胡椒PnCAD基因的克隆和表達(dá)分析

孫也喬，王 玨，胡麗松，伍寶朵，郝朝運(yùn),5，范 睿,5*

胡椒基因的克隆和表達(dá)分析

孫也喬1,2,3，王 玨1,2,3，胡麗松2,3，伍寶朵2,4，郝朝運(yùn)2,4,5，范 睿2,4,5*

1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南?？?570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南萬寧 571533；3. 海南省遺傳育種與種質(zhì)資源重點實驗室，海南萬寧 571533；4. 海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點實驗室，海南萬寧 571533；5. 海南省Sim Soonliang院士工作站，海南萬寧 571533

木質(zhì)素在植物體中具有運(yùn)輸水分、支撐植株和加強(qiáng)植物體免受侵害等功能，是苯丙烷代謝途徑的重要產(chǎn)物之一。其中肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）是該途徑中重要的限速酶。本研究在胡椒轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，用RACE法進(jìn)行克隆，對基因全長進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對其蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位和系統(tǒng)進(jìn)化樹等分析；最后運(yùn)用實時熒光定量PCR進(jìn)行分析。結(jié)果表明：克隆得到基因的全長cDNA，長度為1364 bp，開放閱讀框（open reading frame，ORF）為1071 bp，編碼356個氨基酸，預(yù)測相對分子量為3.879 kDa，等電點為6.27，屬于親水性蛋白；含有3個N-糖基化特征序列和9個磷酸化位點，可能處于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，胡椒CAD蛋白含有NAD(P)結(jié)合位點、多個催化鋅和結(jié)構(gòu)鋅結(jié)合位點。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，胡椒CAD與細(xì)辛CAD6親緣關(guān)系最近，胡椒和細(xì)辛的同源性最高為76%，均隸屬于比較原始的雙子葉植物。通過熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，黃花胡椒在辣椒疫霉菌侵染下表達(dá)量升高，在8 h達(dá)到最高值，約為對照的10倍；之后在24 h時出現(xiàn)小幅度升高，約為對照組的6倍，之后下降?！疅嵋?號’胡椒的表達(dá)量在侵染8 h時達(dá)到最低，之后緩慢上升?？傮w來說，所有時間下黃花胡椒基因表達(dá)量均高于‘熱引1號’胡椒，且差異顯著。本研究結(jié)果可為今后研究胡椒抗非生物脅迫功能提供參考，為基因的功能研究提供理論依據(jù)。

胡椒；；基因克??；生物信息學(xué)分析；熒光定量PCR

胡椒（L.）是海南省重點支持和發(fā)展的熱帶特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)之一，更是海南省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)收入的重要來源。此外，海南作為中國最大的胡椒生產(chǎn)區(qū)，占據(jù)全國胡椒生產(chǎn)總量的90%以上[1]。胡椒在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和食品工業(yè)用途廣泛[2]。胡椒具有4000多年歷史，主要種植在熱帶和亞熱帶，全球種植面積達(dá)到60萬hm2。中國是世界第五大胡椒生產(chǎn)國，截至目前中國胡椒種植面積約為2.6萬hm2?，F(xiàn)在的主栽品種‘熱引1號’胡椒是由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所選育并推廣種植，面積占全國90%以上，但由于其極易感染胡椒瘟病，很大程度上限制了胡椒產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展[3]。

木質(zhì)素在植物體中具有運(yùn)輸水分、支撐植株和加強(qiáng)植物體免受侵害等功能[4-7]，其生物合成是在多種酶的參與下完成的，是苯丙烷代謝途徑的重要產(chǎn)物之一[8]。木質(zhì)素的生物合成過程可總結(jié)為苯丙氨酸或酪氨酸在一系列酶的催化下，逐步轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素單體，最終聚合成木質(zhì)素的過程[9]。肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD）是木質(zhì)素合成過程中的重要限速酶，也是單體合成下游途徑中的重要還原酶，對S型、G型和H型木質(zhì)素的合成具有一定的作用[4, 10]。肉桂醇脫氫酶屬于中鏈脫氫酶/還原酶家族，在NADPH的作用下可將肉桂醛還原為肉桂醇，是植物細(xì)胞壁單信號代謝途徑的最后一步。前人通過正、反義表達(dá)和突變體實驗研究表明，植物基因可調(diào)整木質(zhì)素的總量及單體的比例[11]。隋娟娟等[12]對香椿葉片進(jìn)行高溫、低溫、干旱、鹽脅迫后，發(fā)現(xiàn)在非生物脅迫下基因表達(dá)量與葉片木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)；與野生型相比，在擬南芥反義表達(dá)基因植株的木質(zhì)素總量大大降低，并出現(xiàn)倒伏現(xiàn)象[13]；張穎俊[14]研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下油菜基因表達(dá)水平與莖稈和根系中的木質(zhì)素含量均呈顯著正相關(guān)；擬南芥和基因同時突變后，木質(zhì)素含量下降94%[15]?？梢姡蛟谀举|(zhì)素生物合成過程中發(fā)揮著重要調(diào)控功能。目前，國內(nèi)外已對多種植物的基因成員進(jìn)行鑒定，如陸地棉、亞麻、小麥、洋草麥和榅桲等[16-20]，但關(guān)于胡椒基因的研究尚未全面開展。胡椒全基因組測序已完成，在此基礎(chǔ)上，本研究中采用RACE方法從葉片上克隆得到1個基因，同時對該基因的生物信息學(xué)進(jìn)行分析。采用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測基因在辣椒疫霉菌侵染及不同時間下葉片的相對表達(dá)量，為深入研究在胡椒生長發(fā)育及抗瘟病的作用機(jī)制提供理論參考，對提高胡椒產(chǎn)量和抗性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為‘熱引1號’胡椒葉片樣本和黃花胡椒葉片樣本，均采集于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部萬寧胡椒種質(zhì)資源圃。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成 總RNA提取參照李國澤等[21]的改良Trizol法。cDNA第一鏈的合成使用 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）。

1.2.2基因克隆 利用已發(fā)表的胡椒轉(zhuǎn)錄組序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計引物B497F2和B497R1（F：5?-CAGTAATGAGAATTGT CT-3?；R：5?-TCACTTCAATGATTTCTC-3′）。參照伍寶朵等[22]的PCR擴(kuò)增程序和體系，PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的片段，將其連接至pMD18- T后轉(zhuǎn)化，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 RACE實驗 參照羅聰?shù)萚23]和王繼雪等[24]的方法，引物序列見表1。

表1 引物名稱及序列

1.2.4 胡椒的基因和PnCAD蛋白的生物信息學(xué)分析 利用NCBI的ORF Finder程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析基因的開放閱讀框及編碼的氨基酸序列；利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析PnCAD蛋白的蛋白序列；利用在線軟件ExPASy ProtScale（https://web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測該蛋白質(zhì)的分子量、等電點和親水性及疏水性；利用SWISS-MODEL軟件（http://swissmodel. expasy.org/）預(yù)測PnCAD蛋白的三級結(jié)構(gòu)；利用NCBI的BLAST程序（https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源性比對分析；利用在線軟件SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測分析該基因氨基酸序列功能結(jié)構(gòu)域；利用DNAman進(jìn)行同源序列比對分析；利用MEGA 7.0軟件鄰接（neighbor joining, NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[25-27]。

1.2.5 實時熒光定量PCR 以感病種質(zhì)‘熱引1號’胡椒和抗病種質(zhì)黃花胡椒為材料開展病原菌接種，方法及采樣時間參考張葉等[28]的研究，采用Trizol法提取‘熱引1號’胡椒和黃花胡椒葉片總RNA，并利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qPCR檢測。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，55℃退火20 s，進(jìn)行40個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。以PUB1為內(nèi)參[29]，采用2–ΔΔCT法計算基因的相對表達(dá)量[30]，采用Origin 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡椒CAD基因的RACE克隆

以胡椒葉片cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到單一條帶，長度約為1063 bp（圖1）。對cDNA的5￠端和3￠端進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物均僅有1條特異性擴(kuò)增條帶（圖1A、圖1B）。測序結(jié)果表明，5￠-RACE和3￠-RACE產(chǎn)物大小分別為178、315 bp，拼接后獲得全長cDNA序列1364 bp，命名為。氨基酸和核苷酸序列對比，該基因有1個1071 bp的完整開放閱讀框，編碼356個氨基酸，起始密碼子和終止密碼子分別為ATG和TGA（圖2）。

M：DL2000 marker；1：PCR產(chǎn)物；A：5′-RACE 產(chǎn)物；B：3′-RACE 產(chǎn)物。

2.2 胡椒PnCAD蛋白生物信息學(xué)分析

PnCAD蛋白相對分子量為38.79 kDa，pI為6.27，分子式為C1720H2702N458O514S24，原子總數(shù)為5418，脂肪指數(shù)為82.92，共有35個氨基酸殘基（Arg+Lys）帶正電荷和39個氨基酸殘基（Asp+Glu）帶負(fù)電荷，預(yù)測其不穩(wěn)定指數(shù)（II）為29.97，可將此蛋白質(zhì)定位為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。親水性總平均值（grand average of hydropathiciy, GRAVY）為?0.062，表明PnCAD為親水性蛋白。預(yù)測該蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，編碼區(qū)蛋白定位到細(xì)胞質(zhì)中，編碼區(qū)蛋白不含有信號肽（圖3）。對基因的氨基酸進(jìn)行糖基化位點分析，結(jié)果顯示有3個存在N-糖基化特征序列，且電勢均超過了閾值0.5，分別是82、208和244，可對這3個位點進(jìn)行后續(xù)研究[31]。磷酸化位點預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有9個磷酸化位點，8個絲氨酸磷酸化位點和1個蘇氨酸磷酸化位點。結(jié)果表明PnCAD蛋白共有9個潛在的翻譯后修飾（post-translation modification, PTM）。

黑色方框表示ATG起始密碼子；*表示終止密碼子；雙下劃線表示Poly(A)加尾信號；單下劃綫表示poly(A)序列；圓圈符號為可能的N糖基化位點。藍(lán)色方框區(qū)域為可能的PnCAD結(jié)構(gòu)域（access No cd05283）；藍(lán)色陰影區(qū)域表示可能的二聚體界面的結(jié)合位置，紅色陰影區(qū)域為NADP底物結(jié)合位點及催化鋅結(jié)合位點，綠色陰影區(qū)域為結(jié)構(gòu)鋅結(jié)合位點。

圖3 信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)分析

2.3 PnCAD蛋白保守結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)分析

用SMART在線軟件對PnCAD進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域[29]檢測，結(jié)果顯示PnCAD蛋白含有CAD1保守結(jié)構(gòu)域和1個NAD(P)結(jié)合位點，具有氧化還原酶活性，此外還含有催化鋅結(jié)合位點Cys48、His70、Cys165，結(jié)構(gòu)鋅結(jié)合位點Cys101、Cys104、Cys107、Cys115，二聚體界面Val114、Thr172、His177、Asn270～Val300、Dimer interface。推測NADP底物結(jié)合位點主要由Cys48、Ala50、His70、Thr96、Cys165、Thr301組成（圖4）。SWISS- MODEL構(gòu)建CDS區(qū)三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與MDR超家族的酶結(jié)構(gòu)很相似。CAD以同源二聚體的形式存在，存在2個鋅離子結(jié)合位點，同源二聚體ADs可結(jié)合4個鋅離子。其中催化鋅結(jié)合位點正好位于底物結(jié)合位點的正中心，該NADP底物結(jié)合位點主要由其他五部分組成，形成一個凹陷的空腔（圖5）[32]。

圖4 PnCAD蛋白保守區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 胡椒PnCAD蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

2.4 PnCAD蛋白序列的多重序列比對和進(jìn)化分析

利用NCBI Blastp對PnCAD蛋白序列進(jìn)行同源比對，結(jié)果見圖6，其與細(xì)辛的氨基酸序列相似性為76%，其CAD酶的CAD1結(jié)構(gòu)域都較為保守，特別是底物結(jié)合位點（紅色三角表示）位置的氨基酸殘基保守性非常高，相對來說二聚體結(jié)合面的同源性較低。利用MEGA 7.0構(gòu)建PnCAD和其他物種的CAD氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示胡椒PnCAD與細(xì)辛AsCAD6親緣關(guān)系最為接近，隸屬于比較原始的雙子葉植物。與其他雙子葉植物距離較遠(yuǎn)，與鳳梨、大米、小麥等單子葉植物聚類在同一個大分支上（圖7）。

2.5 PnCAD基因的表達(dá)分析

本研究以為內(nèi)參基因，以無菌水處理為對照，用病原菌處理8、12、24、48 h后進(jìn)行表達(dá)模式分析。在接水處理中，黃花胡椒的表達(dá)量和‘熱引1號’胡椒的基本相似；在病原菌接種8 h時，黃花胡椒的表達(dá)量是對照的10倍，隨后表達(dá)量降低同時高于對照組；在病原菌接種24 h時，表達(dá)量又增高，大約是對照的6倍，之后稍微降低?！疅嵋?號’胡椒在接種8 h時，其基因表達(dá)量最低，之后逐漸緩慢升高，但所有的接種組都比黃花胡椒含量低，且差異顯著（圖8）。

3 討論

本研究在轉(zhuǎn)錄組測序基礎(chǔ)上，通過RACE技術(shù)克隆胡椒基因，基因大小為1364 bp，編碼356個氨基酸殘基，蛋白質(zhì)理論分子量大小約為3.879 kDa，預(yù)測pI為6.27。PnCAD蛋白屬于親水性蛋白，其中包含9個磷酸化位點和3個N-糖基化特征序列；根據(jù)亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)上，且不含有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽位點，這與在水芹、臘梅中克隆到的基因結(jié)果相同[9, 33]。利用網(wǎng)站構(gòu)建基因的CDS區(qū)三級結(jié)構(gòu)，該蛋白的三級結(jié)構(gòu)與MDR超家族的酶結(jié)構(gòu)很相似；對PnCAD蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示PnCAD蛋白含有CAD1保守結(jié)構(gòu)域，屬于MDR超家族；分析后發(fā)現(xiàn)胡椒CAD蛋白含有1個NAD(P)結(jié)合位點、多個催化鋅和結(jié)構(gòu)鋅結(jié)合位點具有高度保守性。郝麗芬等[19]克隆洋草麥肉桂醇脫氫酶基因的CDS序列，含有多個催化鋅結(jié)合位點和底物鋅結(jié)合位點，也具有典型的CAD1結(jié)構(gòu)域，與本研究結(jié)果基本一致。車玉紅等[20]對榅桲果肉組織中基因的編碼區(qū)全序列進(jìn)行測序和表達(dá)分析，結(jié)果顯示，在果實發(fā)育早期，木質(zhì)素合成快，基因表達(dá)量高，隨著木質(zhì)素合成速度趨緩，基因的表達(dá)量逐漸降低。表明基因表達(dá)量與木質(zhì)素合成呈正相關(guān)，與本研究結(jié)果基本一致。

圖6 胡椒PnCAD蛋白的氨基酸序列與其他植物CAD的同源性比較

圖7 胡椒PnCAD蛋白的進(jìn)化樹分析

圖8 PnCAD基因表達(dá)結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)胡椒和細(xì)辛的同源性最高達(dá)到76%，同隸屬于比較原始的雙子葉植物，其CAD酶的CAD1結(jié)構(gòu)域均較保守，特別是底物結(jié)合位點位置的氨基酸殘基的保守性非常高；在辣椒疫霉菌侵染下，胡椒基因的表達(dá)量出現(xiàn)升高，在8 h達(dá)到最高值，分析可能是由于病原菌的侵染調(diào)節(jié)了基因的表達(dá)，使PnCAD蛋白維持在相應(yīng)的水平，說明基因參與調(diào)控胡椒瘟病的抗性。另外，胡椒不同抗性種質(zhì)受辣椒疫霉菌侵染后表達(dá)存在差異，接種后抗病種質(zhì)的表達(dá)量均高于感病種質(zhì)，表明基因的表達(dá)模式在不同抗性水平的胡椒種質(zhì)中也存在一定的差異。目前，對在植物中被病原體感染、輻射等外界刺激所激活而表達(dá)基因的研究很多。前人研究表明譚雅芹[34]用灰霉菌侵染野生型和轉(zhuǎn)化植株，得出超表達(dá)轉(zhuǎn)化株的菌絲形成率低于野生型植株，說明在灰霉菌脅迫下可能通過合成類木質(zhì)素參與防御反應(yīng)。劉賀娟[35]對甜瓜幼苗接種枯萎病菌后，植株根、莖、葉中的木質(zhì)素含量、PAL、CAD等酶活性均有不同程度的升高；除莖外根系和葉片中均有誘導(dǎo)的基因家族成員，甜瓜響應(yīng)病菌侵染，這與本研究一致。上述研究結(jié)果表明，在病原菌侵染下，基因均能通過提高表達(dá)來改變植物體內(nèi)木質(zhì)素的合成，是較為理想的目標(biāo)基因。本研究為今后研究胡椒抗非生物脅迫功能提供參考，為的功能研究提供理論依據(jù)。

[1] 張 軍. 海南農(nóng)墾胡椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展情況[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè), 2021(2): 24-27.

ZHANG J. The development of pepper industry in Hainan state farm[J]. Journal of Chinese Tropical Agriculture, 2021(2): 24-27. (in Chinese)

[2] 郝朝運(yùn), 胡麗松, 范 睿, 譚樂和, 伍寶朵, 楊建峰. 中國特有藥用植物黃花胡椒種子萌發(fā)特性研究[J]. 熱帶作物學(xué)報, 2017, 38(11): 2071-2075.

HAO C Y, HU L S, FAN R, TAN L H, WU B D, YANG J F. Seed germination characteristics of, an endemic medical plant to China[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2017, 38(11): 2071-2075. (in Chinese)

[3] 胡麗松, 范 睿, 伍寶朵, 黃大雄, 李志剛, 郝朝運(yùn). 砧木狀態(tài)和嫁接時間對胡椒種間嫁接成活率的影響分析[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 38(2): 11-15.

HU L S, FAN R, WU B D, HUANG D X, LI Z G, HAO C Y. The effect of rootstock and grafting time on the survival rate of interspecific grafting of black pepper[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture, 2018, 38(2): 11-15. (in Chinese)

[4] SATTLER S E, SAATHOFF A J, HAAS E J, PALMER N A, FUNNELL-HARRIS D L, SARATH G, PEDERSEN J F. A nonsense mutation in a cinnamyl alcohol dehydrogenase gene is responsible for the sorghumphenotype[J]. Plant Physiology, 2009, 150(2): 584-595.

[5] LEE D, MEYER K, CHAPPLE C, DOUGLAS C J. Antisense suppression of 4-coumarate:coenzyme A ligase activity inleads to altered lignin subunit composition[J]. The Plant Cell, 1997, 9(11): 1985-1998.

[6] BOERJAN W, RALPH J, BAUCHER M. Lignin biosynthesis[J]. Annual Review of Plant Biology, 2003, 54(1): 519-546.

[7] SAATHOFF A J, HARGROVE M S, HAAS E J, AARON J, TOBIAS C M, TWIGG P, SATTLER S, SARATH G. Switchgrass pviCAD1: understanding residues important for substrate preferences and activity[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 168(5): 1086-1100.

[8] 曹佳強(qiáng), 李 波, 楊 洋, 胡文冉, 王玉晶, 范 玲. 木質(zhì)素生物合成中肉桂醇脫氫酶基因(CAD)的研究進(jìn)展[J]. 分子植物育種, 2014, 12(5): 1034-1043.

CAO J Q, LI B, YANG Y, HU W R, WANG Y J, FAN L. Advanced progress in the cinnamyl alcohol dehydrogenase gene involved in lignin biosynthesis[J]. Molecular Plant Breeding, 2014, 12(5): 1034-1043. (in Chinese)

[9] 仇 亮, 朱勝琪, 王永鑫, 馮 凱, 劉潔霞, 熊愛生. 水芹肉桂醇脫氫酶基因的克隆與表達(dá)特性分析[J]. 西北植物學(xué)報, 2018, 38(6): 1003-1009.

QIU L, ZHU S Q, WANG Y X, FENG K, LIU J X, XIONG A S. Cloning and expression characteristics analysis ofgene in[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2018, 38(6): 1003-1009. (in Chinese)

[10] MANSELL R L, GROSS G G, STOCKIGT J, FRANKE H, ZENK M H. Purification and properties of cinnamyl alcohol dehydrogenase from higher plants involved in lignin biosynthesis[J]. Phytochemistry, 1974, 13(11): 2427-2435.

[11] 盧雯瑩, 崔賀云, 高 杉, 崔順梅, 吳營照. 肉桂醇脫氫酶基因研究進(jìn)展及其在小麥抗倒伏中的應(yīng)用[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2020, 26(10): 7-10.

LU W Y, CUI H Y, GAO S, CUI S M, WU Y Z. Research progress of cinnamyl alcohol dehydrogenase gene and its application in lodging resistance in wheat[J]. Tianjin Agricultural Sciences, 2020, 26(10): 7-10. (in Chinese)

[12] 隋娟娟, 鄧紅祥, 楊京霞, 孫晶晶, 屈長青. 香椿基因的克隆與非生物脅迫下的表達(dá)特性[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2019, 38(10): 4617-4625.

SUI J J, DENG H X, YANG J X, SUN J J, QU C Q. Cloning and expression characteristics ofgene under abiotic stress condition in[J]. Genomics and Applied Biology, 2019, 38(10): 4617-4625. (in Chinese)

[13] JOURDES M, CARDENAS C L, LASKAR D D, MOINUDDIN S G A, DAVIN L B, LEWIS N G. Plant cell walls are enfeebled when attempting to preserve native lignin configuration with poly--hydroxycinnamaldehydes: evoluti-o-nary implications[J]. Phytochemistry, 2007, 68(14): 1932-1956.

[14] 張穎俊. 干旱脅迫下油菜木質(zhì)素含量及其關(guān)鍵基因表達(dá)的時空動態(tài)變化[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2015.

ZHANG Y J. Temporal and spatial dynamic changes of the lignin content and the expression of key genes ofunder drought stress[D]. Chongqing: Southwest University, 2015. (in Chinese)

[15] YOUN B, CAMACHO R, MOINUDDIN S G A, LEE C, DAVIN L B, LEWIS N G, KANG C. Crystal structures and catalytic mechanism of the arabidopsis cinnamyl alcohol dehydrogenasesand[J]. Organic & Biomolecular Chemistry, 2006, 4(9): 1687.

[16] 張經(jīng)博, 李 波, 楊 洋, 胡文冉, 陳方圓, 謝麗霞, 范 玲. 陸地棉CAD基因家族的進(jìn)化和表達(dá)分析[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 53(7): 1177-1187.

ZHANG J B, LI B, YANG Y, HU W R, CHEN F Y, XIE L X, FAN L. Evolution and expression analysis of upland cotton CAD gene family[J]. Xinjiang Agricultural Sciences, 2016, 53(7): 1177-1187. (in Chinese)

[17] 黃海燕, 王玉富, 薛召東, 邱財生, 郝冬梅. 亞麻基因克隆及序列分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008(5): 496-498.

HUANG H Y, WANG Y F, XUE Z D, QIU C S, HAO D M. Clone of partial sequence of cinnamyl alcohol dehydrogenase gene in flax[J]. Hubei Agricultural Sciences, 2008(5): 496-498. (in Chinese)

[18] MA Q H. Functional analysis of a cinnamyl alcohol dehydrogenase involved in lignin biosynthesis in wheat[J]. Journal of Experimental Botany, 2010, 61(10): 2735-2744.

[19] 郝麗芬, 房永雨, 孫 林, 趙俊利, 史志丹, 詹鶴年, 丁海君. 洋草麥基因的克隆與生物信息學(xué)分析[J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2021, 42(3): 7-13.

HAO L F, FANG Y Y, SUN L, ZHAO J L, SHI Z D, ZHAN H N, DING H J. Cloning and bioinformatic analysis ofgene in[J]. Animal Husbandry and Feed Science, 2021, 42(3): 7-13. (in Chinese)

[20] 車玉紅, 楊 波, 郭春苗, 木巴熱克·阿尤普, 吳津蓉, 杜 鵑. 榅桲果實基因的克隆、序列分析及表達(dá)[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2020, 57(5): 814-821.

CHE Y H, YANG B, GUO C M, MUBAREKE A Y P, WU J R, DU J. Cloning, sequence analysis and expression ofgene of quince fruit[J]. Xinjiang Agricultural Sciences, 2020, 57(5): 814-821. (in Chinese)

[21] 李國澤, 邵亞林, 常 瑋, 丁 勇. 3種兜蘭屬植物葉片總RNA提取方法的研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2021, 34(4): 827-833.

LI G Z, SHAO Y L, CHANG W, DING Y. Methods of total RNA extraction from leaves of threespecies[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2021, 34(4): 827-833. (in Chinese)

[22] 伍寶朵, 胡麗松, 范 睿, 楊建峰, 郝朝運(yùn). 胡椒基因克隆與表達(dá)分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2018, 31(10): 2010-2015.

WU B D, HU L S, FAN R, YANG J F, HAO C Y. Cloning and expression analysis ofinL.[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2018, 31(10): 2010-2015. (in Chinese)

[23] 羅 聰, 何新華, 陳 虎, 韋泳麗, 李明娟. 一種高效獲取基因5′末端的RACE方法[J]. 植物生理學(xué)報, 2011, 47(4): 409-414.

LUO C, HE X H, CHEN H, WEI Y L, LI M J. A high-efficient method of RACE technique for obtaining the gene 5end[J]. Plant Physiology Journal, 2011, 47(4): 409- 414. (in Chinese)

[24] 王繼雪, 孫延鳴. RACE法克隆巴什拜羊SP-A基因及序列分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2018, 31(10): 2196-2201.

WANG J X, SUN Y M. RACE cloning and sequential analysis of pulmonary surfactant-associated protein A in bashibay sheep[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2018, 31(10): 2196-2201. (in Chinese)

[25] FELSENSTEIN J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap[J]. Evolution, 1985, 39(4): 783-791.

[26] ZUCKERKANDL E. Evolutionary divergence and converg-ence in proteins[J]. Evolving Genes & Proteins, 1965: 97-166.

[27] KUMAR S, STECHER G, TAMURA K. MEGA7: molecul-ar evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datas-ets[J]. Molecular Biology and Evolution, 2016(7): 1870.

[28] 張 葉, 邢躍先, 王梓鈺, 聞 競, 郝東云, 李世界. 張 艷. 玉米鐮孢穗腐病菌接種方法的研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2021, 46(3): 64-69.

ZHANG Y, XING Y X, WANG Z Y, WEN J, HAO D Y, LI S J, ZHANG Y. Study on inoculation methods of ear rot caused byandin maize[J]. Journal of Northeast Agricultural Sciences, 2021, 46(3): 64-69. (in Chinese)

[29] 胡麗松, 范 睿, 伍寶朵, 吳 剛, 譚樂和, 郝朝運(yùn). 胡椒實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選[J]. 熱帶作物學(xué)報, 2017, 38(10): 1901-1906.

HU L S, FAN R, WU B D, WU G, TAN L H, HAO C Y. The identification of internal control genes for real-time PCR normalization in black pepper[J]. Chinese Journal of Tropic-al Crops, 2017, 38(10): 1901-1906. (in Chinese)

[30] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[31] 馬立娟, 佟文哲, 杜麗平, 崔馨予, 馬 清, 肖冬光. N-糖基化對黑曲霉AnLPMO15g與纖維素酶協(xié)同作用的影響[J]. 高校化學(xué)工程學(xué)報, 2019, 33(5): 1148-1155.

MA L J, TONG W Z, DU L P, CUI X Y, MA Q, XIAO D G. Effects of-glycosylation on synergism of AnLPMO15g fromand cellulase[J]. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities, 2019, 33(5): 1148-1155. (in Chinese)

[32] TAN C S, HASSAN M, HUSSEIN Z A M, ISMAIL I, HO K L, NG C L, ZAINAL Z. Structural and kinetic studies of a novel nerol dehydrogenase from, a nerol- specific enzyme for citral biosynthesis[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2017: 359-368.

[33] 李志菜. 蠟梅肉桂醇脫氫酶基因的克隆、表達(dá)特性分析及功能驗證[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2013.

LI Z C. Cloning, expression analysis and function identificat-i-on of cinnamyl alcohol dehydrogenase gene from(Linn.) Link[D]. Chongqing: Southwest University, 2013. (in Chinese)

[34] 譚雅芹. 灰霉菌脅迫下小立碗蘚肉桂醇脫氫酶1基因功能的初步研究[D]. 貴陽: 貴州師范大學(xué), 2018.

TAN Y Q. Preliminary study on the function of1 inunder the stress of[D]. Guiyang: Guizhou Normal University, 2018. (in Chinese)

[35] 劉賀娟. 病菌侵染對甜瓜木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性、基因表達(dá)及可能防御途徑的影響[D]. 沈陽: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

LIU H J. Effects of pathogenic bacterium on activities of lign-in-related enzymes and genes expressions ofand the possible defense pathway in oriental melon (var.Makino)[D]. Shenyang: Shenyang Agric-ultural University, 2016. (in Chinese)

Cloning and Bioinformatics Analysis of PepperGene by Race

SUN Yeqiao1,2,3, WANG Jue1,2,3, HU Lisong2,3, WU Baoduo2,4, HAO Chaoyun2,4,5, FAN Rui2,4,5*

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Institute of Spices and Beverages, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wanning, Hainan 571533, China; 3. Hainan Key Laboratory of Genetics, Breeding and Germplasm Resources, Wanning, Hainan 571533, China; 4. Hainan Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Control of Tropical Spice Beverage Crops, Wanning, Hainan 571533, China; 5. Hainan SIM Soonliang Academician Workstation, Wanning, Hainan 571533, China

Lignin has some functions in plants, such as transporting water, supporting plants and strengthening plants against damage, etc. It is one of the important products of phenylpropane metabolism.Among them, cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) is an important rate-limiting enzyme in the lignin synthesis pathway.In this experiment, on the basis of pepper transcriptome sequencing, the RACE method was used for gene cloning, bioinformatics analysis of the full-lengthgene, and many analyses of its protein such as physicochemical properties, subcellular localization and phylogenetic tree. It was analyzed by qPCR. The cinnamyl alcohol dehydrogenase gene was cloned by the race method. Finally, a full-length cDNA with a length of 1364 bp was obtained, including 1071 bp open reading frame (ORF), encoding 356 amino acids. The predicted relative molecular weight was 3.879 kDa and the isoelectric point was 6.27. It belonged to hydrophilic protein.It contained three N-glycosylation characteristic sequences and nine phosphorylation sites, which were likely to be in the cytoplasm. Domain analysis showed that CAD protein contained NAD (P) binding sites, multiple catalytic zinc and structural zinc binding sites. Phylogenetic tree analysis showed that pepper CAD was closely related toCAD 6, and the highest homology was 76%, both of which belonged to primitive dicotyledons. Through fluorescence quantitative analysis, it could be found that the expression ofunder the infection ofincreased, reached the highest value at 8 h, about 10 times that of the control, then increased slightly at 24 h, about 6 times that of the control group, and then decreased. Generally speaking, the gene expression level ofat all time was higher than that ofcv.and was significantly different. The experimental data could provide reference data for the future study of the anti abiotic stress function of black pepper, and also provide a theoretical basis for the functional study of gene.

;; gene cloning; bioinformatics analysis; qPCR

S961.6

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.12.004

2022-03-28；

2022-06-23

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項（No. 1630142020001）。

孫也喬（1998—），女，碩士研究生，研究方向：作物抗逆分子育種。*通信作者（Corresponding author）：范 睿（FAN Rui），E-mail：tlfr83@163.com。