豬δ冠狀病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立

尚再卓，于瑞明，張莉萍，王永錄，潘 麗，杜曉華，劉 霞*，劉新生*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

豬δ冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一種新型豬腸道冠狀病毒，主要引起哺乳仔豬嘔吐、腹瀉、脫水和死亡。2012年，WOO等[1]在對(duì)香港地區(qū)動(dòng)物樣品進(jìn)行冠狀病毒的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)了PDCoV。DONG等[2]分析了2004-2014年間我國(guó)多個(gè)省份規(guī)模化豬場(chǎng)的215份糞便樣品，首次證實(shí)我國(guó)內(nèi)地豬場(chǎng)中PDCoV的存在。2014年，PDCoV在美國(guó)俄亥俄州、愛(ài)荷華州、伊利諾伊州及明尼蘇達(dá)州等多地的豬場(chǎng)暴發(fā)[3-5]，隨后在腹瀉仔豬腸道內(nèi)容物和LLC-PK細(xì)胞中首次分離出PDCoV OH-FD22株[6]。隨后，加拿大、韓國(guó)、泰國(guó)、老撾、越南、日本等許多國(guó)家報(bào)道了PDCoV感染的存在[7-12]。近年來(lái)，我國(guó)多個(gè)省份均有PDCoV疫情的相關(guān)報(bào)道，并呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，且PDCoV與其他豬腸道病原共感染的現(xiàn)象也較為普遍[13]，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[14]。目前，針對(duì)此病尚無(wú)特效治療藥物及疫苗免疫方法，也無(wú)市售商品化PDCoV特異性抗體ELISA檢測(cè)試劑盒。因此，建立一種速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的ELISA方法，對(duì)PDCoV的臨床診斷及免疫防控具有重要意義。

PDCoV是單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科、δ冠狀病毒屬，病毒顆粒呈球形或多型性，病毒直徑約為100 nm，有囊膜和許多末端凸起的纖突，基因組大小為25.4 kb，是目前發(fā)現(xiàn)最小的冠狀病毒成員[15]。與其他冠狀病毒一樣，PDCoV也含有4種主要結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)。其中 S蛋白在病毒與細(xì)胞受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒入侵和感染中發(fā)揮重要作用[16]；同時(shí)，S蛋白也是病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原[17]。SHANG等[18]用冷凍電鏡技術(shù)解析了S蛋白的三維結(jié)構(gòu)與功能,結(jié)果顯示S蛋白由非共價(jià)連接的S1、S2兩部分組成，S1包含 N末端受體結(jié)構(gòu)域(NTD)和C末端受體結(jié)構(gòu)域(CTD)，而S1-CTD區(qū)域能夠與宿主表面的未識(shí)別受體結(jié)合，推測(cè)該段包含主要RBD(受體結(jié)合區(qū)域)。因此，截短的S1-CTD蛋白可以作為建立ELISA檢測(cè)方法的理想抗原。

PDCoV是一種腸道病原體，主要通過(guò)呼吸道和消化道進(jìn)行傳播，從而引起黏膜處上皮細(xì)胞的病變[15]。SIgA(分泌性IgA)是腸黏膜的主要免疫球蛋白，是維持腸道黏膜穩(wěn)態(tài)的第一道防線，對(duì)腸道內(nèi)的共生菌及入侵病原體具有抵御作用[19]。有研究表明，血清特異性IgA 抗體水平與局部黏膜免疫水平呈正相關(guān)，可在病毒感染或接種疫苗的豬血清和乳汁中檢測(cè)到[20]。目前，豬傳染性胃腸炎[21]、豬流行性腹瀉[22]、豬繁殖與呼吸綜合征[23]等傳染病通過(guò)黏膜免疫均取得了很好的免疫保護(hù)效果，黏膜免疫主要效應(yīng)因子SIgA已成為檢測(cè)和判斷黏膜免疫抗病毒水平的重要指標(biāo)[24]。然而，現(xiàn)有的ELISA檢測(cè)方法主要是檢測(cè)血清中特異性IgG抗體，對(duì)PDCoV黏膜免疫水平的檢測(cè)方法和評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PDCoV S1-CTD蛋白作為包被抗原，建立了能夠檢測(cè)血清PDCoV特異性IgA抗體的間接ELISA方法，為臨床上監(jiān)測(cè)母豬和仔豬血清中IgA抗體水平及評(píng)價(jià)疫苗免疫效果提供了新的方法。

1 材料與方法

1.1 病毒、血清及主要試劑PDCoV陽(yáng)性血清采自本實(shí)驗(yàn)室攻毒7 d的仔豬，陰性血清采自甘肅臨洮豬場(chǎng)未免疫母豬；豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬嵴病病毒(PKV)、口蹄疫病毒(FMDV)及豬瘟病毒(CSFV)的陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、Premix TaqTM酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；T4DNA連接酶、NheⅠ限制性內(nèi)切酶和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自New England Biolabs(NEB)公司；96孔酶標(biāo)板、山羊抗豬IgA-HRP購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；AxyPrepTMDNA 凝膠回收試劑盒、AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit購(gòu)自Axygen公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司；血清稀釋液、百迪泰酶標(biāo)抗體穩(wěn)定劑、單組份TMB底物顯色液及終止液購(gòu)自濟(jì)南百迪泰生物科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)截取優(yōu)化后S基因中的抗原表位區(qū)CTD片段，利用SnapGene軟件設(shè)計(jì)特異性引物，在上、下游引物中分別引入限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ(引物處下劃線序列)，S1-CTD-F:5′-CCGCTAGCCAACGTACTATTGTCACACTAC-C-3′;S1-CTD-R:5′-GGCTCGAGGCAGACATCA-GTGATTACACTAG-3′。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3S1-CTD基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定以S基因?yàn)槟０?，S1-CTD-F、S1-CTD-R為引物，擴(kuò)增S1-CTD基因；目的基因于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)后，按膠回收試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行純化，并將純化產(chǎn)物及原核表達(dá)載體pET24a(+)用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ酶切，酶切產(chǎn)物鑒定正確后膠回收純化。利用T4DNA連接酶對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行16℃過(guò)夜連接，連接后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)雙酶切及測(cè)序篩選出陽(yáng)性克隆，命名為pET24a-S1-CTD。

1.4 重組蛋白S1-CTD的表達(dá)鑒定及純化將重組質(zhì)粒pET24a-S1-CTD轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，于37℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用IPTG誘導(dǎo)4～5 h，同時(shí)設(shè)置pET24a(+)空載對(duì)照組。8 000 r/min 離心10 min收集菌體，加入適量 PBS 重懸，超聲破碎菌體后，收集上清及沉淀并進(jìn)行 SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白S1-CTD的表達(dá)。確定目的蛋白表達(dá)后利用Ni柱純化，以1∶500稀釋的PDCoV陽(yáng)性血清為一抗，1∶5 000稀釋的山羊抗豬IgA-HRP為二抗進(jìn)行Western blot鑒定；最后，利用試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，分裝后-80℃保存。

1.5 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化采用方陣滴定法分別對(duì)重組蛋白S1-CTD包被質(zhì)量濃度(32，16，8，4，2，1 mg/L)；包被條件(37℃ 2 h、37℃ 1 h及4℃過(guò)夜)；封閉液(1%BSA、5%脫脂乳和百迪泰酶標(biāo)抗體穩(wěn)定劑)；封閉條件(37℃ 30 min，37℃ 1 h和37℃ 2 h)；血清稀釋度(1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320)；血清孵育時(shí)間(20，40，60 min)；酶標(biāo)二抗稀釋度(1∶2 500，1∶5 000，1∶10 000，1∶20 000)；酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間(15，30，45，60 min)和底物顯色時(shí)間(5，10，15，20 min)進(jìn)行優(yōu)化。按常規(guī) ELISA 方法操作，測(cè)定記錄D450 nm值，陽(yáng)性血清與陰性血清的D450 nm比值(P/N)最大時(shí)，確定為該反應(yīng)的最佳條件。

1.6 臨界值的確定確定檢測(cè)條件后，檢測(cè)已知狀態(tài)的血清樣品，根據(jù)各樣品和陰、陽(yáng)性對(duì)照的D450 nm值，計(jì)算樣品S/P值[S/P=(樣品D450 nm-陰性對(duì)照D450 nm)/(陽(yáng)性對(duì)照D450 nm-陰性對(duì)照D450 nm)]。使用MedCalC軟件繪制血清檢測(cè)特征曲線(receiver operating characteristic，ROC)，對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖像化分析，選擇正確率較高的臨界值確定為該方法的臨床檢測(cè)臨界值。

1.7 特異性試驗(yàn)使用優(yōu)化好的ELISA方法，檢測(cè)PEDV、PKV、FMDV和CSFV的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，并設(shè)立PDCoV陰陽(yáng)性血清對(duì)照，每份樣品設(shè)3孔重復(fù)。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)D450 nm值，依據(jù)陰陽(yáng)臨界值，判斷該方法與其他豬常見(jiàn)病毒病的病原有無(wú)交叉反應(yīng)。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)選取5份PDCoV陽(yáng)性樣品，分別在3塊同一批次包被的抗原板上和3塊不同批次包被的抗原板上檢測(cè)，計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)，評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.9 敏感性試驗(yàn)使用血清稀釋液對(duì)4份PDCoV陽(yáng)性血清進(jìn)行倍比稀釋，利用建立好的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)陰陽(yáng)性血清對(duì)照，測(cè)定D450 nm值，計(jì)算出S/P值，分析該方法的敏感性。

1.10 間接ELISA檢測(cè)方法的初步應(yīng)用應(yīng)用本研究建立的檢測(cè)血清中PDCoV特異IgA抗體的間接ELISA方法，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的60份陽(yáng)性血清和40份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，并設(shè)陰陽(yáng)性血清對(duì)照，測(cè)定D450 nm值，計(jì)算出S/P值，以驗(yàn)證間接ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果是否可靠。

2 結(jié)果

2.1S1-CTD基因原核表達(dá)載體的鑒定通過(guò)PCR擴(kuò)增S1-CTD基因，得到與預(yù)期大小相符的目的條帶，為422 bp(圖1)。使用T4DNA連接酶將目的基因與載體連接后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶(NheⅠ、XhoⅠ)雙酶切鑒定為陽(yáng)性(圖2)，測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確，說(shuō)明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M.DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.PDCoV S1-CTD基因；2.pET24a載體

M.DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～3.重組質(zhì)粒pET24a-S1-CTD雙酶切產(chǎn)物

2.2 重組蛋白S1-CTD的表達(dá)鑒定及純化將pET24a-S1-CTD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG 37℃誘導(dǎo)5 h后，SDS-PAGE鑒定發(fā)現(xiàn)S1-CTD蛋白以包涵體形式表達(dá)，約19 kDa。對(duì)菌液超聲處理，8 mol/L Urea溶解包涵體，使用Ni柱純化，得到較純的目的蛋白(圖3)，質(zhì)量濃度為0.39 g/L。Western blot結(jié)果顯示S1-CTD蛋白能與PDCoV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖4)。

A.S1-CTD重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)；B.S1-CTD重組蛋白的純化。M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A1.誘導(dǎo)的pET24a-S1-CTD；A2.未誘導(dǎo)的pET24a-S1-CTD；A3.誘導(dǎo)的pET24a(+)空載體；A4.誘導(dǎo)的pET24a-S1-CTD上清；A5.誘導(dǎo)的pET24a-S1-CTD沉淀；A6.誘導(dǎo)的pET24a(+)空載上清；A7.誘導(dǎo)的pET24a(+)空載沉淀；B1.蛋白純化；B2.蛋白透析

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.PDCoV陽(yáng)性血清;2.PDCoV陰性血清;←.主要抗原成分，含有二硫鍵結(jié)構(gòu)的蛋白；?.透析不徹底，不含二硫鍵結(jié)構(gòu)的蛋白

2.3 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化通過(guò)用方陣滴定法優(yōu)化，得到該ELISA方法的最優(yōu)反應(yīng)條件。結(jié)果顯示(表1，2，3)，抗原包被最佳質(zhì)量濃度為8 mg/L，血清最佳稀釋度為1∶10；最佳包被條件為37℃ 1 h；最適封閉液為百迪泰酶標(biāo)抗體穩(wěn)定劑；最佳封閉條件為37℃ 1 h；血清最佳反應(yīng)時(shí)間為37℃ 40 min；酶標(biāo)抗體最佳稀釋度為1∶5 000，最佳反應(yīng)時(shí)間為37℃ 45 min；TMB底物溶液最佳顯色時(shí)間為37℃ 10 min。

表1 抗原包被質(zhì)量濃度及血清稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

2.4 臨界值的確定確定間接ELISA反應(yīng)條件之后，用該方法檢測(cè)PDCoV 24份陰性血清和24份陽(yáng)性血清，測(cè)定每份樣品D450 nm值，計(jì)算S/P值。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，并繪制ROC曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，當(dāng)S/P≥ 0.489時(shí)為100%陽(yáng)性，S/P<0.489時(shí)為100%陰性(圖5)。

A.血清檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；B.血清檢測(cè)ROC曲線確定臨界值

2.5 特異性試驗(yàn)取PEDV、PKV、FMDV及CSFV等4種常見(jiàn)豬病毒病的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，用本研究建立的間接ELISA進(jìn)行特異性檢測(cè)，每份血清設(shè)3孔重復(fù)。結(jié)果顯示，4種標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清S/P值均小于0.489(圖6)，說(shuō)明本研究建立的PDCoV間接ELISA抗體檢測(cè)方法均具有良好的特異性。

表2 包被條件、封閉液、封閉時(shí)間及血清孵育時(shí)間的優(yōu)化

表3 酶標(biāo)二抗稀釋度、酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間及底物反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

圖6 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)選取5份陽(yáng)性血清，使用建立的方法分別在同一批包被的檢測(cè)板上和不同批次包被的檢測(cè)板上進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)。結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)為2.09%～3.24%，批間變異系數(shù)為3.53%～6.10%(表4)。重復(fù)檢測(cè)變異系數(shù)均低于10%，說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)

2.7 敏感性試驗(yàn)選取4份PDCoV陽(yáng)性血清，用血清稀釋液從1∶10開始進(jìn)行倍比稀釋，利用建立好的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，分析此方法的敏感性。結(jié)果顯示，在血清1∶40稀釋時(shí)，4份血清全為陽(yáng)性；1∶80稀釋時(shí)，4份血清全為陰性(圖7)。結(jié)果表明，該方法具有良好的敏感性。

圖7 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 間接ELISA檢測(cè)方法的初步應(yīng)用應(yīng)用本研究建立的檢測(cè)血清中PDCoV特異IgA抗體的間接ELISA方法，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的60份陽(yáng)性血清和40份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定D450 nm值，計(jì)算S/P值。結(jié)果顯示，60份陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，符合率為100%(60/60)，40份陰性血清中，38份檢測(cè)為陰性，2份為陽(yáng)性，符合率為95%(38/40),總符合率為98%。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

3 討論

PDCoV是一種新發(fā)現(xiàn)的豬腸道病毒，具有傳播速度快、病死率高的特點(diǎn)，尤其新生仔豬病死率高達(dá)80%，如不能得到及時(shí)有效的控制，會(huì)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于PDCoV與PEDV、TGEV等其他豬腸道病毒存在交叉感染，引起的臨床癥狀也極其相似，因此對(duì)該病的診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[14]。間接ELISA檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于臨床樣品檢查和血清流行病學(xué)調(diào)查。

有研究表明，仔豬在感染PDCoV后 14 d，在血清中能夠同時(shí)檢測(cè)到特異性抗體IgG和IgA，此后特異性抗體滴度逐漸增加并保持較高水平，直至豬從臨床疾病完全恢復(fù)[25]。黏膜免疫在病毒性腹瀉的免疫機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用，黏膜處分泌的SIgA抗體能有效阻止病原體的入侵，是預(yù)防仔豬腸道傳染病的有效途徑[26]。目前,國(guó)內(nèi)很多學(xué)者基于M、N蛋白建立了檢測(cè)特異IgG抗體的間接ELISA方法[27-30]。但是，MA等[31]發(fā)現(xiàn)PEDV和PDCoV N蛋白上保守或相似的表位可能導(dǎo)致2種病毒的抗原產(chǎn)生雙向交叉反應(yīng)；GIMENEZ-LIROLA等[32]用以PEDV M蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法對(duì)PDCoV陽(yáng)性血清進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí)，出現(xiàn)了陽(yáng)性結(jié)果，推測(cè)兩者之間可能存在共同的抗原表位；因此，M、N蛋白并不是建立血清學(xué)檢測(cè)方法的最佳抗原。PDCoV S蛋白的S1區(qū)域含有多個(gè)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原受體結(jié)構(gòu)域，是制備抗體檢測(cè)ELISA試劑盒良好的候選蛋白。THACHIL等[33]開發(fā)了基于PDCoV S1蛋白的抗IgG間接ELISA試劑盒，是全世界首個(gè)檢測(cè)PDCoV的ELISA方法。LU等[34]以HEK-293T細(xì)胞表達(dá)的PDCoV S1蛋白作為包被抗原建立了檢測(cè)母乳中特異性IgA抗體的間接ELISA方法，批內(nèi)、批間變異系數(shù)為3.12%～8.47%和1.81%～14.26%；與其相比，本試驗(yàn)建立的檢測(cè)血清中特異性IgA抗體的間接ELISA方法，批內(nèi)、批間變異系數(shù)為2.09%～3.24%和3.53%～6.10%，具有更好的重復(fù)性。王經(jīng)緯等[35]以昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的S1蛋白為包被抗原建立了ELISA檢測(cè)方法，但真核表達(dá)成本高、純化困難、周期長(zhǎng)，不適于開發(fā)試劑盒。據(jù)報(bào)道，S蛋白基因在冠狀病毒成員中具有高度的變異性，可能導(dǎo)致基于S蛋白建立的ELISA方法的重復(fù)性和敏感性降低[36]。瞿歡等[37]利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)S1-CTD基因(832～1 848 bp)并建立了檢測(cè)IgG抗體的間接ELISA方法，其截短的S1-CTD基因包含部分S2區(qū)域，而本研究截取了S1-CTD抗原表位的核心區(qū)(877～1 299 bp)，能夠有效地減少S基因的變異點(diǎn)，提高間接ELISA方法的特異性和重復(fù)性；另外瞿歡等[37]建立的 PDCoV ELISA檢測(cè)方法是用來(lái)檢測(cè)血清中特異性IgG抗體的，而本研究建立的是對(duì)PDCoV防制更具有臨床實(shí)踐意義的IgA抗體ELISA檢測(cè)方法。

本試驗(yàn)選取的S1-CTD基因序列中含有7個(gè)半胱氨酸殘基，在天然的蛋白結(jié)構(gòu)中可形成3對(duì)分子內(nèi)二硫鍵；由于研究選擇原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該目的蛋白，且以包涵體形式表達(dá)，因此表達(dá)的蛋白在未透析前不存在二硫鍵結(jié)構(gòu)。為了使其更接近天然蛋白結(jié)構(gòu)，在透析液中加入了氧化還原對(duì)(還原性谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽)，使其形成二硫鍵結(jié)構(gòu)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，透析后蛋白相對(duì)分子質(zhì)量稍大于透析前蛋白相對(duì)分子質(zhì)量，證明本研究中透析后的蛋白存在分子內(nèi)二硫鍵，更接近于天然蛋白結(jié)構(gòu)。在Western blot鑒定中，樣品選用透析后的重組蛋白S1-CTD，由于透析可能存在不徹底，因此圖中顯示為2條帶，稍大的為主要抗原成分，存在二硫鍵結(jié)構(gòu)的蛋白，稍小的為不存在二硫鍵結(jié)構(gòu)的蛋白(或存在部分二硫鍵)。

綜上，本試驗(yàn)成功建立了檢測(cè)血清中PDCoV特異性IgA抗體的間接ELISA方法，通過(guò)反應(yīng)條件優(yōu)化，確定抗原最佳包被質(zhì)量濃度為8 mg/L、37℃包被 1 h；最佳封閉條件為百迪泰酶標(biāo)抗體穩(wěn)定劑37℃封閉 1 h；血清最佳反應(yīng)條件為1∶10稀釋，37℃孵育 40 min；酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)條件為1∶5 000 稀釋，37℃ 孵育45 min；TMB底物溶液最佳顯色時(shí)間為37℃ 10 min。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)速度快，具有良好的特異性、重復(fù)性和敏感性，為臨床上PDCoV的診斷、疫苗免疫水平的監(jiān)測(cè)及研究提供了新的技術(shù)方法，為進(jìn)一步開發(fā)臨床檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。