斑叉牙蝦虎魚(Apocryptodon punctatus)角膜上皮細(xì)胞掃描電鏡形態(tài)觀測(cè)

胡文嫻，路昊明，張媛媛，沐 遠(yuǎn)

(1.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 云南省高校洱海流域生態(tài)環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)工程研究中心，洱海研究院，云南 大理 671006；2.安徽大學(xué) 文典學(xué)院，安徽 合肥 230601；3.北京動(dòng)物園 圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044；4.大理大學(xué) 東喜瑪拉雅研究院，云南 大理 671003)

由于生存環(huán)境、生活史對(duì)策和進(jìn)化程度等因素的影響，魚類的視覺能力與陸生哺乳動(dòng)物有明顯差異[1-2].對(duì)水環(huán)境的適應(yīng)使魚類的眼睛形成了一系列特殊的結(jié)構(gòu)，魚類的晶狀體是圓球形的，遠(yuǎn)方物體反射的光線通過晶狀體折射形成的影像，落在了視網(wǎng)膜的前方，所以魚類看不清遠(yuǎn)方的物體.此外，由于受水中微生物、懸浮物以及水層的影響，光線投射會(huì)受到阻礙，不像在空氣中可以看得很遠(yuǎn).因此，魚眼的構(gòu)造適于看近物[3].

角膜是眼睛最外層的組織，對(duì)動(dòng)物的視覺至關(guān)重要，具有折射光線以及保護(hù)眼睛內(nèi)部結(jié)構(gòu)的功能[4-5].不同于視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞，角膜由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生理功能，在不同的環(huán)境中，可能具有不同的適應(yīng)機(jī)制[4].此外，角膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)有不同的細(xì)胞類型和細(xì)胞密度，以及微絨毛(microvilli)、微褶(microplicae)、微嵴(microridges)、微孔(microholes)等微結(jié)構(gòu)[6].研究發(fā)現(xiàn)，由于對(duì)不同方位的視覺感知(例如：上、下、前、后等)，同一眼球不同區(qū)域的角膜上皮細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、微結(jié)構(gòu)等會(huì)出現(xiàn)差異[7].背眼蝦虎魚亞科是具有兩棲特性的類群，?；顒?dòng)于潮間帶、灘涂等生境中[8].背眼蝦虎魚亞科中，在一個(gè)晝夜循環(huán)的部分時(shí)間里完全陸棲的類群被稱為彈涂魚(mudskipper)，包括大彈涂魚屬(Boleophthalmus)、青彈涂魚屬(Scartelaos)、齒彈涂魚屬(Periophthalmodon)和彈涂魚屬(Periophthalmus)[9].在背眼蝦虎魚亞科中，可以看到一個(gè)由低到高的陸生性排序.彈涂魚的陸生性高于亞科內(nèi)其他屬，彈涂魚內(nèi)部，青彈涂魚屬陸生性最低，而彈涂魚屬陸生性最高.Hu等[10]發(fā)現(xiàn)，由于生境和發(fā)育時(shí)序上的差異，背眼蝦虎魚亞科魚類角膜上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了差異，并在不同區(qū)域上也有了差別；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，其角膜發(fā)育相關(guān)基因COL8A2在該類群中也出現(xiàn)了特異性演化特征[11].

斑叉牙蝦虎魚(Apocryptodonpunctatus)隸屬于蝦虎魚目(Gobiiformes)蝦虎魚科(Gobiidae)背眼蝦虎魚亞科(Oxudercinae)叉牙蝦虎魚屬(Apocryptodon).叉牙蝦虎魚屬鑒別特征為：第4椎骨側(cè)突具向后延伸的小片(lamina)，并具眶上孔.斑叉牙蝦虎魚活體形態(tài)特征主要為：背部淺綠色，腹部白色；側(cè)線連續(xù)，體側(cè)具5～6個(gè)黑斑，并有一黑色線條自眼下方貫穿尾柄;魚鰭透明，第2背鰭具小黑斑;尾鰭基部灰色，下部黑色，上部淡橘色;臀鰭后方淺黑色;腹鰭端部淡橘色;胸鰭基部橘色，下部邊緣淡灰色;背鰭前鱗片22～23枚[9].

斑叉牙蝦虎魚的基礎(chǔ)生態(tài)學(xué)特征為：其為日本群島南部特有種，模式標(biāo)本采集于九州島.主要棲息于河口附近無植物區(qū)，溫帶開放性泥灘[12-13].根據(jù)Dotsu，Koyama等[12-13]觀察發(fā)現(xiàn)，該種一般活躍于淤泥沉積較多的內(nèi)灣區(qū)，常與甲殼類動(dòng)物雙凹鼓蝦(Alpheusbisincisus)等共棲，或棲息于蟹類及另一蝦虎魚目物種——紅狼牙蝦虎魚(Odontamblyopusrubicundus)的洞穴中.胃容物研究發(fā)現(xiàn)，該種在仔稚魚階段以浮游動(dòng)物為食，成年后轉(zhuǎn)向植食性，主要攝食淤泥表面的硅藻.該種與背眼蝦虎魚亞科其他種類，如大彈涂魚屬共同利用硅藻資源，但能通過錯(cuò)開覓食時(shí)間的方式減少競(jìng)爭(zhēng).具體方法為叉牙蝦虎魚屬在漲潮后游出藏身處攝食，而大彈涂魚屬在退潮后灘涂暴露于空氣中時(shí)爬行攝食.日本有明海種群繁殖期約為5—7月，雌魚懷卵量592～5 826枚，卵黏性，橢圓形，長(zhǎng)約1 mm，一端具黏絲.仔魚營水層浮游生活，成體轉(zhuǎn)向底棲，約2 a時(shí)間達(dá)到性成熟[12].在背眼蝦虎魚亞科中，該物種相對(duì)于其他大多數(shù)類群，更偏向水生的環(huán)境.就目前而言，關(guān)于該物種視覺適應(yīng)的研究仍然不多.

1 材料方法

1.1 樣本及基本情況

叉牙蝦虎魚樣本(成體)來自中國科學(xué)院動(dòng)物研究所(ASIZB)魚類標(biāo)本館，其基本情況如表1所示.

表1 該研究所用樣本基本信息

1.2 樣品處理、數(shù)據(jù)測(cè)量和分析

在ZEISS STEISV II體視顯微鏡下觀察眼睛形狀、位置，沿魚眼緣完整取出標(biāo)本右側(cè)眼球.用蒸餾水將切下的眼球洗凈，以80%至100%酒精梯度脫水.利用LEICAEMCPP 300型臨界點(diǎn)干燥儀進(jìn)行干燥，HITACHIE-1010 SPUTTER型離子濺射儀噴鍍，利用HITACHI S-3000N型掃描電鏡觀察樣品并拍照.以魚眼自然睜開狀態(tài)下暴露的角膜，分別取正中、上、下、左、右5個(gè)區(qū)域進(jìn)行觀察比較.為確保照片的有效性，每個(gè)區(qū)域均選擇多個(gè)位置拍攝5張以上的照片記錄信息，拍攝位點(diǎn)見圖1所示.

圖1 角膜觀察點(diǎn)位示意圖

由于掃描電鏡下，魚類的角膜被放大許多倍(筆者所用圖片放大范圍為8 000～28 000倍)，掃描電鏡所記錄圖片中有比例尺大小和原圖的邊長(zhǎng)尺寸，可計(jì)算得出圖片的實(shí)際面積.關(guān)于細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)方法，采用類似于細(xì)胞計(jì)數(shù)板法，每1張圖片相當(dāng)于細(xì)胞板中間的計(jì)數(shù)格，由于圖片中細(xì)胞邊界明顯，計(jì)數(shù)時(shí)統(tǒng)計(jì)圖片內(nèi)出現(xiàn)的所有細(xì)胞，對(duì)于圖片邊緣出現(xiàn)不完整的細(xì)胞，僅計(jì)算左側(cè)和上側(cè)的細(xì)胞(包括壓線細(xì)胞)，省略圖片下側(cè)和右側(cè)的壓線細(xì)胞，以此方法來減小計(jì)數(shù)誤差.利用ARCGIS10軟件打點(diǎn)統(tǒng)計(jì)每1張圖片中的細(xì)胞數(shù)量，測(cè)量圖片尺寸，根據(jù)圖片比例尺計(jì)算各個(gè)圖片的角膜上皮細(xì)胞的密度，再通過多張圖片的數(shù)據(jù)取平均值得出每1個(gè)標(biāo)本每1個(gè)區(qū)域的角膜密度.

觀察所拍攝的電鏡圖片，確定圖片中的細(xì)胞類型及微結(jié)構(gòu)類型，同樣利用ARCGIS10軟件測(cè)量微嵴的寬度以及微嵴間距，根據(jù)圖片比例尺換算所測(cè)得的距離長(zhǎng)度，再通過多個(gè)點(diǎn)位和多張圖片的數(shù)據(jù)取平均值得出每1個(gè)標(biāo)本每1個(gè)區(qū)域的微嵴寬度和微嵴間距值.

利用SPSS 22.0計(jì)算上皮細(xì)胞的密度、微嵴寬度和微嵴間距的總體平均值(結(jié)果用Mean表示)，并做相關(guān)分析.

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

斑叉牙蝦虎魚(A.punctatus)的角膜上皮細(xì)胞如圖2所示，細(xì)胞邊界明顯，具有微嵴(microridge)，且微嵴清晰連續(xù)，微嵴和微嵴間隙的寬度可測(cè)量，但未觀察到微孔(microholes)、微褶(microplicae)和微絨毛(microvilli).細(xì)胞類型為微嵴型細(xì)胞.

圖2 斑叉牙蝦虎魚角膜上皮細(xì)胞電鏡掃描結(jié)構(gòu)(mr：微嵴)(以上圖片僅為參與統(tǒng)計(jì)的部分圖片，主要為展示結(jié)構(gòu))

2.2 角膜上皮細(xì)胞密度、微嵴寬度和微嵴間距

斑叉牙蝦虎魚(A.punctatus)角膜不同區(qū)域上皮細(xì)胞密度，最大值出現(xiàn)在右側(cè)，為19 782 mm-2，角膜細(xì)胞密度整體平均值為(18 106±1 719)mm-2.角膜不同區(qū)域上皮細(xì)胞的微嵴寬度，最大值出現(xiàn)在下側(cè)，為252 nm，角膜細(xì)胞的微嵴寬度平均值為(240±9)nm.角膜上皮細(xì)胞的微嵴間距寬度，最大值出現(xiàn)在左側(cè)，為297 nm，角膜細(xì)胞的微嵴間距寬度平均值為(251±34)nm.如表2所列.

表2 斑叉牙蝦虎魚角膜不同區(qū)域上皮細(xì)胞的密度、微嵴寬度和微嵴間距

2.3 角膜上皮細(xì)胞密度與微嵴寬度呈顯著負(fù)相關(guān)

為了探究角膜上皮細(xì)胞密度與微嵴寬度之間的關(guān)系，進(jìn)行相關(guān)分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，角膜上皮細(xì)胞密度與微嵴寬度之間具有顯著的負(fù)相關(guān)，公式為：Log10(Microridge width)=3.78-0.33Log10(Cell density)(R2=0.82，p<0.01)，即隨著細(xì)胞密度的增加，微嵴寬度減小，如圖3所示.角膜上皮細(xì)胞密度與微嵴間距之間無顯著相關(guān)關(guān)系(p>0.05).

圖3 角膜上皮細(xì)胞密度和微嵴間距平均值的相關(guān)性

3 討 論

角膜上皮細(xì)胞中，不同的微結(jié)構(gòu)特征具有與之相對(duì)應(yīng)的功能.研究發(fā)現(xiàn)，微絨毛(microvilli)的主要功能是使得細(xì)胞的表面積增加，從而有助于吸收氧氣和其他營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，此外，還能夠協(xié)助水分的運(yùn)輸和營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，它對(duì)于陸生脊椎動(dòng)物，在空氣中保持淚膜的固有形態(tài)和清晰的視覺方面非常重要；微嵴(microridges)對(duì)于增加細(xì)胞膜表面積是效率最低的一種微結(jié)構(gòu)，它通常出現(xiàn)在高滲透壓環(huán)境(主要是海洋)；微褶(microplicae)起到支持細(xì)胞形態(tài)與增加角膜表層滲透交換的作用；微孔(microholes)的擠壓使黏液得以分泌到角膜表面[14-15].筆者在斑叉牙蝦虎魚的角膜上皮細(xì)胞中，只觀察到了微嵴1種微結(jié)構(gòu)，這種微結(jié)構(gòu)很可能與該物種基本只在海水中活動(dòng)，其角膜應(yīng)對(duì)海水滲透壓有關(guān).一般來說，海洋物種中微嵴型細(xì)胞最為常見[17].筆者的研究中，斑叉牙蝦虎魚(A.punctatus)棲息于缺少植物區(qū)的河口地帶、溫帶泥灘的開放性區(qū)域及海水中[16]，角膜上皮細(xì)胞為微嵴型細(xì)胞，與水生的布氏棘鯛(Acanthopagrusbutcheri)相似[14].這在一定程度上說明，在背眼蝦虎魚亞科中，該物種由于對(duì)水環(huán)境的依賴程度較大，角膜上皮細(xì)胞仍保留了適應(yīng)水生環(huán)境的特征.

“四眼魚(Anablepsanableps)”每只眼睛都能同時(shí)看到水線的上方(空氣環(huán)境)和下方(水環(huán)境)，使其可以在水面或淺灘覓食“保持警惕”，以防止捕食者可能從水面上或水面下接近，以及搜尋來自水面上方的小昆蟲作為食物[18-19].對(duì)其角膜不同位置細(xì)胞密度和微結(jié)構(gòu)的差異研究發(fā)現(xiàn)，不同區(qū)域的角膜具有形態(tài)學(xué)上的適應(yīng)性[7].細(xì)胞密度隨角膜滲透壓的降低而降低，角膜的微嵴寬度差異表明，可能有一些功能性的作用[14, 17, 20].斑叉牙蝦虎魚(A.punctatus)的眼球基本在眼眶內(nèi)，筆者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其上、下、左、右、中不同區(qū)域間的角膜上皮細(xì)胞密度、微嵴間距和微嵴寬度出現(xiàn)了一些差異，一定程度上提示斑叉牙蝦虎魚的角膜與四眼魚類似，可能也產(chǎn)生了一些適應(yīng)性的改變.但由于樣本的匱乏，因此需要后期研究中進(jìn)一步驗(yàn)證.此外，筆者還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度和微嵴間距之間具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與其他不同物種間呈現(xiàn)的趨勢(shì)一致，即細(xì)胞密度和微嵴間距之間可能具有相互制約的關(guān)系.

4 展 望

脊椎動(dòng)物由水生過渡到陸生的進(jìn)化飛躍，一直以來備受科學(xué)界的關(guān)注.目前為科學(xué)界公認(rèn)的是，泥盆紀(jì)時(shí)期的四足形類肉鰭魚，是陸生脊椎動(dòng)物的共同祖先[15].然而現(xiàn)生肉鰭魚類多樣性較低，僅存6個(gè)淡水物種及2個(gè)海洋物種，且特化程度高，與泥盆紀(jì)時(shí)期的四足形類肉鰭魚相比已發(fā)生較大改變[21].而背眼蝦虎魚亞科物種，尤其是4個(gè)兩棲性最高的“彈涂魚”屬，在印度-西太平洋地區(qū)的沿海紅樹林灘涂中達(dá)到最高多樣性[9]，是現(xiàn)代輻鰭魚類向陸地生境進(jìn)化的活樣本.彈涂魚在解剖結(jié)構(gòu)、生態(tài)習(xí)性[22]方面與泥盆紀(jì)四足形類肉鰭魚有可比之處，可以對(duì)研究脊椎動(dòng)物由水生過渡到陸生的進(jìn)化過程提供參考.

在硬組織方面，彈涂魚與四足形類的潘氏魚具有相似之處[23]，但泥盆紀(jì)四足形類早已滅絕，包括眼球、角膜在內(nèi)的軟組織結(jié)構(gòu)完全沒有留存.筆者的研究證明習(xí)性偏水生的斑叉牙蝦虎魚晶狀體更接近球形，微結(jié)構(gòu)僅有1種微嵴，與純水生魚類更為接近；這些研究結(jié)果與先前對(duì)4個(gè)彈涂魚屬角膜微結(jié)構(gòu)的研究[10]一起，構(gòu)建了更多的從水生到兩棲、從簡(jiǎn)單到復(fù)雜的角膜微結(jié)構(gòu)進(jìn)化序列，為兩棲魚類的視覺進(jìn)化提供了更清晰的線索，以期為探索脊椎動(dòng)物從水到陸、“從魚到人”的進(jìn)化命題提供新的啟發(fā).