5個(gè)產(chǎn)地茯苓的質(zhì)量評(píng)價(jià)

高芳芳，單曉曉，楊 璇，李俊瑩，周樂(lè)樂(lè)，張 越，陳衛(wèi)東，張彩云(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 00；安徽省教育廳現(xiàn)代藥物制劑工程技術(shù)研究中心；安徽省道地中藥材品質(zhì)提升創(chuàng)新協(xié)同中心；安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所；中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；通訊作者,E-mail:cyzhang6@ustc.edu.cn)

茯苓始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，是沿用千年的藥食兩用大宗中藥材[1]。茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，味甘、淡，平，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有利水滲濕，健脾寧心之功效，可用于調(diào)理和治療水腫尿少、痰飲眩悸、脾虛食少、心神不安等不適[2]。茯苓是自古醫(yī)家最常用的中藥之一，被稱(chēng)為“四時(shí)神藥”，可與各種寒、濕、風(fēng)、溫藥物配伍使用并發(fā)揮其獨(dú)特的功效，有“十藥九茯苓”之說(shuō)[3-6]。近年來(lái)，人們對(duì)安全健康的藥食同源藥材的需求日益增長(zhǎng)，茯苓市場(chǎng)需求量正在逐年攀升[7,8]。

現(xiàn)代藥理研究表明，茯苓中三萜酸類(lèi)成分是其重要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、鎮(zhèn)靜催眠等作用，引起國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注[9-13]。其中，茯苓酸為羊毛甾-8-烯型三萜，單一純品為白色粉末，是反映茯苓品質(zhì)的重要指標(biāo)[14-16]。2020版《中華人民共和國(guó)藥典》僅采用薄層色譜鑒別控制茯苓藥材的質(zhì)量，難以全面反映其質(zhì)量?jī)?nèi)涵[2]。因此本研究基于2020版《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)茯苓性狀、顯微結(jié)構(gòu)、理化特征、薄層色譜的評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合茯苓酸含量測(cè)定，對(duì)我國(guó)茯苓主產(chǎn)區(qū)藥材進(jìn)行全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

茯苓主要生長(zhǎng)在我國(guó)安徽、湖北、云南等地，地區(qū)間自然環(huán)境的差異必定對(duì)茯苓藥材的生長(zhǎng)和質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響[17-19]。本研究分別從云南、湖北、安徽5個(gè)產(chǎn)地收集了25批茯苓樣品，通過(guò)性狀、顯微結(jié)構(gòu)、理化特征、薄層色譜及茯苓酸含量對(duì)茯苓開(kāi)展系統(tǒng)評(píng)價(jià)，以期分析地區(qū)環(huán)境對(duì)茯苓藥材質(zhì)量的影響，為茯苓藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、含茯苓的“經(jīng)典復(fù)方”及“藥食同源”食品開(kāi)發(fā)等提供科學(xué)研究依據(jù)。

1 儀器和材料

EX125DZH電子天平(奧豪斯儀器有限公司，常州)；TOUPCAM顯微鏡(浙江舜宇光學(xué)科技有限公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠)；超聲波清洗機(jī)(深圳市結(jié)盟清洗設(shè)備有限公司)；Thermo U3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；乙腈為色譜純(美國(guó)OCEANPAK公司)。乙醚、甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、甲酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。茯苓酸對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)PU0510-0025MG，98.78%)；茯苓對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)12117-201910)；茯苓藥材、飲片采自云南騰沖、湖北羅田、安徽金寨、安徽霍山、安徽岳西，具體信息見(jiàn)表1；茯苓藥材由安徽中醫(yī)藥大學(xué)彭燦教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核。

表1 不同批次茯苓采集信息Table 1 Information of different batches of Poria cocos from different producing regions

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀描述

取5個(gè)產(chǎn)地茯苓藥材和飲片，按2020版《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定方法對(duì)茯苓藥材和飲片的形狀、大小、表面、質(zhì)地、斷面、顏色、氣味等特征進(jìn)行描述，結(jié)果見(jiàn)圖1。5個(gè)產(chǎn)地相同生長(zhǎng)年限的茯苓藥材，茯苓個(gè)呈類(lèi)球形、橢圓形、扁圓形或不規(guī)則團(tuán)塊，大小不一。外皮薄而粗糙，棕褐色至黑褐色，有明顯的皺縮紋理。體重，質(zhì)堅(jiān)實(shí)，斷面顆粒性，有的具裂隙，外層淡棕色，內(nèi)部白色，少數(shù)淡紅色，有的中間抱有松根。茯苓氣微，味淡，嚼之黏牙。以上茯苓藥材性狀與2020版《中華人民共和國(guó)藥典》[2]一致。

A.云南騰沖茯苓藥材；B.安徽金寨茯苓藥材；C.湖北羅田茯苓藥材；D.安徽霍山茯苓藥材；E.安徽岳西茯苓藥材；F.云南騰沖茯苓塊；G.安徽金寨茯苓塊；H.湖北羅田茯苓塊；I.安徽霍山茯苓塊；J.安徽岳西茯苓塊圖1 不同產(chǎn)地茯苓藥材和飲片F(xiàn)igure 1 Medicinal herbs and prepared slices of Poria cocos from different producing areas

茯苓為藥典規(guī)定可以進(jìn)行產(chǎn)地趁鮮加工的藥材之一，因此本研究對(duì)比了5個(gè)產(chǎn)地茯苓塊的性狀，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn)，5個(gè)產(chǎn)地的茯苓塊均呈立方塊狀或方塊狀厚片，白色或淡紅色，大小不一，其中湖北羅田的茯苓塊切制的尺寸稍小。

2.2 鑒別

2.2.1 顯微觀察 取干燥的茯苓藥材和飲片，按2020版《中華人民共和國(guó)藥典》的顯微鑒別法，對(duì)粉碎后藥材粉末進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2。可見(jiàn)，5個(gè)產(chǎn)地茯苓均有典型的無(wú)色不規(guī)則顆粒狀團(tuán)塊和分枝狀團(tuán)塊，及無(wú)色、淡棕色或有分枝的菌絲等顯微結(jié)構(gòu)特征，與2020版《中華人民共和國(guó)藥典》描述一致。與云南騰沖、湖北羅田、安徽金寨、安徽岳西的茯苓相比，安徽霍山與湖北羅田茯苓顯微觀察的不規(guī)則團(tuán)塊較多，其他未見(jiàn)有明顯差異。

2.2.2 理化鑒別 按2020版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定對(duì)茯苓進(jìn)行理化鑒別：取少量5個(gè)產(chǎn)地干燥的茯苓粉末于試管中，加適量碘化鉀碘試液，結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢钥闯?個(gè)產(chǎn)地25批茯苓均顯深紅色，與藥典中記載一致。將樣品于載玻片上比較分析，安徽霍山的茯苓粉末顯色相對(duì)較深。

1～5.云南騰沖；6～10.安徽金寨；11～15.湖北羅田；16～20.安徽霍山；21～25.安徽岳西；26.茯苓對(duì)照藥材A.云南騰沖；B.安徽金寨；C.湖北羅田；D.安徽霍山；E.安徽岳西；F.茯苓對(duì)照藥材圖3 茯苓粉末的理化特征圖Figure 3 Physical and chemical characteristics of Poria cocos powder

2.2.3 薄層鑒別 分別各取25批茯苓藥材粉末1 g，加乙醚50 ml，超聲處理10 min后過(guò)濾。濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml溶解，作為供試品溶液。

另取茯苓對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。

按照2020版《中華人民共和國(guó)藥典》薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(20 ∶5 ∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)后取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸溶液-乙醇(4 ∶1)混合溶液，最后在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰[2]，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可見(jiàn)，在供試品色譜中，與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，25批茯苓藥材均顯相同顏色的主斑點(diǎn)，說(shuō)明各產(chǎn)地茯苓均符合藥典薄層色譜評(píng)價(jià)要求。

1～5.云南騰沖；6～10.安徽金寨；11～15.湖北羅田；16～20.安徽霍山；21～25.安徽岳西；26.茯苓對(duì)照藥材圖4 茯苓藥材的薄層色譜圖Figure 4 Thin layer chromatogram of Poria cocos

2.3 茯苓酸含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 本研究選用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水(82 ∶18)；流速為1.0 ml/min。柱溫設(shè)置在30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣容積為10 μl。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取1 g過(guò)三號(hào)篩茯苓粉末，置于100 ml錐形瓶中，加入25 ml甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，補(bǔ)足失重，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取茯苓酸對(duì)照品2.36 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成濃度為236.0 μg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3.4 方法學(xué)考察

2.3.4.1 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇溶液分別配制成濃度為11.8，23.6，47.2，94.4，141.6，236.0 μg/ml的對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)，分別以茯苓酸濃度(X)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，建立回歸方程Y=0.107 4X-0.099 8(R2=0.999 4)。可見(jiàn)，茯苓酸在11.8～236.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4.2 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取空白溶劑甲醇、對(duì)照品和供試品溶液按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，具體HPLC色譜見(jiàn)圖5。由色譜圖可看出，空白甲醇峰與茯苓酸峰1分離良好，對(duì)照品和供試品溶液中茯苓酸峰測(cè)定無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)。供試品溶液與對(duì)照品中茯苓酸色譜峰的保留時(shí)間為16.72 min。

S1.空白甲醇；S2.供試品；S3.對(duì)照品；1.茯苓酸圖5 對(duì)照品、供試品的高效液相色譜圖Figure 5 High performance liquid chromatogram of reference and test sample

2.3.4.3 精密度試驗(yàn) 取安徽岳西茯苓(編號(hào)25)供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得茯苓酸含量的RSD為1.30%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取安徽岳西茯苓(編號(hào)25)供試品溶液，于0，2，4，8，12，24 h在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得茯苓酸含量RSD為1.76%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份安徽岳西茯苓(編號(hào)25)樣品粉末1 g，精密稱(chēng)定后按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得茯苓酸含量RSD為1.49%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的6份安徽岳西茯苓(編號(hào)25)樣品粉末1 g，精密稱(chēng)定，置100 ml錐形瓶中，分別精密加入0.203 mg/ml的茯苓酸對(duì)照品溶液0.5 ml，按照“2.3.2”項(xiàng)下處理方法制備供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果為104.46%(RSD=2.33%，見(jiàn)表2)，表明回收率良好。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery test

2.3.5 樣品含量測(cè)定 分別精密量取各供試品、對(duì)照品溶液10 μl，注入液相色譜儀。結(jié)果顯示，本次測(cè)定的25批茯苓，其茯苓酸含量范圍為0.048 7%～0.113 7%。對(duì)每批茯苓飲片中茯苓酸含量計(jì)算平均值，其中安徽霍山茯苓的茯苓酸均值達(dá)到0.083 8%。相比其他4個(gè)產(chǎn)地，安徽霍山茯苓的茯苓酸含量高，其平均含量約為其他4個(gè)產(chǎn)地的1.05～1.68倍(見(jiàn)表3)。

表3 云南、湖北、安徽不同產(chǎn)地茯苓中茯苓酸含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of Poria acid content in diffe-rent producing areas of Yunnan, Hubei and Anhui

3 討論

茯苓被譽(yù)為中華九大仙草之一，作為藥用保健品長(zhǎng)達(dá)2000多年，古人把它稱(chēng)作“四時(shí)神藥”，功效十分廣泛[20]。但茯苓野生資源稀少，栽培品種又受地域限制，各個(gè)產(chǎn)地的茯苓質(zhì)量不一，尋找長(zhǎng)期穩(wěn)定的茯苓飲片供應(yīng)地至關(guān)重要[21]。為了建立科學(xué)可靠的茯苓質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，本研究在2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》收錄規(guī)定對(duì)茯苓質(zhì)量的檢查方法評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，增加了茯苓重要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)—茯苓酸含量測(cè)定[22-27]，以全面檢查評(píng)價(jià)茯苓藥材的質(zhì)量。

本研究結(jié)果顯示，云南、湖北、安徽3個(gè)地區(qū)5個(gè)產(chǎn)地25批茯苓的性狀、顯微結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和薄層鑒定均符合2020版《中華人民共和國(guó)藥典》要求。在顯微、理化鑒別方面，安徽霍山與湖北羅田茯苓粉末中無(wú)色不規(guī)則顆粒狀團(tuán)塊和分枝狀團(tuán)塊較多，遇碘化鉀碘試液顯色也更明顯，這表明安徽霍山與湖北羅田的茯苓所含多糖含量較其他3個(gè)產(chǎn)地豐富。在薄層色譜鑒別方面，5個(gè)產(chǎn)地茯苓與相應(yīng)對(duì)照藥材色譜在相同位置上均顯示相同顏色主斑點(diǎn)。在茯苓酸含量方面，安徽霍山的茯苓酸含量較其他4個(gè)產(chǎn)地高。

造成茯苓成分差異的因素很多，如不同產(chǎn)地的地理環(huán)境、氣候、土壤以及栽培技術(shù)，這些差異是否對(duì)茯苓藥理作用造成影響，仍需進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究探討[28]。本研究基于2020版《中華人民共和國(guó)藥典》和茯苓酸含量測(cè)定，對(duì)安徽、湖北、云南3個(gè)地區(qū)5個(gè)產(chǎn)地茯苓進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，可為我國(guó)茯苓藥材和飲片產(chǎn)地選擇和新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。