葛根素對(duì)小白菜鎘損傷的保護(hù)作用研究

胡遠(yuǎn)鋒 張 明 范淑英 葛 菲 朱衛(wèi)豐 肖旭峰，*

（1江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西南昌 330045；2江西生物科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，江西南昌 330200；3江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌 330004）

近年來(lái)，谷物、蔬菜、油料種子及其加工農(nóng)產(chǎn)品中鎘（Cd）含量超標(biāo)事件頻頻發(fā)生。Cd被植物吸收后在體內(nèi)富集，由根向地上部莖葉中轉(zhuǎn)運(yùn)，最后到達(dá)種子，Cd毒害一方面改變植物多種生理和生化過(guò)程，如生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分裂、光合作用、酶活性和滲透平衡等［1-3］，引起產(chǎn)量下降；另一方面通過(guò)“土壤-植物-人類”體系，在植物中富集后由食物鏈進(jìn)入人體，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生，嚴(yán)重危害人類的生命健康［4］。因此，在當(dāng)今食品安全形勢(shì)日益嚴(yán)峻的情況下，尋找解決蔬菜中Cd超標(biāo)的防治方法已刻不容緩。

葛根素（puerarin，PUE）是一種植物異黃酮類衍生物，來(lái)源于豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，具有降血壓、血脂、血糖，清除自由基，抗氧化等多種藥理活性作用［5］。在動(dòng)物研究中，葛根素是一種自由基清除劑，在細(xì)胞氧化損傷中可起到保護(hù)作用。如Zhou等［6］研究發(fā)現(xiàn)葛根素在Cd脅迫大鼠致肝毒性損傷中具有明顯的保護(hù)作用，該機(jī)制可能與葛根素抑制細(xì)胞凋亡，恢復(fù)自噬通量和提高抗氧化酶活性等密切相關(guān)；Wan等［7］同樣發(fā)現(xiàn)葛根素通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)減輕了Cd脅迫引起的小鼠肝損傷。然而，關(guān)于葛根素應(yīng)用于植物中是否也有類似保護(hù)功能卻鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。在葛根生產(chǎn)栽培中存在大量提取葛粉后剩余的葛渣，以及丟棄無(wú)用的葛藤和葛葉，而這些葛渣、葛藤和葛葉中均含有葛根素。實(shí)現(xiàn)這些廢棄物的循環(huán)利用將有望提高葛根的生產(chǎn)效益。為此，本研究采取外源添加不同濃度葛根素處理，研究葛根素對(duì)Cd致小白菜幼苗損傷的保護(hù)效果，以期為葛根素在Cd污染防治和提高蔬菜產(chǎn)量等方面的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與主要試劑

供試小白菜（Brassica chinensisL.）品種為矮腳上海青，由日本株式會(huì)社目宇種苗園提供；葛根素購(gòu)買于酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021年5月在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。育苗室的平均晝夜溫度為22±3℃，相對(duì)濕度為70%±5%。挑選大小相似、形態(tài)完整、長(zhǎng)勢(shì)飽滿程度相近的小白菜種子撒播在土壤中。待幼苗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽至霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液（Hoagland）中。緩苗7 d后隨機(jī)分成7組，分別向營(yíng)養(yǎng)液中加入相應(yīng)濃度的CdCl2·2.5H2O及葛根素，處理組依次為對(duì)照組（CK）、葛根素組（PUE 30 μmol·L-1）、鎘組（Cd 4 mg·L-1）、鎘與葛根素共處理組（Cd 4 mg·L-1+PUE 15μmol·L-1、Cd 4 mg·L-1+PUE 30μmol·L-1、Cd 4 mg·L-1+PUE 45 μmol·L-1、Cd 4 mg·L-1+PUE 60 μmol·L-1），分別標(biāo)記為CK、PUE30、Cd4、4+15、4+30、4+45、4+60，每處理4株，重復(fù)3次，其中CK組不添加任何Cd和葛根素。營(yíng)養(yǎng)液每7 d更換1次，每天攪拌3次，30 d后收獲，取每盆中的4株根系和葉片（隨機(jī)選取大小葉片）的混樣，并重復(fù)3次。樣品切碎后用液氮速凍，并放于-80℃超低溫冰箱保存，用MM400冷凍混合器球磨機(jī)（德國(guó)Retsch公司）粉碎樣品，分裝后用于測(cè)定相關(guān)生理特性指標(biāo)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定觀察處理30 d后的小白菜植株形態(tài)特征，并使用AE124電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）測(cè)定小白菜植株地下部和地上部的鮮重。

1.3.2 Cd含量測(cè)定采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）法測(cè)定小白菜根和葉的Cd含量。其中根系和葉片均取每盆4株植株研磨后的混樣，按平行試驗(yàn)重復(fù)3次。取0.2 g研磨后的樣品放入聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL硝酸。靜置反應(yīng)后，放入ETHOS ONE微波消解儀（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）進(jìn)行消解。待溫度降至50℃以下時(shí)，取出消解罐放入通風(fēng)櫥內(nèi)，打開(kāi)消解罐用超純水沖洗，轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中沖洗3～4次，用超純水稀釋并定容至50 mL，最后測(cè)定Cd含量。ICP-MS光譜儀電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司）的參數(shù)設(shè)置如下：射頻功率1 550 W；泵速40 r·min-1；霧化室溫度2.7℃；采樣深度5 mm；冷卻氣流速14 L·min-1；輔助氣流速0.8 L·min-1；霧化器氣流速0.9 L·min-1。

1.3.3 氧化損傷相關(guān)指標(biāo)測(cè)定選取功能葉的同一部位，采用SPAD502葉綠素儀（日本柯尼卡美能達(dá)公司）測(cè)定葉綠素含量；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid method，TBA）顯色法進(jìn)行測(cè)定；H2O2含量采用A064-1-1過(guò)氧化氫試劑盒（南京建成科技有限公司）進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法參考其說(shuō)明書。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性參考Giannopolitis等［8］的方法進(jìn)行測(cè)定；過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性參考王偉玲等［9］的方法進(jìn)行測(cè)定；抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性參考Nakano等［10］的方法進(jìn)行測(cè)定；過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性參考Aebi［11］的方法進(jìn)行測(cè)定。Vc含量參考Zhang等［12］的方法進(jìn)行測(cè)定；可溶性蛋白含量參考《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》［13］的方法進(jìn)行測(cè)定。UV-2600紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）用于測(cè)定POD、CAT和APX酶活性；Spectra MAX M2多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）用于測(cè)定H2O2、MDA、VC、可溶性蛋白含量和SOD活性。

1.4 抗氧化酶基因表達(dá)特性分析

總RNA提取和熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）方法分別參照Trizol試劑盒（日本TaKaRa公司）及PrimeScript?RT reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒（日本TaKaRa公司）說(shuō)明書。根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)已發(fā)表的其他物種抗氧化酶基因的序列，設(shè)計(jì)超氧化物歧化酶基因（Cu/Zn-SOD）、過(guò)氧化物酶基因（POD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶基因（APX）和過(guò)氧化氫酶基因（CAT）的引物并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成（見(jiàn)表1）。

表1 抗氧化酶相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primers of the anti-oxidative enzyme genes

1.5 數(shù)據(jù)分析

本文中數(shù)據(jù)均為3組平行試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0軟 件 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)最小顯著差異法（least significant difference，LSD）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

在實(shí)際應(yīng)用中，由于光學(xué)裝調(diào)誤差、環(huán)境溫度、發(fā)射和接收平臺(tái)振動(dòng)等會(huì)引入光纖對(duì)準(zhǔn)誤差和光束隨機(jī)抖動(dòng)誤差，致使模場(chǎng)匹配程度下降，耦合效率降低，從而導(dǎo)致接收端信噪比下降，誤碼率提高，通信質(zhì)量變差.接下來(lái)將推導(dǎo)并建立不同影響因素下空間光-少模光纖耦合效率的數(shù)理模型.

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根素對(duì)Cd脅迫下小白菜幼苗生長(zhǎng)量的影響

由圖1可知，PUE30組的小白菜株型較CK組更大，根系更發(fā)達(dá)，葉色濃綠，長(zhǎng)勢(shì)更佳。與單一Cd組相比，添加較低濃度葛根素（≤30μmol·L-1）能使小白菜植株生長(zhǎng)更旺盛，葉色更綠；但較高濃度葛根素（≥30μmol·L-1）處理差異不明顯。由表2可知，小白菜地下部鮮重隨葛根素濃度的升高而逐漸增加，但地上部鮮重與之相反，呈現(xiàn)“低促高抑”變化，當(dāng)葛根素濃度≤30μmol·L-1時(shí)，小白菜的地上部鮮重高于單一Cd處理組；當(dāng)葛根素濃度>30μmol·L-1時(shí)，地上部鮮重較Cd4處理有所降低，并在60μmol·L-1達(dá)到顯著差異（P<0.05）。

圖1 各處理的小白菜植株形態(tài)差異Fig.1 Morphological differences of pakchoi seedlings

表2 小白菜幼苗地下部重和地上部鮮重Table 2 Root weight and fresh weight of pakchoi seedlings

2.2 葛根素對(duì)小白菜根和葉中Cd吸收量的影響

由表3可知，外源添加葛根素對(duì)Cd脅迫下小白菜根系Cd含量存在低濃度抑制、高濃度促進(jìn)的影響。與單獨(dú)鎘處理相比，較低濃度葛根素處理（≤30μmol·L-1）均可降低小白菜根和葉中的Cd含量，并在根系中達(dá)到顯著性差異，有效緩解植株的Cd毒害；但隨著葛根素濃度升高（>30μmol·L-1），小白菜根和葉中Cd含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在45μmol·L-1濃度下達(dá)到顯著差異（P<0.05）。

表3 小白菜根和葉中Cd含量Table 3 Cd content in the roots and leaves of pakchoi/（mg·kg-1）

2.3 葛根素對(duì)Cd脅迫下小白菜葉片中H2O2和MDA含量的影響

由圖2可知，Cd4組小白菜葉中的H2O2含量較CK組、PUE30組顯著升高（P<0.05）；PUE30組小白菜葉中MDA含量較CK組、Cd4組顯著降低（P<0.05）；與Cd4處理組相比，Cd+PUE共處理組小白菜葉中的H2O2和MDA含量均顯著降低（P<0.05），且二者的變化趨勢(shì)基本一致，均隨葛根素濃度的升高而逐漸增加，這說(shuō)明Cd脅迫使小白菜葉細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，而葛根素可清除植物體內(nèi)自由基，降低膜脂過(guò)氧化損傷。

圖2 小白菜葉中H2O2和MDA含量Fig.2 H2O2 and MDA content in pakchoi leaves

2.4 葛根素對(duì)Cd脅迫下小白菜葉片中葉綠素含量的影響

由圖3可知，與CK相比，PUE30組的葉綠素含量無(wú)顯著差異；而Cd4組的葉綠素含量則顯著降低（P<0.05）。與PUE30組相比，Cd+PUE共處理組小白菜葉中的葉綠素含量均顯著降低。與單獨(dú)鎘處理（Cd4）相比，Cd+PUE共處理組小白菜葉中的葉綠素含量均顯著增加，但Cd+PUE共處理組組間差異不顯著。綜上，葛根素的添加能有效減輕Cd毒性對(duì)小白菜葉綠素的破壞。

圖3 小白菜葉中葉綠素含量Fig.3 Chlorophyll content of pakchoi leaves

2.5 葛根素對(duì)Cd脅迫下小白菜葉片中抗氧化酶的影響

由圖4可知，與CK但相比，單一Cd處理下（Cd4）的POD和APX活性均顯著降低。與PUE30組相比，Cd4組的CAT活性顯著升高，SOD和POD活性顯著下降（P<0.05）。與Cd4組相比，Cd+PUE共處理組的SOD、POD、APX及CAT活性整體顯著提高。其中，4+15、4+30、4+45和4+60處理組的SOD活性分別較Cd4組增加了35.66%、34.98%、32.61%和18.89%；POD活性分別較Cd4組增加了511.70%、598.79%、478.94%和586.23%；APX活性分別較Cd4組增加了74.30%、55.09%、38.91%和32.14%；CAT活性分別較Cd4組增加了73.06%、9.70%、20.74%和30.19%。上述結(jié)果表明，外源葛根素添加能明顯提高小白菜植株的抗氧化能力，維持Cd脅迫下氧化還原反應(yīng)的平衡。

圖4 小白菜葉中抗氧化酶活性Fig.4 Antioxidant enzyme activity in pakchoi leaves

2.6 葛根素對(duì)Cd脅迫下小白菜葉片中Vc和可溶性蛋白含量的影響

由圖5可知，與CK組相比，單獨(dú)葛根素處理組（PUE30）的可溶性蛋白含量顯著增加；與CK組相比，Cd4組中Vc、可溶性蛋白含量均有不同程度升高；與單一Cd處理（Cd4）相比，除4+15處理外，Cd+PUE共處理組的Vc和可溶性蛋白含量均顯著增加（P<0.05），其中Vc含量增幅隨葛根素濃度增加呈下降趨勢(shì)，而可溶性蛋白含量增幅則呈上升趨勢(shì)。綜上，葛根素添加能提高Cd脅迫下小白菜葉中Vc、可溶性蛋白的含量，在一定程度上緩解Cd毒性損傷。

圖5 小白菜葉中Vc和可溶性蛋白含量Fig.5 Vc and the soluble protein contents in root of pakchoi leaves

2.7 葛根素對(duì)Cd脅迫下小白菜葉片中抗氧化酶基因表達(dá)的影響

圖6 小白菜葉中抗氧化酶基因表達(dá)量Fig.6 Expression level of antioxidant enzyme genes of pakchoi leaves

3 討論

Cd是一種毒性強(qiáng)、危害大，且污染性高的重金屬。大量研究表明，我國(guó)城郊、農(nóng)村露地或大棚蔬菜種植的Cd污染問(wèn)題較嚴(yán)重，其中葉菜類蔬菜尤為突出［14-15］。本試驗(yàn)表明，低濃度（≤30 μmol·L-1）的葛根素降低了小白菜根部的Cd含量，但高濃度特別是45 μmol·L-1的葛根素對(duì)小白菜根部Cd含量呈現(xiàn)促進(jìn)作用，這可能是由于高濃度葛根素處理使根系受到傷害，根系細(xì)胞膜透性增加［16］，導(dǎo)致進(jìn)入根系的Cd含量增加。

前人研究表明，Cd2+會(huì)破壞小白菜體內(nèi)細(xì)胞膜滲透性，產(chǎn)生過(guò)量活性氧，造成細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂，抑制種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)等［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下小白菜H2O2和MDA含量較對(duì)照明顯升高，且伴隨有地下、地上部鮮重、抗氧化酶（SOD、POD和APX）活性、葉綠素含量不同程度的降低，說(shuō)明Cd脅迫對(duì)小白菜形態(tài)和生理代謝產(chǎn)生了嚴(yán)重的毒害作用，這與前人研究結(jié)果一致［18-21］。

葛根素具有極強(qiáng)的抗氧化性，對(duì)機(jī)體有重要的保護(hù)作用［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，與CK組相比，單一PUE處理組小白菜的地下、地上部鮮重和可溶性蛋白含量均明顯升高，說(shuō)明適當(dāng)劑量的葛根素可促進(jìn)小白菜機(jī)體生長(zhǎng)，這可能與低劑量黃酮類化合物對(duì)生長(zhǎng)性能有促進(jìn)作用有關(guān)，李博萍等［23］和余應(yīng)梅等［24］關(guān)于葛根素對(duì)大鼠和肉雞機(jī)體生長(zhǎng)影響的研究也支持了上述觀點(diǎn)。

氧化應(yīng)激是Cd致機(jī)體毒性的重要機(jī)制之一，而葛根素具有良好的抗氧化效果［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd+PUE共處理組中小白菜地下部鮮重隨葛根素濃度的升高而明顯增加，但地上部鮮重呈逐漸降低趨勢(shì)，根系Cd含量整體呈先降低后增加趨勢(shì)，說(shuō)明葛根素可保護(hù)Cd脅迫下小白菜的根系生長(zhǎng)，適當(dāng)劑量葛根素可抑制Cd吸收；但當(dāng)葛根素濃度高于45 μmol·L-1時(shí)，Cd和PUE可能協(xié)同抑制了小白菜幼苗生長(zhǎng)。王昌等［26］發(fā)現(xiàn)葛根素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化存在劑量依賴性和雙向性的影響，即低濃度葛根素促進(jìn)骨細(xì)胞形成，而高濃度則呈現(xiàn)抑制作用；Króliczewska等［27］同樣發(fā)現(xiàn)高劑量黃酮類化合物可能對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能有抑制作用?？梢?jiàn)不同濃度葛根素在動(dòng)物研究中的作用是具有雙向性的，本研究同樣發(fā)現(xiàn)適宜低劑量的葛根素才對(duì)小白菜鎘損傷有保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，與單一Cd處理組相比，Cd+PUE共處理組明顯降低了小白菜葉中的H2O2和MDA含量，說(shuō)明小白菜通過(guò)吸收葛根素直接清除活性氧分子，減輕Cd脅迫引起的膜脂過(guò)氧化損傷。同時(shí)，Cd+PUE共處理組的葉綠素、Vc、可溶性蛋白含量及SOD、POD、CAT和APX活性均較Cd4組整體顯著升高，這與聞雙全等［25］與張文華等［28］研究葛根素緩解大鼠Cd損傷的研究結(jié)果類似。說(shuō)明葛根素可以通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶的活性來(lái)穩(wěn)定Cd引起的氧化還原失衡，也再次印證了葛根素的保護(hù)機(jī)制可能和較強(qiáng)的自由基清除作用有關(guān)，即葛根素可通過(guò)恢復(fù)Cd毒害引起的脂質(zhì)代謝紊亂來(lái)減輕Cd導(dǎo)致的小白菜細(xì)胞氧化損傷。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與CK組相比，Cd4組POD和APX基因表達(dá)顯著下調(diào)，導(dǎo)致小白菜抗氧化能力減弱，使小白菜幼苗受到Cd損傷。與單一Cd處理組相比，Cd+PUE共處理組Cu/Zn-SOD、POD、APX和CAT基因均有不同程度上調(diào)?？梢?jiàn)，低劑量（≤30 μmol·L-1）葛根素可能刺激了小白菜體內(nèi)的抗氧化機(jī)制，使得各種抗氧化酶基因的表達(dá)量整體上調(diào)，加速相應(yīng)酶蛋白的合成，進(jìn)而使抗氧化酶活性升高并加速H2O2分解，同時(shí)及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)過(guò)量的活性氧來(lái)減輕機(jī)體損傷，這與張蓓等［29］和Hussain等［30］的研究結(jié)果相類似。

綜上所述，葛根素作為一種天然抗氧化劑，可提高小白菜葉中的抗氧化酶活性，減輕自由基對(duì)小白菜幼苗的損傷，對(duì)Cd脅迫引起的小白菜氧化損傷具有一定的保護(hù)作用，但存在劑量依賴性和雙向性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，Cd脅迫下，小白菜的形態(tài)和生理代謝遭受了嚴(yán)重的Cd毒害作用，主要表現(xiàn)為抗氧化酶基因表達(dá)水平降低，抗氧化系統(tǒng)受損。適宜劑量（≤30 μmol·L-1）的葛根素處理可促進(jìn)小白菜生長(zhǎng)，增強(qiáng)小白菜在Cd脅迫下的抗性，增強(qiáng)抗氧化機(jī)制，減輕Cd引起的氧化損傷。