方面可能與其在病毒感染過(guò)程中蛋白產(chǎn)生水平低有關(guān)。因此，在使該方法成為商品化試劑盒以前，需要更多陰性樣品的檢測(cè)，以確定更加準(zhǔn)確的臨界值。

pI226R蛋白表達(dá)和純化以后，蛋白呈現(xiàn)出保存不穩(wěn)定的特點(diǎn)，表現(xiàn)在容易降解，導(dǎo)致每次包被之前需要重新檢測(cè)濃度，具體原因尚不清楚。猜測(cè)可能與蛋白保存環(huán)境、保存溫度、保存時(shí)的pH值及鹽離子濃度有關(guān)。

該檢測(cè)方法的建立不僅可以幫助檢測(cè)人員快速便捷檢測(cè)大量血清樣品中是否有針對(duì)I226R蛋白的抗體，同時(shí)對(duì)ASF血清學(xué)抗體檢測(cè)、流行病學(xué)、I226R蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究，以及疫苗的研發(fā)和臨床檢測(cè)方法的建立等奠定了基礎(chǔ)。