“平喘湯”通過調控TGF-β1/Smad信號通路抑制哮喘大鼠氣道重塑機制研究

沈王豐 肖 磊 梁小紅 馮高華 劉美秀

（南京中醫(yī)藥大學附屬張家港醫(yī)院，江蘇張家港 215600）

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）是兒童和成人最普遍的一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，約有3億人患有此病[1]，我國大陸地區(qū)成年人哮喘的患病率約1.24%[2-3]。臨床常使用皮質類固醇治療哮喘，但長期應用此類藥物易產(chǎn)生依賴性，故患者依從性差。哮喘的發(fā)病機制涉及氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑。氣道重塑以往被認為是反復炎癥損傷與修復的結果，發(fā)生于慢性炎癥下的疾病后期。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，氣道重塑與疾病發(fā)展平行進行，早期和輕度哮喘患者也存在一定程度的氣道重塑[4-5]。轉化生長因子-β1（TGF-β1）/Smad信號通路在哮喘的氣道重塑中起著關鍵作用[6-8]，成為哮喘預防和治療的重要靶點。

平喘湯是由三拗湯和三子養(yǎng)親湯化裁而來的經(jīng)驗方，可宣肺化痰、止咳平喘，具有較好的臨床療效[9]。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，平喘湯可以減輕哮喘模型動物肺組織炎性細胞浸潤，抑制TGF-β1表達，改善哮喘氣道炎癥[10-11]，但平喘湯是否可通過TGF-β1/Smad通路減輕哮喘模型動物的氣道重塑尚不明確。本研究制備哮喘大鼠模型，觀察平喘湯對模型大鼠TGF-β1/Smad通路相關蛋白的影響，為臨床治療應用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物36只8周齡SPF級SD大鼠，雌雄各半，體重（220±20）g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2017-0001，動物飼養(yǎng)在溫度為22～24 ℃、濕度為40%～70%的SPF環(huán)境中，自由進食和飲水，適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。本實驗經(jīng)南京中醫(yī)藥大學附屬張家港醫(yī)院倫理委員會批準同意（批準編號：2021-08-75）。

1.2 實驗藥物平喘湯藥物組成：炙麻黃10 g，苦杏仁10 g，葶藶子10 g，紫蘇子10 g，萊菔子15 g，白芥子10 g，枳殼10 g，桔梗6 g，地龍20 g，僵蠶10 g，五味子6 g。中藥飲片均購自蘇州天靈中藥飲片有限公司，由張家港市中醫(yī)醫(yī)院提供，均經(jīng)藥學部蔣志濤副主任藥師鑒定符合2015年版《中華人民共和國藥典》的相關標準，由制劑室制備成生藥質量濃度為2 g/mL的浸膏，灌胃前用超純水稀釋。醋酸地塞米松片（上海上藥信誼藥廠有限公司生產(chǎn)，0.75 mg/片，批準文號：國藥準字H31020793，生產(chǎn)批號：015170401），實驗時以超純水溶解成1 g/L溶液備用。

1.3 主要試劑卵清白蛋白（ovalbumin，OVA，美國Sigma公司，貨號：A5253）；磷酸鹽緩沖液（PBS，北京中杉會橋生物技術有限公司，批號：A190711）；大鼠TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，產(chǎn)品編號：ml002856）；蘇木素染液、伊紅染液（珠海貝索生物技術有限公司，貨號：BA-4041，BA-4024）；馬松（Masson）染液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：G1340）；DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：ZLI-9018）；BCA蛋白檢測試劑盒（美國Thermo公司）；Anti-Smad3抗體（美國Abcam公司，貨號：ab40854）；Anti-Smad2抗體（美國Affinity Biosciences公司，貨號：AF6449）；Anti-TGF-β1抗體（北京博奧森生物技術有限公司，貨號：bs-0086R）。

1.4 主要儀器402AI超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設備有限公司）；RM2235型組織切片機，HI1210型漂片機（德國Leica公司）；MDF-339型醫(yī)用恒溫冰箱（日本Panasonic公司）；Tiss-24型組織研磨儀（上海凈信實業(yè)有限公司）；Mini-PROTEAN型凝膠電泳 儀，Trans-Blot Turbo型 轉 膜 儀（美 國Bio-Rad公司）；ImageQuant LAS 500生物分子成像儀（美國GE）；BX43型光學顯微鏡、UC90型成像系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

2 實驗方法

2.1 造模與分組取30只大鼠，參照文獻[12]的方法并作改進，進行致敏、激發(fā)，制備哮喘動物模型。實驗第1天和第8天于大鼠雙側腹股溝各取1點，每點皮下注射0.5 mL含OVA 10 mg、氫氧化鋁200 mg的溶液。另取6只大鼠作為正常組，相同位置皮下注射等體積生理鹽水。實驗第15天，將致敏大鼠采用隨機字數(shù)表法分為模型組、地塞米松組和平喘湯低、中、高劑量組，每組6只。每日11∶00將致敏大鼠置于透明密閉容器中，用1%OVA溶液霧化30 min，正常組大鼠霧化吸入等體積生理鹽水，每日1次，持續(xù)3周。

致敏階段，致敏大鼠行為學未見明顯改變；激發(fā)時，造模大鼠出現(xiàn)煩躁、抓耳撓腮、嗆咳、呼吸急促等癥狀；激發(fā)1周后，造模大鼠上述癥狀明顯加重，并出現(xiàn)精神萎靡、反應遲鈍、進食減少、點頭樣喘息等癥狀。正常組大鼠行為學未見異常表現(xiàn)。上述現(xiàn)象說明造模成功。實驗過程中，各組大鼠無死亡。

2.2 給藥實驗第15天（即霧化激發(fā)第1天）起，于每日上午8∶00至10∶00對各組大鼠分別灌胃給予相應藥物或生理鹽水。平喘湯臨床常用生藥量為117 g，以70 kg人和200 g大鼠按體表面積折算的等效劑量系數(shù)進行換算[13]，得出平喘湯用于大鼠的成人等效劑量為10.6 g/kg。平喘湯低、中、高劑量組給藥劑量分別為5.3 g/kg、10.6 g/kg、21.2 g/kg（以生藥量計），地塞米松組給藥劑量為0.001 g/kg，模型組和正常組分別予等體積生理鹽水，各組大鼠均每日灌胃1次，連續(xù)3周。

2.3 標本采集末次霧化后24 h，各組分別取3只大鼠予腹腔麻醉，消毒后固定在手術板上，開胸充分暴露氣管，注射4 mL生理鹽水，輕輕按摩胸部30～60 s后，緩慢回抽支氣管肺泡灌洗液（BALF），再次灌注3 mL生理鹽水后回抽，將2次回收的BALF混合均勻，離心半徑10 cm、3000 r/min離心5 min，取上清液，用于檢測TGF-β1含量。取各組剩余的3只大鼠處死，取右肺組織置于4%多聚甲醛中浸泡固定，用于肺組織和氣道的病理學觀察和免疫組化染色法觀察肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達；取左肺組織用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗、吸干水分后置于-80 ℃冰箱凍存，用于蛋白免疫印跡法（Western blot法）檢測肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達。

2.4 指標檢測

2.4.1 ELISA法檢測BALF中TGF-β1含量取各組3只大鼠BALF，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠BALF中TGF-β1含量。

2.4.2 蘇木素-伊紅（HE）和Masson染色觀察大鼠肺組織形態(tài)學表現(xiàn)取各組3只大鼠右肺組織，脫水，石蠟包埋，切片（厚4 μm），分別進行HE和Masson染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察。HE染色后觀察肺組織病理形態(tài)，Masson染色后觀察氣道膠原纖維病理形態(tài)。

2.4.3 免疫組化染色法檢測肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達取各組大鼠右肺組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，抗原修復，蒸餾水洗5 min，放入3%甲醇過氧化氫10 min（室溫），蒸餾水洗5 min，PBS浸泡1 min，滴加一抗（TGF-β1、Smad2和Smad3，稀釋比例分別為1∶60、1∶80、1∶80），4 ℃孵育過夜。第2天取出恢復至室溫，用PBS緩沖液洗3次，每次5 min，滴加二抗（HRP標記的山羊抗兔IgG，1∶1000），37 ℃孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min。隨后用DAB顯色、蘇木素復染、分化、反藍，最后脫水、透明、封片。顯微鏡觀察，采集圖像。

2.4.4 Western blot法 檢 測 大 鼠 肺 組 織TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達取各組3只大鼠左肺組織，在液氮環(huán)境下研磨成粉末，加入裂解液置于冰上裂解30 min后，于4 ℃、離心半徑10 cm、12 000 r/min離心5 min，取部分上清，按照BCA試劑盒的說明書測定總蛋白濃度。其余上清加入5×loading buffer，沸水中煮10 min，完成上樣、電泳、轉膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h。添加配置好的一抗（TGF-β1、Smad2和Smad3，稀釋 比 例 均 為1∶1000），4 ℃過夜，第2天用TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶1000），室溫孵育1 h，再用TBST洗 膜3次，每次10 min，等體積混合化學發(fā)光試劑A液和B液檢測蛋白條帶，使 用Image Pro Plus 6.0軟件對各組目的蛋白的光密度值進行分析。

2.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。本研究所有計量資料均符合正態(tài)分布，以（x-±s）表示，采用獨立樣本 t 檢驗進行兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠BALF中TGF-β1含量比較與正常組比較，模型組大鼠BALF中TGF-β1含量顯著增加（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組TGF-β1含量均顯著降低（P＜0.001）；地塞米松組和平喘湯高劑量組TGF-β1含量顯著低于平喘湯中、低劑量組（P＜0.001），平喘湯中劑量組顯著低于低劑量組（P＜0.001），而地塞米松組和平喘湯高劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠BALF中TGF-β1含量比較（±s）

表1 各組大鼠BALF中TGF-β1含量比較（±s）

注： 與正常組比較，***P＜0.001；與模型組比較，###P＜0.001；與地塞米松組比較，△△△P＜0.001；與平喘湯高劑量組比較，▲▲▲P＜0.001；與平喘湯中劑量組比較，☆☆☆P＜0.001。

3.2 各組大鼠肺組織形態(tài)學比較正常組大鼠肺組織結構規(guī)則，氣道管壁薄，有少量炎性細胞浸潤。模型組大鼠肺組織氣道管壁增厚，黏膜皺襞增生，黏膜下明顯充血、水腫，周圍有大量炎性細胞浸潤。與模型組比較，各給藥組大鼠肺組織損傷、炎性細胞浸潤情況均有不同程度的減輕，其中地塞米松組和平喘湯高劑量組改善最明顯，炎性細胞浸潤減少，黏膜下輕度水腫，管壁增厚較輕，平喘湯中劑量組次之。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)學表現(xiàn)（HE，×200）

3.3 各組大鼠氣道膠原纖維形態(tài)學比較Masson染色后大鼠氣道上皮下膠原纖維呈藍色，肌纖維、纖維素呈紅色。與正常組比較，模型組膠原纖維廣泛沉積；與模型組比較，各給藥組膠原纖維沉積均有不同程度改善，其中地塞米松組、平喘湯高劑量組改善效果最佳。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織氣道膠原纖維形態(tài)學表現(xiàn)（Masson，×200）

3.4 免疫組化染色法觀察各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達經(jīng)免疫組化染色，各組大鼠氣道黏膜上皮細胞、平滑肌和部分肺泡上皮均顯示棕黃色TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達顆粒。與正常組比較，模型組大鼠肺組織棕黃色顆粒顯著增多；與模型組比較，各給藥組大鼠肺組織棕黃色顆粒有不同程度的減少，平喘湯不同劑量呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。見圖3、圖4、圖5。

圖3 各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達（免疫組化染色，×200）

圖4 各組大鼠肺組織Smad2蛋白表達（免疫組化染色，×200）

圖5 各組大鼠肺組織Smad3蛋白表達（免疫組化染色，×200）

3.5 Western blot法檢測各組大 鼠 肺 組 織TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達與正常組比較，模型組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，平喘湯高、中劑量組以及地塞米松組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；地塞米松組大鼠上述蛋白表達顯著低于平喘湯各劑 量 組（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；平喘湯高、中、低劑量對大鼠上述蛋白表達的改善作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。見圖6、表2。

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達比較（±s）

注： 與正常組比較，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；與地塞米松組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001；與平喘湯高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；與平喘湯中劑量組比較，☆P＜0.05，☆☆☆P＜0.001。

圖6 各組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達

4 討論

哮喘是一種常見的慢性肺部疾病，常伴有反復發(fā)作的胸悶、喘息、咳嗽、氣急等癥狀，其發(fā)病機制復雜，氣道重塑是其主要病理改變之一。哮喘的氣道重塑由氣道壁的多種結構變化組成，包括上皮損傷、上皮下纖維化、肌成纖維細胞增生、平滑肌纖維增加和血管增生等[14-15]，造成管腔狹窄。而支氣管管腔狹窄程度與不可逆氣流阻塞及肺功能損害程度密切相關，影響哮喘患者的預后和恢復。因此，如何有效控制哮喘的氣道重塑成為近年來的研究熱點。

哮喘可歸屬于中醫(yī)學“哮病”“喘證”等范疇，“喘有夙根，遇寒即發(fā)，或遇勞即發(fā)者，亦名哮喘”（《景岳全書·喘促》）?！百砀奔捶蝺?nèi)的“伏痰”，是哮喘發(fā)病的主要病理因素。本病的基本病機可歸納為痰濁內(nèi)停，外邪引動伏痰，痰阻氣道，氣機失調，故應以化痰平喘為治則。平喘湯方中麻黃主入肺經(jīng)，可開皮毛之郁閉；苦杏仁味苦降瀉，肅降兼宣發(fā)肺氣。兩藥相配，升降相因而平喘。紫蘇子、萊菔子、白芥子均為治痰之藥，化痰降氣而平喘。葶藶子專泄肺中水飲及痰火而平喘；枳殼聯(lián)合桔梗主治痰滯胸痞。古人云“久病入絡”“久病必瘀”，瘀阻肺絡亦為哮喘的重要致病因素，故加入地龍、僵蠶以祛風解痙、化痰逐瘀。酌加五味子斂肺止咳、納氣平喘。全方具有宣肺化痰、止咳平喘、祛風逐瘀的功效。

本實驗采用OVA和氫氧化鋁復制哮喘大鼠模型，結果顯示造模大鼠出現(xiàn)明顯的嗆咳、氣急等哮喘癥狀，模型組大鼠肺組織炎性細胞浸潤明顯，膠原纖維廣泛沉積，說明造模成功。本研究結果表明，平喘湯和地塞米松均可減輕哮喘模型大鼠肺組織炎性細胞浸潤，抑制膠原沉積，其中平喘湯高劑量和地塞米松效果最為明顯。

TGF-β1是公認的致纖維化因子[16]，參與氣道的多種病理生理過程，包括肺泡化、氣道上皮和內(nèi)皮屏障功能、免疫細胞趨化、細胞凋亡以及細胞分化和增殖等，這些生物學過程與支氣管哮喘的發(fā)病機制有關。OJIAKU C A等[17]研究證實，TGF-β1可通過活化成纖維細胞，促進氣道平滑肌增殖和細胞外基質沉積，最終導致氣道結構改變。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在哮喘患者的支氣管肺泡灌洗液和支氣管標本中過量產(chǎn)生[18]，此外，TGF-β1基因表達水平與哮喘的嚴重程度相關[19]。本研究結果表明，模型組大鼠BALF中TGF-β1含量明顯高于正常組，各給藥組大鼠BALF中TGF-β1含量均較模型組顯著下降，提示平喘湯和地塞米松可以抑制TGF-β1的表達，同時本研究發(fā)現(xiàn)平喘湯對哮喘模型大鼠BALF中TGF-β1含量的降低作用表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

TGF-β1誘導支氣管哮喘結構改變的機制包括TGF-β1/Smad通路和TGF-β1誘導的上皮間質轉化。本實驗主要觀察TGF-β1/Smad通路在氣道重塑中的作用。Smad是位于TGF-β1下游的蛋白，介導細胞內(nèi)信號轉導[20]，其中Smad2、Smad3可接收并在磷酸化后將信號從細胞膜傳遞到細胞核，調節(jié)靶基因的轉錄。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組哮喘大鼠肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達水平明顯上升，提示TGF-β1、Smad2及Smad3的過度表達。地塞米松組和平喘湯高、中劑量組大鼠肺組織TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達水平均較模型組顯著下降，表明平喘湯和地塞米松可通過調節(jié)哮喘模型大鼠肺組織中TGF-β1、Smad2及Smad3蛋白表達水平發(fā)揮治療作用，同時本研究發(fā)現(xiàn)平喘湯對哮喘模型大鼠肺組織上述蛋白表達的降低作用表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。平喘湯中苦杏仁苷可通過下調TGF-β/Smad通路中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達水平來減少膠原蛋白和纖維的形成[21]，地龍則可能通過蚓激酶的活化纖溶酶和降解纖維蛋白的作用而對氣道重構的TGF-β1/Smads信號途徑產(chǎn)生干擾[22]。

綜上所述，本研究通過建立哮喘大鼠模型，并給予平喘湯治療，發(fā)現(xiàn)平喘湯可以減輕哮喘模型大鼠肺組織炎性反應及氣道重塑，其機制與調控TGF-β1/Smad信號通路有關，且其調控作用表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。中藥復方具有多成分、多靶點的作用特點，課題組后續(xù)將進一步研究平喘湯的有效成分，以及是否存在對其他信號通路的調節(jié)作用，深入探討平喘湯治療哮喘的作用機制。