Wee1在小鼠1-細胞期受精卵中的表達和定位

韓 迪，劉智慧，莊 妍，孟 峻(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床檢驗診斷學教研室，呼和浩特 00050；山西省中醫(yī)院檢驗科；內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科；通訊作者,E-mail:nmfrank@6.com)

真核生物的生長與繁殖依賴于細胞周期，一次細胞周期完成可以驅使細胞分裂產生兩個新的子細胞，典型的細胞周期包括G1、S、G2和M期[1]。在整個細胞周期進程中，不同時期細胞的結構、功能及其物質的含量、定位會發(fā)生一系列復雜的改變，從而產生相應的特點，尤其是在G2/M轉化的過程中，為適應不同的功能，細胞會產生明顯的特征改變。細胞發(fā)生G2/M轉變的最基本機制是細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase，Cdk1)的激活，細胞周期蛋白B1/CDK1的磷酸化控制細胞發(fā)生核膜破裂、紡錘體形成和染色質濃縮，這是G2期進入M期的關鍵步驟[2]。Cdk1激酶的活性受3個因素調控：第一，Cdk1激酶激活的前提是需要與它的細胞周期蛋白伴侶A或B結合形成一個完整的構型，即形成CyclinA/B-Cdk1，從而驅動細胞開始進入M期[3]。第二，細胞周期蛋白H與Cdk7共同介導的保守T環(huán)殘基磷酸化(例如人Cdk1中的Thr161)是激活Cdk1達到最大活性所必需的環(huán)節(jié)[4,5]。第三，CyclinB-Cdk1復合物受Cdc25磷酸酶的正向調節(jié)[6]，Cdc25C磷酸酶激活CyclinB-Cdk1對調節(jié)G2/M進程具有重要意義[7]，但在CyclinB-Cdk1復合物首次形成后，Wee1/PKMYT1激酶能夠通過磷酸化Cdk1的14位蘇氨酸和15位酪氨酸抑制該復合物的活性[6]。

Wee1最初是從裂殖酵母中提取出來的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶[8]。目前通過研究發(fā)現(xiàn)Wee1蛋白激酶家族有3個重要成員，即Wee1、PKMYT1和Wee2，其中Wee1被認為是G2檢查點激酶，PKMYT1激酶是膜相關酪氨酸和蘇氨酸特異性細胞分裂周期蛋白2(cell division control protein 2，Cdc2)抑制激酶，而Wee2是卵母細胞減數(shù)分裂抑制激酶[9]。目前關于Wee2的研究已經證實：Wee2主要參與調節(jié)生殖細胞(卵母細胞和精子)減數(shù)分裂的恢復[10]，并且增加Wee2的活性會阻滯1-細胞期受精卵的發(fā)育[11]。但Wee1作為Wee1蛋白激酶家族的重要成員，目前關于Wee1的研究，僅有文獻報道Wee1在非洲爪蟾成熟的卵母細胞至原腸胚胚胎階段均有表達，并且Wee1會導致G2期時間延長，延緩非洲爪蟾1-細胞期受精卵的分裂[12]。但在小鼠1-細胞期受精卵中Wee1 mRNA及其蛋白表達和定位的具體研究甚少。

研究細胞周期的進展有助于了解細胞的生長發(fā)育情況，在眾多的哺乳動物中，小鼠受精卵是研究細胞周期較好的模型之一。故本研究采用qRT-PCR、Western blot以及間接免疫熒光技術檢測小鼠1-細胞期受精卵中Wee1 mRNA和蛋白的表達水平，并觀察不同時期Wee1蛋白在細胞質和細胞核中的分布情況，探討小鼠受精卵從1-細胞期到分裂為2-細胞胚胎過程中是否伴隨Wee1的表達水平和定位改變，為之后進一步研究Wee1蛋白激酶對小鼠早期胚胎發(fā)育的調控提供理論基礎，進一步豐富哺乳動物早期胚胎有絲分裂分子調控機制研究的相關理論。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

采用內蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級昆明系小鼠【SYXK(蒙)2015-0001】，雌鼠：4～6周(體質量20 g左右/只)；雄鼠：8周以上(體質量>30 g/只)。

1.2 主要試劑

孕馬血清促性腺激素，獸藥字：110914564，購自寧波三生公司；人絨毛膜促性腺激素，獸藥字：101631282，購自蘇州素仕公司；UNIRT-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒、BCA法微量蛋白質濃度測定試劑盒均購自上海生工公司；TaKaRa反轉錄試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；TransStart Tip Green RTPCR SuperMix試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；SDS-PAGE Gel Kit購自上海碧云天公司；Wee1蛋白抗體(ab203236)、β-連環(huán)蛋白抗體(ab6276)、山羊抗兔IgG二抗均購自美國Abcam公司；Triton X-100購自飛凈生物科技有限公司；Hoechst33258熒光染料、BSA均購自美國Sigma公司。

1.3 小鼠受精卵的采集與培養(yǎng)

取4～6周體質量為20 g左右的雌性昆明系小鼠6～10只，中午12∶00-13∶00，腹腔注射孕馬血清促性腺激素10 IU/只。第2天中午12∶00-13∶00時腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)10 IU/只，并將注射HCG后的雌鼠與8周以上的雄鼠1 ∶1合籠過夜。次日清晨8∶00檢栓，處死有陰栓的雌鼠。剪開小鼠腹部，取出輸卵管，放入M2培養(yǎng)液清洗。在體視顯微鏡下撕開輸卵管壺腹部，用100 μl移液槍將自然流出的受精卵細胞團轉移到0.3%透明質酸酶溶液中，反復吹吸幾次，待去除卵丘細胞后，立即使用吸卵管將受精卵轉移到M2培養(yǎng)液中，用M2培養(yǎng)液清洗3～5次，去除殘留的透明質酸酶、卵丘細胞和其他雜質。將洗干凈的受精卵移入提前平衡好的M16培養(yǎng)液中，在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至相應時期以備后期實驗使用。HCG注射后11～13 h成熟的卵母細胞在輸卵管壺腹部完成受精并進入有絲分裂細胞周期，在注射HCG后19 h收集G1期受精卵，在注射HCG后23 h收集S期受精卵，在注射HCG后27 h收集G2期受精卵，在注射HCG后29 h收集M期受精卵[13]。

1.4 qRT-PCR檢測小鼠1-細胞期受精卵中Wee1 mRNA的表達水平

采用qRT-PCR分別檢測G1、S、G2、M期1-細胞期受精卵中Wee1 mRNA的表達水平。收集各期受精卵各100個分別放于4個1.5 ml EP管中，按照UNIRT-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒說明書的步驟提取總RNA，并分別測定其在260 nm和280 nm處的吸光度，OD260/OD280值在1.8～2.0之間可用于反轉錄實驗。用TaKaRa反轉錄試劑盒將提取的總RNA反轉錄成cDNA，引物由上海生工公司合成(見表1)，反應條件為：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，1個循環(huán)。用TransStart Tip Green RT-PCR SuperMix試劑盒擴增Wee1目的基因，反應條件為：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，45個循環(huán)；95 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，1個循環(huán)。用β-actin作為內參基因，使用CFX96熒光定量PCR儀檢測樣本Ct值，采用2-ΔΔCt計算Wee1 mRNA相對表達量。

表1 Wee1和β-actin引物序列Table 1 Wee1 and β-actin primer sequences

1.5 Western blot檢測小鼠1-細胞期受精卵G1、S、G2、M期Wee1蛋白的表達水平

為研究Wee1蛋白的表達水平伴隨小鼠1-細胞期受精卵發(fā)育不同時期的變化，采用Western blot檢測各時期Wee1蛋白的表達水平。取4個時期受精卵各200個分別放于4個1.5 ml EP管中，經3～4次凍融循環(huán)后，分別加入蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液(1 ∶100)充分裂解受精卵，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，上清為受精卵總蛋白。用BCA法測定各時期受精卵蛋白濃度。用10% SDS-PAGE分離蛋白質，并轉膜至0.45 μm硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別與0.5%脫脂奶粉稀釋的Wee1蛋白抗體(1 ∶1 000)和β-連環(huán)蛋白抗體(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，洗膜，與稀釋后的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶1 000)室溫避光孵育1 h，TBST溶液洗滌3次后掃膜，測定Wee1蛋白和內參β-actin蛋白的灰度值。用Image J軟件進行灰度值分析，以Wee1/β-actin表示Wee1蛋白的相對表達量。

1.6 間接免疫熒光觀察Wee1蛋白在小鼠1-細胞期受精卵發(fā)育各期的定位

利用間接免疫熒光技術觀察不同時期Wee1蛋白在細胞核和細胞質中的定位情況。分別收集G1，S，G2，M期受精卵各200個，用PBS(含1%聚乙烯醇)浸洗，之后用4%POM固定液室溫固定1 h，PBST清洗后用0.1% Triton X-100通透10 min，在含5%BSA的PBS中封閉40 min。將處理完的受精卵轉入封閉液稀釋的Wee1蛋白抗體(1 ∶1 000)中4 ℃孵育過夜，洗去一抗之后放入FITC標記的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶100)室溫避光孵育1 h，洗去二抗加入Hoechst33258熒光染料(濃度為25 μg/ml)染色10 min，分別在530 nm、488 nm、260 nm波長處激發(fā)標本，在激光共聚焦顯微鏡下觀察核酸的染色情況以及Wee1蛋白在小鼠1-細胞期受精卵發(fā)育的各個時期的定位情況。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 小鼠1-細胞期受精卵G1、S、G2、M期Wee1 mRNA的相對表達量及變化

Wee1 mRNA在小鼠1-細胞期受精卵發(fā)育過程的4個時期(G1、S、G2、M)均有不同程度的表達(見圖1)，相對表達量依次為1.107±0.004，1.343±0.007，1.597±0.008，1.177±0.006，可以明顯看出從G1至G2期Wee1 mRNA的表達量逐漸增加，在G2期Wee1 mRNA表達量達到最高，而當小鼠1-細胞期受精卵進入M期之后Wee1 mRNA表達量較G2期顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

與G2期比較，**P<0.01圖1 Wee1 mRNA在小鼠1-細胞期受精卵發(fā)育過程中相對表達量Figure 1 Relative expression of Wee1 mRNA in each stage of mouse one-cell stage zygote

2.2 小鼠1-細胞期受精卵G1、S、G2、M期Wee1蛋白的表達結果

小鼠1-細胞期受精卵的發(fā)育全程伴隨Wee1蛋白表達含量的變化。通過對Western blot結果進行灰度值分析發(fā)現(xiàn)：Wee1蛋白的表達量從G1期到G2期呈增加的趨勢，但當受精卵進入M期時Wee1蛋白表達量較G2期明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖2)。這與1-細胞期受精卵分裂過程中Wee1 mRNA表達水平的變化保持一致。

與G2期比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 小鼠1-細胞期受精卵發(fā)育各期Wee1蛋白表達水平Figure 2 The expression level of Wee1 protein in each stage of mouse one-cell stage zygote

2.3 Wee1蛋白在小鼠1-細胞期受精卵發(fā)育各期的定位變化

間接免疫熒光結果顯示：小鼠1-細胞期受精卵G2/M的轉換過程伴隨著Wee1蛋白的核漿穿梭。通過觀察從卵母細胞受精到受精卵完成第一次分裂之前各個時期的紅色熒光信號可以發(fā)現(xiàn)：在G1期和S期，Wee1蛋白定位于細胞質，而在G2早期可以看到部分Wee1蛋白開始入核，到M期細胞核內Wee1蛋白顯著增加(見圖3)。

藍色信號：DNA，紅色信號：Wee1圖3 Wee1在小鼠1-細胞期受精卵發(fā)育的不同時期的定位 (×400)Figure 3 The localization of Wee1 in different stages of mouse one-cell stage zygote (×400)

3 討論

在裂殖酵母中，Cdc2基因可以調節(jié)裂殖酵母細胞G1/S進展和G2/M轉變[14]。從酵母到人類，Cdc2是保守的，在哺乳動物中Cdc2同系物也能與細胞周期蛋白結合，后來這些與細胞周期蛋白相關的激酶被命名為“細胞周期蛋白依賴性激酶”或Cdk[15]。Cdk1激酶的激活是由其14位蘇氨酸和15位酪氨酸去磷酸化介導的，活化的Cdk1復合物可以驅動有絲分裂[16]。在細胞分裂間期，Wee1可以通過磷酸化Cdk1的15位酪氨酸來抑制Cdk1活性，從而阻止細胞進入有絲分裂，進而延緩細胞周期進程[17]。

已有研究證明：在粟酒裂殖酵母細胞的細胞周期進程中，Wee1以促細胞分裂因子(mitosis promoting factor, MPF)依賴的方式聚集在紡錘體極體(spindlepoleboby, SPB)的表面，并可以通過改變SPB亞細胞定位調節(jié)細胞進入有絲分裂[18]。目前有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠1-細胞期受精卵發(fā)育的過程中伴隨著Wee1B蛋白的核漿轉位[19]。但是尚不明確Wee1在哺乳動物細胞周期不同時期的表達含量是否存在變化，也不能確定Wee1蛋白激酶是否通過改變其亞細胞定位對哺乳動物細胞有絲分裂過程產生一定影響。

小鼠受精卵是研究哺乳動物細胞周期天然的細胞模型，研究早期胚胎發(fā)育的分子調控機制，有助于克服胚胎早期發(fā)育障礙，為不孕不育癥的治療提供新思路。探究小鼠受精卵發(fā)育過程中特定基因的表達和定位規(guī)律，可以應用于人類輔助生殖，通過對特定基因的干預，縮短受精卵在體外培育的時間，盡早將胚胎植入子宮從而降低外界因素對受精卵發(fā)育產生的不良影響，使胚胎得到更好的發(fā)育。

在本研究中，我們通過qRT-PCR和Western blot技術檢測小鼠1-細胞期受精卵發(fā)育全過程各個時期(主要是G1、S、G2、M期)Wee1 mRNA和Wee1蛋白的表達，并且通過間接免疫熒光技術觀察Wee1蛋白的亞細胞定位。我們發(fā)現(xiàn)小鼠1-細胞期受精卵G2/M轉換過程伴隨Wee1 mRNA和蛋白的下調。在小鼠1-細胞期受精卵發(fā)生有絲分裂的過程中存在Wee1蛋白激酶亞細胞的重新定位。這提示我們Wee1蛋白激酶可能參與調控小鼠早期胚胎的發(fā)育，本課題組今后將通過顯微注射構建的Wee1表達載體(野生型、突變型)，具體研究Wee1對小鼠1-細胞期受精卵卵裂率的影響；并通過Western blot技術檢測Wee1的磷酸化/去磷酸化與小鼠1-細胞期受精卵G2/M轉換(Cdc2-Tyr15脫磷酸化)發(fā)生的順序，進一步證實Wee1是否通過磷酸化/去磷酸化在哺乳動物細胞周期進程中發(fā)揮作用。據(jù)報道，在爪蟾中14-3-3蛋白與Wee1蛋白激酶的結合與解離可以控制Wee1蛋白激酶在不同時期發(fā)生核漿轉位[20]。這說明Wee1蛋白激酶也可能通過與其他調節(jié)細胞周期的分子(如Cdc25B、Cdc14A、PKA、14-3-3ε蛋白)共同作用，參與調節(jié)小鼠1-細胞期受精卵的發(fā)育，這也將是本課題組今后研究的方向之一。