微白黃鏈霉菌對谷子萌發(fā)及拔節(jié)期生長的作用及機制

喬美霞 楊珍平，2 閆 霞 馬延玲 劉玉濤 高志強，2 陳 杰，2，*

（1山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷 030801；2黃土高原特色作物優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，山西太谷 030801；3陜西博秦生物工程有限公司，陜西咸陽 713899）

谷子（Setaria italicaL.）為禾本科狗尾草屬植物，具有抗旱、耐瘠薄、適應性強等特點，是我國北方的特色雜糧作物［1-3］。谷子籽粒富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和黃酮、多酚、低聚糖等多種營養(yǎng)和功能活性物質(zhì)［4-6］，其中多酚、維生素B1、B2、維生素E等的含量均高于小麥和水稻等谷類糧食作物［7］。隨著生活水平的提高，人們對谷子的需求量日益增加，然而谷子產(chǎn)量普遍較低，導致供需差距日漸擴大。如何促進谷子植株生長，提高谷子產(chǎn)量已成為谷子生產(chǎn)中急需解決的重要問題。目前常采用的谷子增產(chǎn)措施包括增施化肥和選育高產(chǎn)品種等，但過量施用化學肥料易帶來土壤板結、酸化及地下水污染等問題［8-9］，而高產(chǎn)品種的培育往往需要較長時間。因此，有必要尋找谷子促生增產(chǎn)的新的有效途徑。

外源有益微生物因高效便捷、安全環(huán)保等優(yōu)勢而被廣泛應用于玉米［10］、小麥［11］、水稻［12］和谷子［13］等作物的抗病促生研究中。目前，對谷子促生微生物的研究主要集中在細菌和真菌上。如畢少杰等［14］研究發(fā)現(xiàn)加入惡臭假單胞菌（Pseudomonas pulida）和陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）的發(fā)酵液可提高谷子的生物量和產(chǎn) 量；Ahmadvand等［15］發(fā) 現(xiàn) 接 種 印 度 梨 形 孢（Piriformospora indica）促進了谷子生長，增加了谷子產(chǎn)量。與細菌和真菌相比，放線菌因具有突出的抗病、促生等功能而被廣泛應用于西瓜［16］、玉米［17］、小麥［18-19］和番茄［20］等作物的促生增產(chǎn)研究中。然而，目前對谷子促生放線菌的了解仍十分有限。

種子萌發(fā)是植物生長發(fā)育的第一步。干預種子的萌發(fā)進程會影響植物早期的生長發(fā)育。根系是植物從土壤汲取養(yǎng)分的器官，根系形態(tài)結構直接影響植物從土壤中獲取營養(yǎng)物質(zhì)的能力，進而調(diào)控地上部植株的生長發(fā)育［21-23］。外源微生物通過調(diào)節(jié)根系的形態(tài)結構促進根系對養(yǎng)分和水分的吸收，進而使作物促生增產(chǎn)［24-26］。根際微生物與植物生長密切相關，被視為植物的第二基因組［27］。其中，根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量和結構變化會影響植物的生長發(fā)育。已有研究表明，外源微生物能夠通過優(yōu)化根際可培養(yǎng)微生物群落結構來間接調(diào)控植物的生長［28-29］。目前，關于外源放線菌是否能通過影響種子萌發(fā)、調(diào)控根系發(fā)育和根際微生物結構來促進谷子的生長尚不明確。因此，本研究以一株放線菌微白黃鏈霉菌T4為供試材料，研究T4對拔節(jié)期谷子植株生長的影響，并從種子萌發(fā)、根系發(fā)育及根際可培養(yǎng)微生物的角度解析其促生機制，旨在為谷子促生增產(chǎn)提供科學依據(jù)及有應用價值的放線菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試谷子為超早熟品種小米，由山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院農(nóng)業(yè)生物工程研究所提供。供試放線菌為微白黃鏈霉菌（Streptomyces albidoflavus）T4，由西北農(nóng)林科技大學微生物資源研究室分離篩選自青藏高原極端生境土壤中。T4對多種作物具有抗病、促生功能。

1.2 培養(yǎng)皿內(nèi)種子萌發(fā)試驗

發(fā)酵液制備：向活化好的T4試管斜面中加入無菌水3.0 mL，用滅菌竹簽將孢子刮下后攪勻得到孢子懸液并轉接至裝有150 mL已滅菌無瓊脂高氏1號液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中。將三角瓶置于28℃、130 r·min-1的搖床中培養(yǎng)。10 d后用直徑0.45μm的微孔濾膜過濾，得到T4無細胞發(fā)酵濾液（簡稱發(fā)酵液）的原液。將原液及稀釋10、100和1 000倍的發(fā)酵液用于種子萌發(fā)試驗。

種子萌發(fā)試驗：挑選大小一致、顆粒飽滿的谷子種子，先后用5%NaClO溶液浸泡10 s，75%酒精浸泡10 s，無菌水多次沖洗后分別放入上述各濃度T4發(fā)酵液中浸泡3 h。以無菌水代替發(fā)酵液作為對照（CK0）。隨后將種子轉移至事先放有兩層濾紙的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中。各培養(yǎng)皿中放置30粒種子，并加入無菌水3.5 mL，置于25℃恒溫條件下進行培養(yǎng)。各處理設置4個培養(yǎng)皿重復。分別于培養(yǎng)24、36、48、60、72、84和96 h后統(tǒng)計各培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)，并參照公式（1）～（3）分別計算種子萌發(fā)率（seed germination，SG）、發(fā)芽勢（germination energy，GE）和 發(fā) 芽 指 數(shù)（germination index，GI）。培養(yǎng)96 h后同時選取各培養(yǎng)皿生長最好的4棵幼苗測量胚根長、胚軸長，并稱量各培養(yǎng)皿內(nèi)幼苗總生物量（鮮重）。

式中，Gt為培養(yǎng)t小時后各培養(yǎng)皿內(nèi)萌發(fā)的種子數(shù)；Dt為培養(yǎng)時間，Dt=24、36、48、60、72、84和96 h。

1.3 盆栽試驗

取田間耕層土壤，添加100.0 g·kg-1DW有基質(zhì)、3.0 g·kg-1DW的復合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）混勻后裝入直徑10 cm、高8.5 cm的花盆內(nèi)，每盆0.5 kg。T4以活孢子含量為109CFU·g-1的粉狀孢子制劑形式施加。試驗設置1.0 g·kg-1DW的T4菌劑包衣（T4-Y）、T4菌劑拌土（T4-B）和無菌劑對照（CK）共3個處理，各處理設置10盆重復，共30盆。

種子包衣方法：將已知粒數(shù)的谷子種子用6.0 g·L-1的羧甲基纖維素鈉溶液浸濕后放入T4菌劑中，至表面均勻沾附菌劑后將各粒種子取出，播種，每盆6粒。剩余菌劑烘干、稱重，算得每粒谷子平均沾附T4孢子數(shù)為3.4×105個。將各盆置于晝、夜溫度分別為25、22℃，時間分別為16、8 h，光照強度分別為3 000、0 lx的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，播后正常管理，出苗后定苗至每盆5株。于播種后25 d終止試驗，采集地上部植株、根系和根際土壤樣品，測定如下指標：

根系形態(tài)結構：各處理隨機選取3盆，用自來水沖掉根系周圍土壤，獲得完整谷子根系樣品，采用WinRHIZO根系分析系統(tǒng)對谷子總根長、總根表面積、根系平均直徑、總根體積、根尖數(shù)和根分叉數(shù)指標進行分析。

根際可培養(yǎng)微生物：從剩余7盆谷子中隨機選取6盆，將各盆谷子根系取出后，抖掉根系周圍松散的土壤，用軟毛刷刷取與根系緊密結合的根際土壤，揀去雜質(zhì)后轉移至自封袋中于4℃保存。每2盆根際土壤混勻后作為1個測定重復。采用稀釋涂布平板法［30］對根際土壤中細菌（bacteria，B）、真菌（fungi，F(xiàn)）和放線菌（actinobacteria，A）三大類可培養(yǎng)微生物進行分離計數(shù)，并計算微生物總數(shù)（B、F和A的數(shù)量之和）及各類微生物的數(shù)量比值B/F、A/F和A/B。

生物量：稱量各盆中谷子的地上部植株及根系鮮重，并計算根冠比。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過Excel 2016對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及谷子生長指標與根際微生物之間的Pearson相關系數(shù)的計算，并采用最小顯著差數(shù)法（least significant difference，LSD）在P<0.05或P<0.01水平進行統(tǒng)計檢驗，Origin Pro 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 T4發(fā)酵液對谷子萌發(fā)的影響

由表1可知，T4發(fā)酵液均不同程度促進了谷子種子萌發(fā)，其中稀釋100倍的發(fā)酵液使培養(yǎng)24、36、60和96 h后谷子的萌發(fā)率較對照分別顯著提高了9.2、9.2、13.4和7.5個百分點。此外，在培養(yǎng)24 h后，T4發(fā)酵液原液、10倍稀釋液和100倍稀釋液也分別使種子萌發(fā)率較對照顯著提高了5.8、6.7和9.2個百分點。

文化不是虛的，強化企業(yè)文化建設，要塑造的是大家在一起做一番事業(yè)是意義和興趣所在。企業(yè)文化更多的是組織對員工的承諾，同時也是員工對組織的承諾。其實是一種精神鎖定，是一種心靈契約的鎖定。員工在這種組織氛圍下，無形之中會做出一種承諾，組織中的一群人都是這樣的，如果自己將來不是這樣，自己會受煎熬。同時，企業(yè)文化最重要的且最終是一種選擇機制。企業(yè)文化不是解決所有的問題，不是所有人都會這樣，而是盡量減少未來動蕩的風險。

表1 T4發(fā)酵液對谷子萌發(fā)率的影響Table 1 Effects of the fermentation broth of T4 on the germination of foxtail millet seeds /%

由圖1可知，T4發(fā)酵液能夠提高谷子種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，其中T4發(fā)酵液的100倍稀釋液浸泡后，谷子種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均達到最高，與對照相比分別顯著提高了9.17個百分點和23.1%。T4發(fā)酵液的10倍和1 000倍稀釋液也使谷子的發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢分別較對照提高了9.6%～13.7%和3.34～4.17個百分點，但差異均未達顯著水平。

圖1 T4發(fā)酵液對谷子種子萌發(fā)能力的影響Fig.1 Effects of the fermentation broth of T4 on the germination capacity of foxtail millet seeds

2.2 T4發(fā)酵液對谷子胚根、胚軸生長的影響

由圖2可知，T4發(fā)酵液的100倍稀釋液處理使谷子的胚根長度較對照顯著增加了13.4%，10倍稀釋液處理使谷子胚軸長度較對照顯著提高了20.7%。而T4發(fā)酵液的原液處理使谷子的胚根長度較對照顯著減少了16.7%。稀釋1 000倍后，T4發(fā)酵液對谷子胚根和胚軸長度均無顯著影響。各稀釋倍數(shù)下，T4發(fā)酵液對谷子生物量均無顯著影響。

圖2 T4發(fā)酵液對谷子胚根、胚軸生長及生物量的影響Fig.2 Effects of the fermentation broth of T4 on the radicle，hypocotyl lengths，and biomass of foxtail millet

2.3 T4菌劑對拔節(jié)期谷子植株生長的影響

由圖3可知，T4菌劑包衣處理使谷子地上植株生物量和根系生物量較無菌劑對照分別顯著增加了22.5%和32.7%，同時使根冠比提高了13.1%。而拌土添加T4菌劑對谷子地上植株和根的生物量及根冠比均無顯著影響。

圖3 T4菌劑對谷子生物量的影響Fig.3 Effects of the T4 microbial agent on the biomass of foxtail millet plants

由表2可知，包衣施加T4菌劑使谷子根尖數(shù)和分叉數(shù)分別較對照顯著增加了90.9%和66.9%，同時使谷子根長、根表面積、根平均直徑較對照增加了18.7%～54.0%。T4菌劑拌土處理下谷子根長度、根表面積、根尖數(shù)和分叉數(shù)較對照增加了24.8%～38.6%，但差異均未達顯著水平。

表2 T4菌劑對谷子根系形態(tài)結構的影響Table 2 Effects of the T4 microbial agent on the morphological structure of foxtail millet roots

2.4 T4菌劑對拔節(jié)期谷子根際微生物的影響

由表3可知，T4菌劑包衣處理使谷子根際細菌數(shù)量、微生物總數(shù)較無菌劑對照分別顯著增加了95.1%和49.5%，同時使根際真菌數(shù)量顯著降低了52.1%。拌土施加T4菌劑處理使根際細菌、真菌和微生物總數(shù)較對照分別顯著增加了61.7%、26.3%和28.5%。兩種方式施加T4菌劑處理對根際放線菌數(shù)量均無顯著影響。

表3 T4放線菌劑對谷子根際微生物數(shù)量的影響Table 3 Effects of the T4 microbial agent on the number of microorganisms in the rhizosphere soils of foxtail millet

由表4可知，包衣施加T4菌劑處理使A/F和B/F分別較對照顯著增加了98.8%和305.2%，而拌土施加T4菌劑處理對A/F和B/F無顯著影響。包衣和拌土施加T4菌劑處理分別使A/B較對照顯著降低了52.6%和46.8%。

表4 T4菌劑對谷子根際微生物比例的影響Table 4 Effects of the T4 microbial agent on the number ratios of microorganisms in the rhizosphere soils of foxtail millet

2.5 外源T4放線菌作用下谷子生長指標與根際微生物之間的關系

圖4 谷子生長指標與根際土壤微生物之間的相關分析Fig.4 Correlation analysis between the indexes of foxtail millet growth and the microorganisms in the rhizosphere soil

3 討論

外源施加有益微生物能夠促進谷子植株生長和產(chǎn)量增加。已有研究表明，施加復合木霉（Trichodermaspp.）和印度梨形孢（P.indica）等真菌［15］及解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）等細菌［13，31］能夠促進谷子植株生長，增加谷子的產(chǎn)量。本研究結果表明，放線菌微白黃鏈霉菌T4具有促進谷子生長發(fā)育的能力。其作用機制主要表現(xiàn)在以下幾個方面（圖5）：

圖5 T4促進拔節(jié)期谷子生長的作用機制Fig.5 Mechanism of T4 used to promote the growth foxtail millet at jointing stage

T4的次級代謝產(chǎn)物誘導谷子種子提早萌發(fā)。已有研究表明，一些微生物通過產(chǎn)生代謝物質(zhì)刺激植物種子萌發(fā)［32-33］。赤霉素是調(diào)節(jié)種子萌發(fā)的主要激素，能夠通過加速種子內(nèi)可溶性蛋白和淀粉等貯藏物質(zhì)的轉化和利用，激活葡萄糖轉運蛋白功能，啟動并加速糖酵解和三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA），從而增加胚的生長勢，克服種子覆蓋層的機械抑制［34-37］，進而促進種子萌發(fā)。解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）通過產(chǎn)生赤霉素促進水稻種子萌發(fā)及萌發(fā)后水稻植株的生長［38］；木霉菌（Trichodemaspp．）也能夠通過產(chǎn)生赤霉素等多種物質(zhì)提高紫丁香種子萌發(fā)過程中可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)的含量，促進種子萌發(fā)［39-40］。此外，有研究證實，一些內(nèi)生菌參與銀沙槐種子的代謝，并通過提高萌發(fā)關鍵物質(zhì)含量或產(chǎn)生小分子物質(zhì)d-野決明堿、司巴丁等方式來提高種子的萌發(fā)率［41］。本研究中，T4發(fā)酵液處理提高了谷子萌發(fā)率，其中以培養(yǎng)24 h后的提高幅度最大。供試發(fā)酵液的主要成分是T4的次級代謝產(chǎn)物。因此，產(chǎn)生代謝物質(zhì)刺激谷子種子提早萌發(fā)，進而推動谷子幼苗提早發(fā)育是T4促進谷子拔節(jié)期生長的機制之一。然而，具體代謝物質(zhì)及其發(fā)揮的作用仍需進一步系統(tǒng)研究。

T4誘導谷子胚根發(fā)育，調(diào)節(jié)根系形態(tài)結構。根系是植物直接吸收土壤養(yǎng)分和水分的器官，而一些微生物能夠通過色氨酸代謝產(chǎn)生內(nèi)源性生長素吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA），誘導細胞分裂和伸長，增加根的表面積、體積和長度，進而影響植物根系的形態(tài)和發(fā)育，使植物更容易汲取土壤中的水分和養(yǎng)分［42］。此外，一些有益微生物定殖于根際土壤后，通過分泌有機酸溶解并釋放出土壤顆粒中的養(yǎng)分，延長土壤中有效養(yǎng)分的供給，促進植物根系對土壤中營養(yǎng)元素的吸收利用，從而促進植物根系生長和地上部分生物量的積累［43］。本研究中，T4刺激了萌發(fā)后谷子胚根的伸長并增加了拔節(jié)期谷子的根尖數(shù)和根分叉數(shù)，表明刺激根系發(fā)育，優(yōu)化根系形態(tài)結構是T4促進谷子生長的又一機制。值得注意的是，本研究培養(yǎng)皿試驗中T4發(fā)酵液原液抑制了谷子胚根的生長，這可能是由于原液中所含T4代謝產(chǎn)物濃度太高，導致谷子細胞滲透壓增大，因此不利于谷子種子的萌發(fā)和生長。

T4通過調(diào)整根際微生物的結構組成促進拔節(jié)期谷子植株生長。根際微生物與植物生長密切相關［44］。根際微生物能夠通過分泌植物激素等物質(zhì)直接影響作物根系的生長發(fā)育，也能夠通過固氮、溶磷等作用改善土壤理化性質(zhì)、活化土壤養(yǎng)分來促進作物生長，或通過產(chǎn)生抗生素等抑制有害病原菌生長，減輕作物病害的發(fā)生來間接促進作物生長［45-49］。因此，根際微生物的群落結構組成直接或間接影響著作物的生長狀態(tài)。土壤中微生物之間既會彼此競爭養(yǎng)分、空間和生態(tài)位，也會通過產(chǎn)生代謝物質(zhì)刺激或抑制其他微生物的生長繁殖。外源施加微生物能夠提高根際微生物的整體活性、優(yōu)化根際微生物群落結構，增加有益菌的數(shù)量和比例，抑制有害微生物的生長，從而改善土壤微生態(tài)環(huán)境并影響植物生長［29，50-52］。有益微生物定殖于根際時，能夠通過占領根部生態(tài)位，改變土壤中微生物的種類和組成，起到防治植物土傳病害、誘導植物對不良外界環(huán)境產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、促進植物生長等多種作用［53］。本試驗所用放線菌T4為一株具有抑制多種作物病原菌生長功能的放線菌。本研究發(fā)現(xiàn)，T4在增加根際微生物總數(shù)的同時降低了真菌數(shù)量，表明外源添加T4菌劑可能在促進谷子根際微生物的生長繁殖，提高微生物活性的同時抑制了谷子根際有害真菌的生長，通過減輕谷子根際真菌病害的發(fā)生來間接促進谷子植株的生長。通過平板分離技術獲得的土壤可培養(yǎng)微生物均是活體微生物，是土壤微生物中的一個特殊類群。前人研究已證實根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量和比例的變化會影響植物的生長［54-56］。本研究發(fā)現(xiàn)，外源施加T4菌劑調(diào)整了拔節(jié)期谷子根際三大類可培養(yǎng)微生物的數(shù)量和比例，且可培養(yǎng)微生物的變化與谷子地上部植株和根系生物量顯著相關。表明通過刺激根際土壤微生物的生長、優(yōu)化根際土壤微生物結構組成，使土壤微生物環(huán)境維持在有利于谷子生長的健康狀態(tài)也是T4促使拔節(jié)期谷子生長的重要機制。

此外，本研究結果表明，T4菌劑包衣較拌土處理方式對谷子植株生長及根際土壤微生物的調(diào)控效果更好，這可能是由于包衣處理中T4包裹在種子表面，隨谷子萌發(fā)和根系生長在種子周圍擴散，與根系接觸更為密切，因此對拔節(jié)期谷子的促生效果更明顯。

4 結論

微白黃鏈霉菌T4具有促進拔節(jié)期谷子生長發(fā)育的能力，其作用機制為：產(chǎn)生代謝產(chǎn)物刺激谷子種子提早萌發(fā)；促進谷子根系發(fā)育，優(yōu)化根系形態(tài)結構；調(diào)控根際微生物數(shù)量和結構組成，改善根際微生物環(huán)境。但T4具體產(chǎn)生哪種物質(zhì)促進了谷子生長及其化學組成還需進一步深入研究。