正交試驗(yàn)法提取細(xì)葉景天中黃酮類成分的研究

楊若熙，譚惠能，吳仕筠，翁德會*

（1.武漢華夏理工學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，武漢430223；2.武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，武漢430074）

細(xì)葉景天（Sedum Elatinoides Franch.）為景天科景天屬，多年生肉質(zhì)草本，株高30～40cm。根狀莖長，匍匐狀。葉絨狀匙形，寬0.3～0.5 cm。花序不呈平頂或稍平頂，花黃色，生于海拔2350～3400 m的山坡石隙,耐寒，耐干旱，喜陽光充足。四川、湖北、陜西、甘肅和山西有分布。在我國民間及多個(gè)少數(shù)民族地區(qū)以其作藥用。全草藥用，清熱解毒，治痢疾。有文獻(xiàn)報(bào)道，景天屬植物中含有黃酮類化合物[1-2]。但是關(guān)于細(xì)葉景天中黃酮類成分研究尚未見報(bào)道。為了開發(fā)利用這一藥用植物資源，本實(shí)驗(yàn)對細(xì)葉景天中黃酮類成分的提取工藝進(jìn)行了研究，希望獲得最佳提取工藝，為細(xì)葉景天中黃酮成分提取工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

細(xì)葉景天，產(chǎn)地：湖北建始縣，由中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院萬定榮老師鑒定并提供；無水乙醇，分析純（AR），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇，分析純（AR），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；甲醇，分析純（AR），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉，分析純（AR），天津市河北區(qū)海晶精細(xì)化工廠；氫氧化鈉，分析純（AR），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁，分析純（AR），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；蘆丁對照品（純度98%，批號：150403），天津一方科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

756型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；KQ-100E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Auy-120型1/10000電子天平，日本島津公司；微量可調(diào)移液器，100～1000 μl。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

參照文獻(xiàn)[3-5]以蘆丁為對照品測定細(xì)葉景天中總黃酮含量，加入鋁離子試劑,同時(shí)控制適宜pH值,使黃酮類化合物與鋁鹽形成絡(luò)合物在可見區(qū)能獲得穩(wěn)定的特征吸收峰。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0125 g，用甲醇適量，置水浴上微熱溶解，放冷，轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，制成濃度為0.500 mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取20 ml，置50 ml量瓶中，加水定容至50 ml，制成濃度為0.200 mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 測定波長的選擇

移取濃度為0.200 mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液3.0 ml，置于25 ml量瓶中，加水至6 ml，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻，放置6 min，加1 mol/L氫氧化鈉溶液10 ml，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，進(jìn)行全波長掃描，測定其最大吸收。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、3、4、5、6 ml，分別置于25 ml量瓶中，按1.3.2法操作，以相應(yīng)試劑為空白，用紫外-可見分光光度法，在499 nm的波長處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 正交單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 料液比單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取2.00 g已粉碎的細(xì)葉景天粉末5份于5個(gè)100 ml的燒杯中，按超聲時(shí)間30 min，乙醇提取濃度50%，料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30進(jìn)行提取，紗布過濾，離心6000 r/min，15 min，分別取上清液1 ml，按1.3.2法操作，于499 nm處測定其吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出總黃酮含量（以干燥品計(jì)）[6-8]。

1.3.4.2 乙醇濃度單因素

準(zhǔn)確稱取2.00 g已粉碎的細(xì)葉景天粉末5份于5個(gè)100 ml的燒杯中，按料液比1∶20，超聲時(shí)間30 min，乙醇提取液濃度分別為40%，50%，60%，70%，80%進(jìn)行提取，紗布過濾，離心6000 r/min，15 min，分別取上清液1 ml，按1.3.2法操作，于499 nm處測定其吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮含量（以干燥品計(jì)）。

1.3.4.3 超聲波時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取2.00 g已粉碎的細(xì)葉景天粉末5份于5個(gè)100 ml的燒中，按料液比1∶20，乙醇提取濃度50%，超聲時(shí)間15、20、25、30、35 min進(jìn)行提取，紗布過濾，離心6000 r/min，15 min，分別取上清液1 ml，按1.3.2法操作，于499 nm處測定其吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮含量（以干燥品計(jì)）。

1.3.5 四因素三水平正交試驗(yàn)

為系統(tǒng)考察超聲波乙醇浸提法提取細(xì)葉景天中黃酮類成分的工藝參數(shù)，根據(jù)已有資料和單因素實(shí)驗(yàn)，選用乙醇濃度、超聲時(shí)間和料液比作為考察因素，以測得樣品中黃酮含量為考察指標(biāo)。進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)[9-12]。

1.3.6 含量測定的方法學(xué)考查

1.3.6.1 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 ml于6只25 ml的容量瓶中，按1.3.2法操作，在499 nm處測定其吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮含量（以干燥品計(jì)），并計(jì)算RSD%。

1.3.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品溶液，于選定波長499 nm處，按1.3.2法操作，測定顯色5、10、15、20、25 min的A值，以干燥品計(jì)，得出總黃酮的含量，并計(jì)算RSD%。

1.3.6.3 回收率實(shí)驗(yàn)

在已知黃酮含量的樣品溶液中精密加入由低到高的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，即分別取樣品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml置于25 ml的量瓶中，再各加入0.200 mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1.0 ml。按1.3.2法操作，以干燥品計(jì)，計(jì)算回收率和RSD%。

1.3.7 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已粉碎的細(xì)葉景天2.00 g四份，分別按照最佳提取條件制備樣品，按1.3.2法操作，以干燥品計(jì)，計(jì)算黃酮的含量，并計(jì)算RSD%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 測定波長的選擇

按照1.3.2方法操作，測定其最大吸收。結(jié)果表明：蘆丁在499nm處有一較大吸收峰，故選499nm為測定波長。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法操作，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出回歸方程和r值。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程圖詳見表1、圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程圖

表1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果表明，回歸方程A=0.011C,相關(guān)系數(shù)r=0.9992，表明蘆丁濃度在0.8～0.48 μg/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 正交單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 料液比單因素實(shí)驗(yàn)

按上述方法操作，于499 nm處測定其吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出總黃酮含量（以干燥品計(jì)）。

其中V=1 ml，k=0.011，n1=20，n2=30，n3=40，n4=50，n5=60分別代入A值計(jì)算可得含量。結(jié)果見表2、圖2。

表2 料液比單因素

圖2 料液比單因素

由表2、圖2可見，浸提固液比在l∶10至1∶30的范圍內(nèi)，浸提料液比在l∶20時(shí)提取率最高，但隨后增加溶劑的量對提取率的變化不大.因此選取料液比為1∶15、1∶20、1∶25進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.2 乙醇濃度單因素

按上述方法操作，于499nm處測定其吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮含量（以干燥品計(jì)）。

其中V=1 ml，k=0.011，分別代入A值計(jì)算可得含量。結(jié)果見表3、圖3。

表3 乙醇濃度單因素

圖3 乙醇濃度單因素

由表3、圖3可見，隨著乙醇濃度的增加，黃酮的提取率也逐漸增加，但是當(dāng)乙醇濃度超過50%的時(shí)候，黃酮的提取率反而降低，所以選擇乙醇濃度40%、50%、60%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.3 超聲波時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)

按上述方法操作，于499 nm處測定其吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮含量（以干燥品計(jì)）。

其中V=1ml，k=0.011，分別代入A值計(jì)算可得含量。結(jié)果見表4、圖4。

表4 超聲時(shí)間單因素

圖4 超聲時(shí)間單因素

由表4、圖4可以看出，隨超聲波提取時(shí)間從10～35 min，提取得率逐漸提高，增加超聲波提取時(shí)間，提取得率逐漸提高，因此選取超聲時(shí)間為30、35、40 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4 四因素三水平正交試驗(yàn)

L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表5所示。

表5 L9（34）正交試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)水平

準(zhǔn)確稱取2.00g已粉碎的細(xì)葉景天粉末9份于9個(gè)100 ml的燒中，按表5及表6進(jìn)行浸提，離心6000 r/min，15 min，分別取上清液1 ml，按1.3.2法操作，于499 nm處測定其吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，以干燥品計(jì)，得出總黃酮含量(考慮到實(shí)際吸光度大于1，可以將所配溶液稀釋2倍)。

其中V=1 ml，k=0.011，n=30、40、50分別代入A值計(jì)算可得含量。結(jié)果見表6、表7。

表6 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果分析

表7 方差分析表

F臨界值 F0.01(2,2)=99 F0.05(2,2)=19

通過正交試驗(yàn)和方差分析考慮A、B、C、D四因素在三個(gè)水平上的變化，可知A（乙醇濃度）、B（超聲時(shí)間）、D（料液比）因素的影響均無顯著性差異。因此得出影響細(xì)葉景天中黃酮類化合物提取率的因素主次順序?yàn)锽＞D＞A＞C，從平均提取得率看，提取條件A3B3C3D2,最好，所以選擇A3B3C3D2，即乙醇濃度為60%，超聲時(shí)間為40 min，料液比為1∶20。

2.5 含量測定的方法學(xué)考查

2.5.1 精密度試驗(yàn)

精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8 精密度考察結(jié)果

表8結(jié)果表明，RSD=2.96%，表明此實(shí)驗(yàn)所用儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9。

表9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表9結(jié)果表明，RSD=2.29%，表明此樣品在25min內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.5.3 回收率實(shí)驗(yàn)

回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表10。

表10 回收率測定結(jié)果

表10結(jié)果表明，平均回收率為71.35%，RSD=2.13%，回收率結(jié)果稍微偏低。

2.6 最佳提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按最佳提取工藝操作，以干燥品計(jì)，計(jì)算黃酮的含量，并計(jì)算RSD%。結(jié)果見表11。

表11 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表11結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3431，RSD=0.6567%，表明此提取工藝有良好的重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，采用超聲波乙醇浸提法提取細(xì)葉景天中總黃酮成分，影響細(xì)葉景天中黃酮成分提取條件的因素主次順序?yàn)锽＞D＞A＞C，最佳提取工藝條件為乙醇濃度60%，超聲時(shí)間40 min，料液比1∶20。本提取工藝條件穩(wěn)定、簡單、黃酮的得率高，可行。

3.1 回收率實(shí)驗(yàn)的討論

在樣品的回收率試驗(yàn)中，回收率結(jié)果稍微偏低，可能的原因有以下幾點(diǎn)：a.本實(shí)驗(yàn)的樣品是中藥材，并且成分比較復(fù)雜，目標(biāo)成分損失較大；b.在提取過程中由于操作誤差，導(dǎo)致目標(biāo)成分有所損失。

3.2 提取方法的討論

利用超聲波乙醇浸提法從細(xì)葉景天中提取、純化得到的黃酮類物質(zhì)（以蘆丁為指標(biāo)）其純度較高。超聲波可以強(qiáng)化乙醇浸提法，達(dá)到省時(shí)、高效、節(jié)能的目的，此方法采用全物理過程，無任何污染，是一條理想的提取黃酮類物質(zhì)的途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.3 實(shí)驗(yàn)材料的選擇

由于細(xì)葉景天中活性物質(zhì)的含量與產(chǎn)地、氣候、栽培條件有很大關(guān)系,故不同品種、不同時(shí)期、不同部位（根、莖、葉等）中黃酮類物質(zhì)含量可能會有一些差別,至于差別的大小還有待于進(jìn)一步研究分析。

3.4 應(yīng)用前景及實(shí)驗(yàn)意義

近年來，世界上掀起了植物藥開發(fā)的熱潮，植物藥以其天然低毒的特點(diǎn)倍受青睞，而黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用引人矚目。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)葉景天中含有較為豐富的黃酮類物質(zhì)。因此，具有廣泛的開發(fā)和利用價(jià)值。