參澤舒肝膠囊及其拆方連續(xù)多次給藥對大鼠腎功能及腎組織形態(tài)的影響

紀鳳蘭，王 鑫，于小雅，劉 博，朱 穎，禹學軍，丁 濤，宋蓮蓮*

（1.吉林省中醫(yī)藥科學院藥效毒理評價中心，長春130012；2.吉林省科技創(chuàng)新平臺管理中心，長春130012；3.吉林敖東藥業(yè)集團延吉股份有限公司，延吉133001）

參澤舒肝膠囊為已上市中藥復方制劑，具有祛濕降濁、疏肝健脾功效，適用于非酒精性脂肪性肝炎，同時出現(xiàn)肝酶升高等病癥人群[1]，其配方組成中含有大黃、澤瀉、決明子成分。近年來關于大黃、澤瀉、決明子等藥材不斷有報道發(fā)現(xiàn)其有腎毒性反應[2-4]，為進一步明確該藥臨床應用的安全性，本研究按該制劑制備工藝生產了參澤舒肝膠囊及其方中大黃、澤瀉、決明子拆方后的樣品，通過正常健康大鼠灌胃26周觀察是否具有腎毒性、毒性反應程度，為參澤舒肝膠囊的使用安全性提供理論依據，指導臨床用藥。

1 材料

1.1 實驗藥品及主要試劑

名稱 批號 廠家S DH S-Z190401吉林敖東藥業(yè)集團延吉股份有限公司S-Z190401吉林敖東藥業(yè)集團延吉股份有限公司ZX S-Z190401吉林敖東藥業(yè)集團延吉股份有限公司JMZ S-Z190401吉林敖東藥業(yè)集團延吉股份有限公司BUN測試盒141309011深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司CRE測試盒20200526濰坊三維生物工程有限公司GSH-PX測試盒YX-151614R美國RD公司SOD測試盒20200513南京建成生物工程研究所HIF1β 14105-1-AP武漢三鷹生物技術有限公司

1.2 主要儀器

名稱 型號 廠家全自動生化分析儀CS-600B 長春迪瑞實業(yè)有限公司酶標儀 ELX-800 美國BioTeK公司顯微鏡 BX51 日本奧林巴斯圖像分析系統(tǒng) NIS-ELEMNT BR日本尼康

1.3 動物

SD大鼠,SPF級，101只，雌雄均用，體質量：110～150g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：1100111911074947。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

本試驗隨機分為10組：對照組、QFG27.68g生藥/kg(相當于人臨床用量的60倍)、QFD(人臨床等效劑量)2.77g生藥/kg、DHG1.43g生藥/kg、ZXG3.00g生藥/kg、JMZG2.26g生藥/kg（分別為QFG中該藥材的相同劑量），DHD0.14g生藥/kg、ZXD0.30g生藥/kg、JMZD0.23g生藥/kg（分別為QFD中該藥材的相同劑量），雌雄均用，每天灌服給藥一次，每周給藥6天，連續(xù)26周，每周按體重調整給藥量，給藥體積為15ml/kg。

2.2 指標檢測

2.2.1 一般狀態(tài)觀察、體重及飲食飲水量監(jiān)測、尿微量蛋白及血清CRE、BUN、GSH-PX、SOD含量或酶活性檢測

給藥期間每天觀察大鼠的一般癥狀及體征，每周對體重、飲食、飲水量進行監(jiān)測，并于給藥第26周結束，收集6小時大鼠尿液，禁食12h，麻醉，腹主動脈采血，分離血清，進行尿微量蛋白、血清CRE、BUN含量檢測，其余血清放入凍存管中，-80℃凍存，進行GSH-PX、SOD酶活性檢測。

2.2.2 病理組織學檢測

腎臟組織經固定、染色、封片，顯微鏡下觀察，顯微成像系統(tǒng)拍照記錄，每只動物通過圖像分析系統(tǒng)測量8個腎小球橫截面積，統(tǒng)計比較各組間差異；腎小管形態(tài)變化程度參照Radford M G文獻[5]進行分級評價。

2.2.3 腎臟HIF1β蛋白表達

免疫組化法，腎組織經石蠟切片脫蠟后進行抗原修復，分別孵育過氧化物酶阻斷劑，5%BSA，一抗HIF1β為1∶100，二抗(1∶100)，DAB顯色，復染，返藍，梯度脫水，透明，封片。鏡下觀察目的蛋白表達情況，通過圖像分析系統(tǒng)測量陽性表達HIF1β的平均光密度值。

2.2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 一般狀態(tài)、體重及攝食攝水量觀察

各給藥組動物給藥期間外觀體征、被毛狀態(tài)、行為活動與對照組比較，均未發(fā)現(xiàn)異常，無呼吸音異常，眼、鼻、口周圍無分泌物，未出現(xiàn)稀便、硬便等異?，F(xiàn)象。體重增長、飲食、飲水量變化與對照組比較均未呈現(xiàn)顯著性差異。

3.2 對尿微量蛋白的影響

結果可見，JMZG組尿微量蛋白有降低趨勢（P＜0.01），其它各給藥組與對照組比較均未呈現(xiàn)顯著性差異。詳見表1。

表1 尿微量蛋白結果(±S)Table 1Urine microprotein results(±S)

表1 尿微量蛋白結果(±S)Table 1Urine microprotein results(±S)

注：與對照組比較：**P＜0.01。

組別 動物數（只） 尿微量蛋白（mg/L）對照組 QFG 10 3.15±0.34 12 10 3.18±0.87 QFD 3.05±0.41 DHG 13 3.13±0.38 DHD 10 2.96±0.45 ZXG 13 2.86±0.58 ZXD 10 3.05±0.52 JMZG 13 2.71±0.27**JMZD 10 3.10±0.39

3.3 對血清BUN、CRE、GSH-PX、SOD含量或酶活性的影響

結果可見，ZXG、ZXD、JMZD組血清CRE含量有降低趨勢（P＜0.01、P＜0.05），ZXG、ZXD、JMZG組血清GSHPX酶活性有降低趨勢（P＜0.01、P＜0.05），DHG、JMZD組血清SOD酶活性有降低趨勢（P＜0.05）。詳見表2。

表2 血清BUN、CRE、GSH-PX、SOD含量或酶活性(±S)Table 2 Serum BUN,CRE,GSH-PX,SOD content or enzyme activity(±S)

表2 血清BUN、CRE、GSH-PX、SOD含量或酶活性(±S)Table 2 Serum BUN,CRE,GSH-PX,SOD content or enzyme activity(±S)

注：與對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動物數（只） BUN（mmol/L） CRE（μmol/L） GSH-PX（酶活力單位） SOD（U/ml）對照組 10 6.53±0.70 82.38±13.74 352.60±40.21 138.87±40.76 QFG 12 6.91±1.20 75.68±15.72 366.31±25.77 121.57±25.45 QFD 10 6.14±0.74 76.41±18.10 330.03±55.75 121.40±20.23 DHG 13 6.71±0.99 71.16±15.52 319.80±51.28 106.43±17.30*DHD 10 6.30±0.83 73.93±15.37 331.44±52.17 110.36±20.30 ZXG 13 6.57±1.15 66.55±6.77** 300.35±12.66** 130.89±16.54 ZXD 10 6.47±0.88 69.87±6.78* 317.73±36.81* 117.76±28.45 JMZG 13 5.92±0.80 73.52±11.58 303.89±16.15** 110.14±13.09 JMZD 10 5.96±1.00 67.20±7.23** 324.94±31.71 103.42±17.84*

3.4 對腎臟病理組織的影響

3.4.1 對腎小管形態(tài)變化的影響

結果可見，對照組、QFG、QFD組均有個別動物腎小管發(fā)生輕微腫脹；QFG、QFD組與對照組腎小管形態(tài)評分比較未見顯著性差異；單獨DH、ZX、JMZ各劑量組不同程度出現(xiàn)腎小管形態(tài)評分高于對照組（P＜0.01、P＜0.05）。詳見表3、圖1。

表3 腎小管變化程度分級評價結果Table 3 Renal tubule change grading evaluation results

圖1 腎臟病理照片（HE，×400）Figure 1 Pathological photos of kidney（HE，×400）

3.4.2 對腎小球橫截面的影響

結果可見，DHD、ZXG、JMZG組腎小球橫截面面積明顯大于對照組（P＜0.01、P＜0.05）。詳見表4。

表4 對腎小球橫截面的影響(±S)Table 4 Cross section of glomeruli(±S)

表4 對腎小球橫截面的影響(±S)Table 4 Cross section of glomeruli(±S)

注：與對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動物數（只） 面積（μm2）對照組 10 7051.85±2763.95 QFG 12 10 6887.81±2505.27 QFD 6636.57±2465.49 DHG 13 7503.61±2978.00 DHD 10 8031.50±1952.43**ZXG 13 7744.38±2253.69*ZXD 10 7200.25±1731.56 JMZG 13 7565.37±2139.54*JMZD 10 7351.11±2706.74

3.5 對腎臟組織中HIF1β的表達的影響

結果可見，DH、ZX、JMZ各劑量組腎組織HIF1β表達高于對照組（P＜0.01、P＜0.05）；QFG、QFD組與對照組比較無顯著性差異。DHG、DHD、ZXG、ZXD組中HIF1β表達以腎臟遠曲小管胞漿為主（圖中箭頭所示），近曲小管細胞胞漿中表達稍弱于遠曲小管表達量；ZXG、ZXD組中HIF1β表達以腎臟近曲小管胞漿為主（圖中箭頭所示），遠曲小管細胞胞漿中表達稍弱于遠曲小管表達量。詳見表5、圖2。

表5 腎組織中HIF1β的表達的變化(±S)Table 5 Cross section of glomeruli(±S)

表5 腎組織中HIF1β的表達的變化(±S)Table 5 Cross section of glomeruli(±S)

注：與對照組比較：*P＜0.05，***P＜0.001。

組別 動物數（只） 腎臟組織中HIF1β表達對照組 QFG 10 0.257±0.018 12 0.270±0.014 QFD 10 0.260±0.017 DHG 13 0.312±0.011***DHD 10 0.276±0.017*ZXG 13 0.309±0.015***ZXD 10 0.274±0.011*JMZG 13 0.289±0.015***JMZD 10 0.274±0.008*

圖2 腎臟HIF1β蛋白表達（×400）Figure 2 Expression of HIF1β protein in kidney（×400）

4 討論

DH、ZX、JMZ是我國應用廣泛、歷史悠久的中藥材，近年有研究報道長期大量服用會造成一定的肝損害及腎毒性反應[6-8]。QF為已上市復方中成藥，由山楂、澤瀉、茵陳等10味中藥組成，鑒于上述報道考慮本產品長期應用是否存在安全隱患，我們有針對性的對組方中報道有腎毒性反應的DH、ZX、JMZ 3味中藥分別按組方工藝進行制備，按該藥材在組方中的相同劑量進行拆方研究。

正常時腎臟呈現(xiàn)出強大的儲備和代償能力，腎功能輕度受損時BUN、CRE可無變化，只有當腎損害達到明顯程度時，BUN、CRE才明顯增高[9]。在本試驗條件下，ZXG、ZXD、JMZD組大鼠血清CRE含量有降低趨勢，CRE的這種變化提示ZXG、ZXD、JMZD組大鼠機體可能處于代償階段[10]。

有文獻報道[11]，藥物經直接作用和（或）氧化應激作用出現(xiàn)腎臟藥源性損傷。本研究中對照組、QFG、QFD組均有個別動物腎小管發(fā)生輕微腫脹，與對照組評級比較，未見明顯形態(tài)差異；單獨DH、ZX、JMZ各劑量組不同程度的增加腎小管變性程度的等級及變性數量，明顯高于對照組。DH、ZX、JMZ組中可以使腎小球橫截面積不同程度的擴張增大，腎小管和腎小球的形態(tài)變化可能體現(xiàn)為藥物的直接損傷作用反應。

人體內存在一套穩(wěn)定的氧化和抗氧化的機制，藥物誘導腎臟缺氧反應通路，其中缺氧誘導因子（HIF-1）是介導缺氧反應的重要缺氧誘導因子，當氧化應激作用超過正常水平時，將損傷機體細胞和組織進而影響腎臟，如損傷細胞組織功能，影響腎血流動力學、腎小球濾過、腎小管再吸收和分泌。SOD是體內清除自由基的主要成分，能有效緩解體內氧化應激，其活力呈現(xiàn)機體清除氧自由基的能力；GSH-Px為內源性抗氧化物酶，呈現(xiàn)機體的抗氧化能力，因此通過SOD、GSH-Px活性變化可以評價機體清除氧自由基的能力。在本試驗條件下，ZXG、ZXD、JMZG組血清GSHPX酶活性及DHG、JMZD組血清SOD酶活性均明顯低于對照組，說明機體的抗氧化能力可能呈現(xiàn)降低趨勢，提示藥物可能通過氧化應激作用導致腎臟出現(xiàn)自由基氧化代謝紊亂。

HIF-1是目前發(fā)現(xiàn)的唯一在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的特異性轉錄因子，其功能介導機體適應低氧環(huán)境。存在于人體內的HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β2個亞基組成的一種異源二聚體轉錄因子，目前對HIF-1α的研究較多，很少有報道關于藥物導致動物腎組織中HIF-1β表達變化的研究。大黃素是一種蒽醌類物質，可以上調重癥胰腺炎腎損傷模型大鼠血清中HIF-1α的表達[12]。本試驗中DHG、JMZG、JMZD組中腎遠曲小管上皮細胞胞漿中表達HIF1β蛋白為主、呈上調趨勢，DH和JMZ中均含有大黃素，試驗中HIF1β上調結果與現(xiàn)有報道相吻合。結合QFG、QFD組中HIF1β蛋白未見明顯升高，推測單獨DH、JMZ中相關成分可能誘導腎小管上皮細胞出現(xiàn)缺氧狀態(tài)，導致HIF1β蛋白表達升高；QF配伍后相關成分可能發(fā)生了變化，因而未表現(xiàn)出HIF1β蛋白表達的變化。ZX主要化學成分為三萜及倍半萜類成分，和DH和JMZ的化學成分具有差異，本試驗ZX組中，HIF1β蛋白在腎近曲小管上皮胞漿中表達升高為主，HIF1β的表達主要位置與DH和JMZ組具有差異。提示ZX長期服用可以誘導腎近曲小管上皮表達HIF1β升高。本試驗研究發(fā)現(xiàn)的DH、ZX和JMZ長期給藥可以上調腎小管上皮細胞中HIF1β的表達，尚需進一步探討HIF1β在藥物性腎損害中的病理機制和調控機制，HIF1β可能是藥物腎臟損傷的潛在作用靶點，進行相關研究可為臨床藥物應用提供理論依據。

QFG、QFD組長期給藥腎毒性反應程度與對照組比較均未見明顯差異，提示組方以后可能具有減毒作用[13-15]，QF雖然制劑中單味藥DH、ZX、JMZ單獨長期服用可能會增加腎臟負擔，但全方長期服用并未顯示出對腎臟明顯的毒性反應，說明該制劑長期服用是安全的。