槲皮素對α-ZOL誘導Caco-2細胞損傷的保護作用研究

張 馳 李姝薈 周鴻媛 郭 婷 張宇昊 馬 良

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

玉米赤霉烯酮是糧食安全領(lǐng)域重點研究的真菌毒素之一［1-2］。α-玉米赤霉烯醇（α-Zearalenol，α-ZOL）是玉米赤霉烯酮在人畜體內(nèi)代謝后的主要代謝產(chǎn)物［3-4］，主要毒性表現(xiàn)為雌激素作用，且高于母體毒素3～4倍，嚴重危害動物生產(chǎn)性能和人類健康［5-7］。目前利用食源性天然成分的生物活性干預危害因子毒性已成為研究熱點之一［8-12］。

槲皮素（quercetin，Que）是一種廣泛存在于蔬菜、水果中的膳食多酚類黃酮化合物［13-14］，具有多種生物學活性及很高的藥用價值，在營養(yǎng)干預及多種疾病模型的防治中受到廣泛關(guān)注［15-17］。如前期報道，Que可以提高核轉(zhuǎn)錄因子表達、抗氧化酶活性和總抗氧化能力，從而有效調(diào)節(jié)T-2［18］、黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）［19］和赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）［20］引起的氧化應激，顯示出良好的抗氧化活性。體外模擬研究證明Que對人血清白蛋白上結(jié)合的α-ZOL有競爭取代作用［21］；因此，本研究利用α-ZOL誘導Caco-2細胞建立氧化損傷模型，從氧化應激、線粒體功能和細胞凋亡等方面研究Que對α-ZOL誘導的細胞毒性損傷的影響和相關(guān)機制，以期為利用具有生物活性的天然產(chǎn)物降低真菌誘導的毒性損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞系人結(jié)腸腺癌細胞系Caco-2來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，APCC）細胞庫。

1.1.2 藥物與試劑槲皮素（Que），純度≥97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；α-玉米赤霉烯醇（α-ZOL），純度≥99%，新加坡Pribolab公司；不完全高糖培養(yǎng)基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM），江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；細胞增殖及毒性（Cell Counting Kit-8，CCK-8）檢測試劑盒，南京草本源生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒，上海貝博生物科技有限公司；吖啶橙（acridine orange，AO）染色液，北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶活性（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、2，2'-二辛可寧酸（2，2'-bicinchonininc acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒-熒光探針法（5，5'，6，6'-Tetrachloro-1，1'，3，3'-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide，JC-1）、膜聯(lián)蛋白V-熒光素異硫氰酸酯（annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）細胞凋亡檢測試劑盒，均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗半胱天冬酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）、一抗核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor-2，Nrf2）、一抗B淋巴細胞瘤-2（b-cell lymphoma-2，Bcl-2）、辣根過氧化生物酶HRP標記羊抗兔二抗，美國Abcam公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備371型二氧化碳培養(yǎng)箱、ST40R型冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技公司；SW-CJ-2F型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；IX73型熒光顯微鏡，日本Olympus公司；SYNERGY2型多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；BD FACSVerse型流式細胞儀，美國Becton Dickison公司；DYCZ-24DN型垂直電泳槽，北京六一儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 Caco-2細胞存活率及ROS、MDA和SOD水平的測定a.細胞處理：Caco-2細胞培養(yǎng)12 h后，鏡下觀察貼壁生長；吸除DMEM培養(yǎng)基，先分別用含有濃度為0、20、40、60 μmol·L-1Que的DMEM培養(yǎng)基預處理24 h，吸除培養(yǎng)基，然后再用含有濃度為0、20、40、60 μmol·L-1α-ZOL的培養(yǎng)基作用24 h。b.培養(yǎng)結(jié)束后，按照試劑盒說明書檢測各組中細胞存活率及MDA含量和ROS、SOD活力。

1.2.2 Caco-2細胞中ATP和線粒體膜電位的測定ATP水平檢測方法：不同藥物處理結(jié)束后（同1.2.1a），用4℃預冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）緩慢清洗一次，每孔加入200μL ATP檢測裂解液，適當吹打，于4℃、12 000×g條件下離心5 min，取上清，按照試劑盒說明書操作。根據(jù)構(gòu)建的標準曲線計算樣品中的ATP濃度。

線粒體膜電位檢測方法：不同藥物處理結(jié)束后，每孔加入1 mL JC-1工作液，在37℃孵箱中培養(yǎng)20 min，用現(xiàn)配的JC-1染色緩沖液（1×）洗滌兩次，加入1 mL DMEM培養(yǎng)基，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 Caco-2細胞凋亡的觀察及檢測Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染觀察細胞死亡情況：不同藥物處理結(jié)束后（同1.2.1a），每孔加入1 mL細胞染色緩沖液，隨后加入5μL Hoechst染色液、5 μL PI染色液并混勻，37℃孵育25 min，結(jié)束后用熒光顯微鏡觀察。

AO染色觀察細胞核形態(tài)變化：不同藥物處理結(jié)束后（同1.2.1a），每孔加入1 mL用PBS配置好的濃度為10 μg·mL-1的AO染色工作液，輕輕混勻，室溫避光染色20 min，結(jié)束培養(yǎng)后，于熒光顯微鏡下觀察。

流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率：不同藥物處理結(jié)束后，加入200μL胰酶消化細胞，離心收集細胞，用195μL熒光探針異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的磷脂結(jié)合蛋白（Annexin V），即Annexin V-FITC重懸細胞，再加入5μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，最后加入10μL PI染色液，輕輕混勻。室溫下避光孵育15 min后，1 000×g離心5 min，棄上清，用PBS重懸洗滌未結(jié)合的染色液，用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 蛋白免疫印跡分析接種Caco-2細胞于六孔板中，不同藥物處理結(jié)束后（同1.2.1a），用PBS洗滌，加入細胞裂解液（radio immunoprecipitation assay，RIPA）于冰上裂解30 min，離心取上清，采用BCA試劑盒進行蛋白定量。隨后，取30μg變性蛋白上樣，采用凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane，NC膜），用5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入相應一抗（Nrf2，1∶1 000；Bcl-2，1∶1 000；Caspase-3，1∶1 000），4℃封閉過夜，洗滌緩沖液洗3次，加二抗（1∶1 000）封閉液封閉1 h，采用化學發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）發(fā)光法顯色。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用Microsoft Office Excel 2016進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并計算平均值和標準偏差，采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件分析數(shù)據(jù)，使用Duncan's多重比較法進行顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。使用Origin 9軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Que對α-ZOL誘導Caco-2細胞活力的影響

由圖1-A可知，α-ZOL對Caco-2細胞活力具有明顯的抑制作用，其半抑制濃度（IC50）為82.94μmol·L-1。當Que濃度低于80μmol·L-1時，隨著Que濃度的升高，Caco-2細胞活力均有不同程度的升高，但Que濃度為80μg·mL-1和160μg·mL-1時，會對細胞的增殖出現(xiàn)抑制作用，這可能是因為高劑量的Que可以在離體線粒體和培養(yǎng)的細胞中增強O2－·的生成，降低細胞總抗氧化能力［22］。

圖1 Que對α-ZOL誘導Caco-2細胞損傷的影響Fig.1 Effect of Que on Caco-2 cell injury induced by α-ZOL

Que對α-ZOL誘導Caco-2細胞存活率的影響如圖1-B所示，相比20、40、60μmol·L-1α-ZOL單獨處理組，經(jīng)過20、40、60μmol·L-1Que預處理的細胞存活率有所提高，其中40 μmol·L-1Que下的細胞存活率最大。對此組進行Hoechst 33342/PI雙染觀察，結(jié)果如圖1-C所示，α-ZOL引起細胞核染色質(zhì)凝集、濃縮，最終形成凋亡小體，表現(xiàn)出細胞凋亡的典型特征；Que在該過程中起到了保護作用，與40μmol·L-1α-ZOL組相比，40 μmol·L-1Que+40 μmol·L-1α-ZOL組染色細胞數(shù)明顯減少，凋亡細胞比例減少，細胞凋亡有明顯改善。但經(jīng)高濃度的α-ZOL（60μmol?L-1）暴露細胞24 h后，60μmol?L-1Que預處理達不到改善的效果。因此，60 μmol?L-1α-ZOL和Que不作為后續(xù)試驗中的給藥劑量。

2.2 Que對α-ZOL誘導Caco-2細胞氧化損傷的影響

由圖2-A可知，細胞內(nèi)的ROS熒光強度隨α-ZOL濃度的增加而增強，而Que的干預使各α-ZOL濃度誘導的熒光強度明顯減弱。由圖2-B～D可知，α-ZOL使細胞內(nèi)的ROS、MDA水平顯著升高，SOD活力降低；20、40 μmol·L-1Que的干預使ROS、MDA水平顯著低于α-ZOL組，SOD相對活力呈量效關(guān)系。由此說明，細胞經(jīng)α-ZOL處理后發(fā)生了較嚴重的損傷，而Que可通過有效清除自由基和增強細胞自身的抗氧化能力來緩解活性氧對細胞膜脂質(zhì)氧化損傷的影響，進而減輕α-ZOL誘導的細胞氧化應激損傷。其中，當細胞經(jīng)過40μmol?L-1Que預處理，再經(jīng)40μmol?L-1α-ZOL暴露24 h時的改善效果最佳。因此，在后續(xù)試驗中統(tǒng)一采用此濃度模型進行干預。

圖2 Que對α-ZOL誘導氧化損傷的影響Fig.2 Effect of Que on cell oxidative damage by α-ZOL

2.3 Que對α-ZOL誘導Caco-2細胞線粒體功能的影響

ATP和線粒體膜電位的變化與活性氧自由基的產(chǎn)生有關(guān)，當細胞受到毒性物質(zhì)的刺激發(fā)生凋亡或壞死時，由于氧化應激而導致的細胞損傷甚至死亡將伴隨兩者水平的降低，表明線粒體的功能受損或下降［23-24］。由圖3可知，與對照組相比，α-ZOL組ATP相對含量和紅綠熒光強度比值顯著降低，說明線粒體功能受損；而與α-ZOL組相比，Que的干預可使ATP相對含量提高3個百分點，紅綠熒光強度比值提高9%。結(jié)果表明，Que可抑制α-ZOL引起的ATP含量和線粒體膜電位降低，使得細胞有足夠的能量物質(zhì)來源以適應α-ZOL對線粒體造成的損害作用，從而維持氧化應激條件下線粒體正常的生理功能。

圖3 Que對α-ZOL誘導線粒體功能損傷的影響Fig.3 Effect of Que on mitochondrial function injury by α-ZOL

Que組的ATP水平下降可能是因為細胞內(nèi)ATP與二磷酸腺苷（adenosine diphosphate A，ADP）是動態(tài)平衡的關(guān)系，ATP/ADP比例適當下降，通常會導致細胞內(nèi)二氧化碳的積累，從而刺激呼吸作用產(chǎn)生，促進線粒體代謝［25］。

2.4 Que對α-ZOL誘導Caco-2細胞凋亡的影響

由圖4-A可知，Que組和對照組的細胞形態(tài)正常，并呈現(xiàn)出均勻的淺綠色熒光。α-ZOL使細胞產(chǎn)生了核濃染及碎片化的現(xiàn)象，發(fā)出亮綠色熒光（圖中箭頭所指示），而Que的干預減少了不規(guī)則碎片細胞的出現(xiàn)，降低了致密濃染的程度，表明40μmol·L-1Que可減輕α-ZOL引起的細胞核DNA受損程度，從而降低細胞凋亡數(shù)。由圖4-B可知，相較于對照組，α-ZOL組細胞凋亡率明顯著增加，而Que的干預使細胞凋亡率有所降低，表明Que可通過減弱α-ZOL誘導的細胞凋亡來保護細胞。

圖4 Que對α-ZOL誘導細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of Que on cell morphology induced by α-ZOL

2.5 Que對α-ZOL誘導Nrf2、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響

采用蛋白免疫印跡（western blotting，WB）分析抗氧化蛋白Nrf2、抗凋亡蛋白Bcl-2以及促凋亡蛋白Caspase-3的表達水平，結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，40μmol·L-1Que組能夠上調(diào)Nrf2和Bcl-2的表達，下調(diào)Caspase-3的表達；與α-ZOL組相比，40μmol·L-1Que+40μmol·L-1α-ZOL能夠?qū)rf2、Bcl-2和Caspase-3蛋白相對表達水平恢復至正常水平，說明Que+40μmol·L-1α-ZOL能夠?qū)沟蛲龌駼cl-2進行合理的調(diào)控，進一步下調(diào)Caspase-3活性從而抑制α-ZOL誘導的Caco-2細胞凋亡。

圖5 各組Nrf2、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達水平Fig.5 Nrf2，Bcl-2 and Caspase-3 protein expression levels in each group

3 討論

本研究中α-ZOL誘導細胞產(chǎn)生大量ROS，破壞細胞的氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)，降低胞內(nèi)抗氧化酶系的活力，致使胞內(nèi)的氧化與抗氧化之間的平衡被打破，導致細胞發(fā)生不可逆的氧化損傷，這與目前報道α-ZOL對多種機體細胞有毒性作用，且產(chǎn)生毒性的機制主要是誘導細胞發(fā)生氧化應激［26-27］的研究結(jié)果一致。同時，本研究發(fā)現(xiàn)α-ZOL誘導的細胞損傷還與其損傷線粒體功能以及誘導細胞凋亡有關(guān)，α-ZOL誘導ROS的產(chǎn)生并引發(fā)線粒體膜電位降低，抑制ATP合成，導致線粒體功能受損繼而啟動細胞線粒體途徑凋亡級聯(lián)反應，激活Caspase-3，從而使細胞發(fā)生凋亡。研究結(jié)果進一步豐富了α-ZOL毒性作用機制。

線粒體內(nèi)已形成一套有效的抗氧化系統(tǒng)專門用于去除各種類型的ROS或修復生物分子的氧化損傷［28-29］，一種可能的保護策略是用抗氧化劑豐富組織線粒體，從而限制線粒體氧化損傷、細胞損傷以及毒性的發(fā)生和發(fā)展［30］。本研究發(fā)現(xiàn)Que處理可緩解α-ZOL對細胞的損傷，究其原因，一方面槲皮素對ROS引起的線粒體損傷具有保護作用，可以提高ATP水平和線粒體膜電位，并且通過Bcl-2蛋白調(diào)控線粒體途徑來下調(diào)Caspase-3表達量，從而使Bcl-2得以表達，減少細胞凋亡；另一方面槲皮素可能提升了內(nèi)源性抗氧化劑的生成能力從而使其體現(xiàn)出良好的抗氧化能力，通過激活Nrf2信號通路的核轉(zhuǎn)移來提高SOD活力，清除由α-ZOL誘導產(chǎn)生的過多ROS，進而緩解α-ZOL誘導細胞引起的氧化應激，減少細胞凋亡。本研究結(jié)果進一步證實了前人關(guān)于Que在細胞抗氧化、抗凋亡及保護線粒體方面起重要作用的結(jié)論［31］。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，Que干預α-ZOL誘導的Caco-2細胞氧化損傷，明顯降低Caco-2細胞ROS水平、MDA含量，提高SOD活力；同時維持線粒體膜電位、ATP含量以減輕線粒體受損程度，有效減輕α-ZOL對Caco-2細胞造成的毒性損傷。為控制α-ZOL危害，進行科學合理的健康膳食干預非常重要?；诒驹囼炑芯拷Y(jié)果，Que在生物體內(nèi)的保護作用及機制等可在下一步工作中進行深入探究。