橡膠樹(shù)不同粒徑橡膠粒子結(jié)合凝集相關(guān)蛋白的分析

丁 歡，吳紹華，夏志輝，黃 惜，史敏晶,*

橡膠樹(shù)不同粒徑橡膠粒子結(jié)合凝集相關(guān)蛋白的分析

丁 歡1，吳紹華2，夏志輝1，黃 惜1，史敏晶1,2*

1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南?？?570228；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹(shù)生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?571101

橡膠樹(shù)是重要的產(chǎn)膠植物，其樹(shù)皮組織中的次生乳管是合成和貯存天然橡膠的主要組織。天然橡膠是從乳管中的膠乳中提煉而成，由特殊的細(xì)胞器-橡膠粒子合成。橡膠粒子為半個(gè)單位膜的球狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部貯存合成的天然橡膠，外周膜上結(jié)合有多種蛋白質(zhì)，這些蛋白與其執(zhí)行的功能密切相關(guān)。目前對(duì)天然橡膠合成相關(guān)蛋白的研究較多，對(duì)與橡膠粒子凝集相關(guān)的蛋白研究甚少。以‘RY7-33-97’膠乳為材料，利用不同的離心速度，分級(jí)分離獲取不同粒徑的橡膠粒子，并進(jìn)行不同程度的清洗，以Tricine-SDS-PAGE以及Western-blotting技術(shù)對(duì)橡膠粒子上結(jié)合的蛋白進(jìn)行比較分析。研究結(jié)果表明，不同粒徑的橡膠粒子上結(jié)合的蛋白含量存在差異。小橡膠粒子膜蛋白（SRPP）隨著粒徑的減小含量明顯增加；而橡膠延伸因子蛋白（REF）的含量基本維持穩(wěn)定，與粒徑大小關(guān)系不大。存在于C-乳清中的Hev b7膠乳過(guò)敏原蛋白和3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）與橡膠粒子有明顯的結(jié)合；存在于黃色體B-乳清中的β-1,3-葡聚糖酶（Glu）、橡膠素（Hev）和幾丁質(zhì)酶（Chit）均能與橡膠粒子結(jié)合，但幾丁質(zhì)酶與之的結(jié)合能力最弱。橡膠粒子經(jīng)清洗后，作為橡膠粒子的主要膜蛋白，SRPP含量隨著清洗次數(shù)增加明顯降低，而REF蛋白含量變化不明顯，可見(jiàn)SRPP與橡膠粒子膜的結(jié)合緊密程度不如REF；來(lái)自C-乳清和B-乳清的凝集相關(guān)蛋白隨清洗次數(shù)增加也明顯降低含量。體外孵育小橡膠粒子與不同的蛋白樣品，結(jié)果表明，橡膠粒子可體外結(jié)合多種不同的蛋白，其中多種蛋白都與橡膠粒子的凝集有關(guān)。本研究對(duì)不同粒徑橡膠粒子上結(jié)合的凝集相關(guān)蛋白進(jìn)行了初步解析，旨在為闡明橡膠樹(shù)排膠機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

橡膠樹(shù)；橡膠粒子；凝集相關(guān)蛋白；蛋白免疫印跡

橡膠樹(shù)是當(dāng)前世界上最重要的人工栽培產(chǎn)膠植物，其膠乳主要是由橡膠樹(shù)樹(shù)干中的次生乳管合成和貯藏[1]。次生乳管是由維管形成層中的紡錘狀原始細(xì)胞分裂形成，與形成層呈同心圓狀排列，其數(shù)量的多少與膠乳的產(chǎn)量密切相關(guān)[2-3]。在次生乳管發(fā)育過(guò)程中，同列（或同層）的乳管細(xì)胞之間形成互相融合的接合管，最終使得同一層的乳管細(xì)胞形成彼此連通的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1]。生產(chǎn)中通過(guò)割膠，即機(jī)械割破樹(shù)皮的乳管使膠乳流出，從而收集膠乳制備天然橡膠。

橡膠樹(shù)中的天然橡膠是一種順式－聚異戊二烯次生代謝物，由乳管中的特殊細(xì)胞器——橡膠粒子合成[4-5]。橡膠粒子是一種半個(gè)單位膜構(gòu)成的球狀結(jié)構(gòu)，其大小分布范圍為0.04～6.00 μm，膜組分主要是脂類和蛋白質(zhì)以及其他非橡膠成分組成的親水性層，而合成的天然橡膠烴則貯存在粒子內(nèi)部[1, 6-7]。天然橡膠的合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，多年來(lái)，學(xué)者們一直致力于研究橡膠粒子的天然橡膠合成機(jī)制[8-11]，對(duì)橡膠粒子的結(jié)構(gòu)以及其上的膜蛋白進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)了小橡膠粒子膜蛋白（SRPP）[12]和橡膠延伸因子蛋白（REF）[13-15]2個(gè)高豐度蛋白，以及橡膠轉(zhuǎn)移酶[16-17]等其他多種蛋白[18-19]。隨著研究的深入，天然橡膠的合成途徑被逐漸剖析，大量與橡膠合成相關(guān)的蛋白質(zhì)也被發(fā)現(xiàn)[19]。

作為膠乳中最主要的、含量最高的細(xì)胞器，除了橡膠生物合成的功能外，橡膠粒子在膠乳的停排中也起到了重要的作用。人們最早認(rèn)為橡膠粒子彼此之間進(jìn)行膜融合形成橡膠凝塊，從而堵塞了乳管傷口，導(dǎo)致膠乳排膠終止，由此提出了“膠蓋-膠塞模型”[20-21]。膠乳中的黃色體被認(rèn)為是橡膠粒子的促凝固系統(tǒng)，其內(nèi)含物中的多種蛋白被發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)膠乳凝固的作用[21]，據(jù)此，提出了多個(gè)有關(guān)橡膠粒子凝固的假說(shuō)[22-26]，其中的“凝集素”假說(shuō)得到較為廣泛的認(rèn)同[25-26]?！澳亍奔僬f(shuō)認(rèn)為來(lái)自黃色體中的凝集素類蛋白質(zhì)與橡膠粒子上的一種約22 kDa蛋白結(jié)合，導(dǎo)致了橡膠粒子的凝集，而這種22 kDa蛋白被證明為SRPP[27]。我國(guó)郝秉中等[28-29]研究發(fā)現(xiàn)，膠乳停排時(shí)，橡膠粒子仍然保持膜結(jié)構(gòu)的完整性，并未出現(xiàn)凝固現(xiàn)象。SHI等[30]對(duì)橡膠粒子的凝集進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)C-乳清中的3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）和Hev b7這2種蛋白也參與了橡膠粒子的凝集，并提出了以黃色體主要蛋白構(gòu)成的“蛋白質(zhì)網(wǎng)”為核心結(jié)合橡膠粒子的乳管傷口堵塞機(jī)制[28, 31]。由此可見(jiàn)，橡膠粒子不僅是天然橡膠合成的細(xì)胞器，也是排膠堵塞的主要參與者，它與黃色體構(gòu)成了乳管傷口堵塞物的核心組分。橡膠粒子上除了SRPP外，是否還有其他蛋白參與橡膠粒子的凝集，不同粒徑的橡膠粒子在蛋白凝集互作上是否存在差異，目前對(duì)這些問(wèn)題的研究都很少。本研究以‘RY7-33-97’為研究材料，采集膠乳后進(jìn)行不同粒徑的橡膠粒子的分級(jí)分離，利用電泳以及蛋白質(zhì)免疫印跡對(duì)不同處理的橡膠粒子上的蛋白進(jìn)行分析，旨在為最終闡述橡膠粒子的凝集原理和橡膠樹(shù)乳管排膠機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 選取種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州試驗(yàn)場(chǎng)九隊(duì)（海南儋州寶島新村）開(kāi)割7年的‘RY7-33-97’成齡健康橡膠樹(shù)，冰上收集正常排膠第5～30 min的膠乳，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，低溫高速分級(jí)離心，收集不同粒徑大小的橡膠粒子組分，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與儀器 Tricine、Glycine、SDS、Tris購(gòu)自AMRESCO（美國(guó)）；丙烯酰胺（Acrylamide）購(gòu)自NOVON（美國(guó)）；N-N甲叉雙丙烯酰胺（Bis-Acrylamide）、過(guò)硫酸銨（AP）、TEMED購(gòu)自Sigma（西格瑪科技有限公司，美國(guó)）；β-巰基乙醇、甘露醇購(gòu)自BBI公司（中國(guó)）；甲醇、乙醇、冰乙酸、鹽酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（10、17、26、34、43、55、72、95、130、180 kDa，共10條帶）為Fermentas產(chǎn)品。帶堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗為PIERCE（皮爾斯，美國(guó)）產(chǎn)品，堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗雞二抗購(gòu)自Sigma。帶辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、抗雞和抗鼠二抗購(gòu)自Thermo Fisher Scientific （美國(guó)）。BCIP/NBT底物顯色試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PVDF膜（0.2 μm）購(gòu)自Bio-Rad（伯樂(lè)）。橡膠素一抗體由廈門(mén)博欣生物技術(shù)有限公司（Bambio）制備，幾丁質(zhì)酶一抗由寶賽生物生物技術(shù)有限公司合成，β-1,3-葡聚糖酶（Glu）一抗為北京華大基因研究中心制備；小橡膠粒子膜蛋白（SRPP）、橡膠延伸因子（REF）、HEV b7、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體均為兔抗，由廈門(mén)博欣生物技術(shù)有限公司（Bambio）制備。

高速離心機(jī)購(gòu)自Thermo fisher Scientific（美國(guó)）；DYY-Ⅲ-7B轉(zhuǎn)移電泳儀、DYY-12C型，電泳儀及小型電泳槽購(gòu)自北京六一儀器廠；凝膠成像儀ImageQuant LAS 4000購(gòu)自GE（美國(guó)）有限公司；LA-960激光粒度儀購(gòu)自HORIBA（日本）公司。

1.2 方法

1.2.1 不同大小粒徑橡膠粒子的制備 冰上保存的膠乳于高速離心機(jī)中以10 000 r/min，4℃條件下離心30 min，收集上層橡膠膏保存?zhèn)溆?，余下的膠乳溶液依次以13 000、15 000、18 000 r/min 4℃條件下離心30 min，每次分離均收集上層橡膠膏備用，最后將余下的主要為小橡膠粒子的懸液于18 000 r/m, 4℃，離心60 min，收集上層半透明狀的橡膠膏備用。

1.2.2 不同清洗強(qiáng)度橡膠粒子的制備 將分級(jí)離心后收集的不同粒徑大小的橡膠粒子按照1 g分散懸浮到3.5 mL等滲緩沖液（0.05 mol/L Tris- HCl+0.4 mol/L甘露醇，pH 7.2）中清洗，然后同1.2.1中對(duì)應(yīng)的離心速度離心收集橡膠粒子，每種樣品均清洗3次，然后收集清洗完畢的橡膠粒子制備電泳樣品。

1.2.3 橡膠粒子粒徑測(cè)定 取不同離心速度收集的橡膠粒子，分散到等滲緩沖液中，LA-960激光粒度儀測(cè)定，具體方法按照LA-960濕法操作手冊(cè)進(jìn)行。

1.2.4 C-乳清和B-乳清等不同蛋白樣品與小橡膠粒子的結(jié)合實(shí)驗(yàn) 膠乳于18 000 r/min，4℃條件下離心120 min，收集底部黃色體以及中間清液C-乳清；黃色體經(jīng)反復(fù)凍融后離心收集清液即B-乳清；硫酸銨分級(jí)沉淀，分別收集B-乳清和C-乳清的85%硫酸銨沉淀收集的樣品；柱層析純化β-1,3-葡聚糖酶。取平均粒徑為0.16 μm的小橡膠粒子按照1 g分散懸浮到3.5 mL等滲緩沖液（0.05 mol/L Tris-HCl+0.4 mol/L甘露醇，pH 7.2）中，然后取100 μL與前各種蛋白樣品100 μL于25℃孵育30 min，加入10 μL的3%醋酸終止反應(yīng)，7000 r/min，25℃條件下離心10 min，收集上層橡膠膏，制備電泳樣品。

1.2.5 Tricine-SDS-Page Tricine-SDS-PAGE參照SCHAGGER等[32]和史敏晶等[33]的方法，簡(jiǎn)化成兩層膠。不同的橡膠粒子膏狀物均按照0.01 g分散到70 μL超純水中，然后加入等體積的SDS上樣緩沖液，煮沸5 min，離心后取上清電泳。每泳道上樣量為10 μL（等體積上樣）。電泳于濃縮膠中電壓為30 V，樣品完全到達(dá)分離膠界面后,升至100 V恒壓電泳至結(jié)束。

1.2.6 Western Blotting 參照TOWBIN等[34]的方法將Tricine-SDS-PAGE電泳后凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.2 μm PVDF膜上，50 mA低溫轉(zhuǎn)移12 h。轉(zhuǎn)移電極緩沖液含20 mmol/L Tris堿，150 mmol/L甘氨酸，20%甲醇（/）。轉(zhuǎn)移后漂洗，TBS溶液中過(guò)渡5 min，加入0.2%（/）戊二醛的TBS溶液中固定鉸鏈45 min，漂洗，于10%脫脂奶粉的TBS封閉液中4℃封閉過(guò)夜。橡膠素、幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶、SRPP、REF、HEV b7、GAPDH一抗稀釋倍數(shù)均為1∶3000；二抗則為1∶5000稀釋倍數(shù)；抗體在37℃孵育90 min，BCIP/NBT顯色5～10 min；化學(xué)發(fā)光1 h內(nèi)顯色，LAS4000成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同粒徑橡膠粒子膜結(jié)合蛋白分析

對(duì)不同離心速度分離獲取的橡膠粒子組分進(jìn)行粒徑大小測(cè)定，結(jié)果表明，隨著離心速度的增加，分離出來(lái)的橡膠粒子平均粒徑越小，并且峰形也由雙峰變?yōu)閱畏澹▓D1）。首次離心分離速度為10 000 r/min，平均粒徑為0.45 μm，出現(xiàn)典型的雙峰，其中粒徑小于0.45 μm的橡膠粒子（即小橡膠粒子）占比為58.06%，余下的直徑為0.45～ 1.73 μm的大橡膠粒子占比為41.94%，可見(jiàn)，即使是較低的離心速度，仍然能收集到小橡膠粒子（圖1A）；13 000 r/min離心后，平均粒徑為0.37 μm，仍然表現(xiàn)為雙峰，但是大粒徑組分的峰值明顯降低，粒徑小于0.45 μm的小橡膠粒子具體占比升高至68.61%，大橡膠粒子占比則降至31.39%（圖1B）；15 000 r/min離心后，雙峰基本消失，平均粒徑為0.22 μm，小橡膠粒子占比高達(dá)91.34%，而大橡膠粒子占比僅8.66%，且其中最大粒徑僅為0.88 μm，可見(jiàn)，此時(shí)離心收集到的橡膠粒子基本上是小橡膠粒子（圖1C）；18 000 r/min離心后，峰形為單峰，平均粒徑為0.16 μm，小橡膠粒子占比達(dá)100.00%，大于0.45 μm的橡膠粒子完全消失（圖1D）；對(duì)保留在C-乳清中仍然殘存的小橡膠粒子進(jìn)行延時(shí)離心，收集后測(cè)定粒徑，結(jié)果表明，這些橡膠粒子的平均粒徑更小，約為0.14 μm，最小的粒徑為0.07 μm，最大的也僅為0.39 μm（圖1E），可見(jiàn)，隨著離心強(qiáng)度增大，橡膠粒子組分的粒徑逐漸減小。

對(duì)收集的不同組分橡膠粒子的膜上蛋白組分進(jìn)行分析，電泳結(jié)果表明（圖2A），不同樣品的蛋白含量存在差異，尤其在20 kDa左右的中低分子量蛋白條帶，差異明顯。通過(guò)免疫印跡（WB）對(duì)這些蛋白進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果表明，免疫印跡化學(xué)發(fā)光顯示，存在于C-乳清中的蛋白3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（圖2B）和過(guò)敏原蛋白Hev b7（圖2C）都被清晰地檢測(cè)到；黃色體中的高豐度蛋白β-1,3-葡聚糖酶（Glu）（圖2D）和橡膠素（Hev）尤其是其前體（圖2E）也能被檢測(cè)到，但幾丁質(zhì)酶（Chit）只能檢測(cè)到極弱的條帶（圖2F），其中，β-1,3-葡聚糖酶（Glu）與粒徑較大的橡膠粒子的結(jié)合能力明顯強(qiáng)于粒徑小的橡膠粒子；作為橡膠粒子上公認(rèn)的主要蛋白SRPP和REF在橡膠粒子上含量極其豐富，通過(guò)靈敏度弱于化學(xué)發(fā)光的BCIP/NBT就可以顯示，并且隨著粒徑減小，SRPP表現(xiàn)出明顯的增加趨勢(shì)（圖2G），但REF的含量保持穩(wěn)定，并未隨粒徑大小有明顯變化（圖2H）。由此可見(jiàn)，橡膠粒子上不僅結(jié)合大量的高豐度蛋白SRPP和REF，還可以結(jié)合胞質(zhì)中與橡膠粒子凝集相關(guān)的3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）和過(guò)敏原蛋白Hev b7，同時(shí)還能結(jié)合黃色體破裂后釋放的內(nèi)含物中的主要蛋白β-1,3-葡聚糖酶（Glu）和橡膠素（Hev），這些非橡膠粒子自身?yè)碛械牡鞍着c之結(jié)合應(yīng)該與橡膠粒子執(zhí)行其生物功能有關(guān)。

1～5：平均粒徑分別為0.45、0.37、0.22、0.16、0.14 μm的橡膠粒子樣品；M：蛋白質(zhì)標(biāo)樣；箭頭為目標(biāo)蛋白帶。

2.2 不同粒徑橡膠粒子清洗后結(jié)合蛋白分析

選取平均粒徑0.45（a）、0.22（b）、0.14（c） μm的橡膠粒子新鮮樣品分散到等滲緩沖液中清洗3次，電泳檢測(cè)結(jié)果表明（圖3A），大部分蛋白條帶在第一次清洗后明顯減弱，且隨著清洗次數(shù)增加進(jìn)一步減弱，其中分子量大約20 kDa的主要蛋白帶減弱尤其明顯。通過(guò)免疫印跡對(duì)這些蛋白進(jìn)行鑒定分析，化學(xué)發(fā)光顯示結(jié)果表明，C-乳清中的GAPDH（圖3B）和Hev b7（圖3C）在未清洗前，在不同粒徑的橡膠粒子上均能被清晰地檢測(cè)到，但清洗1次后，GAPDH蛋白基本消失，僅在平均粒徑0.45 μm的橡膠粒子組分中還有微弱的條帶，而第二次清洗后，該蛋白未能在樣品中檢測(cè)到，表明進(jìn)一步被洗脫；Hev b7條帶明顯強(qiáng)于GAPDH，第一次清洗后，在3種不同粒徑的樣品中都能檢測(cè)到，但第二次之后同樣未檢測(cè)到。該結(jié)果表明這2個(gè)蛋白與橡膠粒子的結(jié)合不是很穩(wěn)定，容易被洗脫，相對(duì)小橡膠粒子而言，這2個(gè)蛋白可能與大橡膠粒子的結(jié)合更緊密一些。黃色體中的高豐度蛋白β-1,3-葡聚糖酶（Glu）與橡膠粒子尤其是與大粒徑橡膠粒子的結(jié)合能力明顯更強(qiáng)（圖3D），在0.45、0.22 μm的橡膠粒子組分中經(jīng)3次洗脫后仍能檢測(cè)到該蛋白。橡膠素（Hev）則主要是其前體被檢測(cè)到，并且該蛋白極容易被洗脫（圖3E），幾丁質(zhì)酶未能檢測(cè)到明顯的條帶，表明結(jié)合能力較弱（圖3F）。橡膠粒子的主蛋白SRPP和REF通過(guò)BCIP/NBT顯示，結(jié)果表明，隨著清洗次數(shù)的增加，不同粒徑樣品上的SRPP均明顯減少（圖3G），可見(jiàn)，該蛋白與橡膠粒子的結(jié)合并不是特別穩(wěn)定。REF的含量雖然清洗后也有減少的趨勢(shì)，但總體保持穩(wěn)定，且粒徑越小結(jié)合越穩(wěn)定（圖3H）。

2.3 小橡膠粒子體外孵育不同蛋白組分的結(jié)合分析

收集平均粒徑0.16 μm的小橡膠粒子分散到等滲緩沖液中后與含不同蛋白組分的樣品孵育，然后分析小橡膠粒子上的結(jié)合蛋白，結(jié)果表明，小橡膠粒子與不同蛋白組分孵育后，蛋白條帶發(fā)生了明顯的變化（圖4A，圖4B），根據(jù)條帶的粗細(xì)可知，這些蛋白的含量較高，因此，可以統(tǒng)一通過(guò)BCIP/NBT來(lái)顯示免疫印跡鑒定的結(jié)果（圖4C～圖4I）。GAPDH和Hev b7僅存在于C-乳清以及85%硫酸銨沉淀的C-乳清樣品中，尤其是GAPDH在85%硫酸銨沉淀樣本中得到了高度的濃縮，即豐度明顯增加，在這2個(gè)蛋白樣品與小橡膠粒子孵育后，相比對(duì)照的微弱結(jié)合，這2個(gè)樣品中GAPDH結(jié)合到小橡膠粒子上的蛋白量明顯增強(qiáng)（圖4C）；Hev b7蛋白同樣大量結(jié)合到小橡膠粒子上（圖4D），并且根據(jù)85%硫酸銨沉淀樣品中Hev b7的豐度遠(yuǎn)低于GAPDH（圖4A），可以推測(cè)，Hev b7與小橡膠粒子的結(jié)合能力高于GAPDH。黃色體中的高豐度蛋白β-1,3-葡聚糖酶（Glu）與橡膠粒子的結(jié)合明顯（圖4E）；橡膠素（Hev）及其前體均被檢測(cè)到，表明二者都與小橡膠粒子有結(jié)合，鑒于橡膠素在樣品中的豐度極高，但結(jié)合量并不太大，可以認(rèn)為橡膠素與小橡膠粒子的結(jié)合能力并不是很強(qiáng)（圖4F）。幾丁質(zhì)酶也大量存在于B-乳清中，在這樣的混合蛋白樣品中，該蛋白與小橡膠粒子有較好的結(jié)合（圖4G）。橡膠粒子的主蛋白SRPP和REF都有明顯的高豐度條帶（圖4H，圖4I），但在與B-乳清孵育的樣品中，SRPP明顯減弱（圖4I），是否存在該蛋白被其他蛋白競(jìng)爭(zhēng)而脫離橡膠粒子膜這一現(xiàn)象，值得進(jìn)一步研究。

圖3 清洗對(duì)不同粒徑橡膠粒子結(jié)合蛋白的影響

3 討論

橡膠粒子作為橡膠樹(shù)膠乳中占比最大的細(xì)胞器，是天然橡膠合成和貯存的場(chǎng)所，同時(shí)也是乳管傷口堵塞物形成的主要參與者。無(wú)論是國(guó)外學(xué)者認(rèn)為乳管傷口的堵塞是橡膠粒子本身的凝固造成的[21]，還是我國(guó)學(xué)者比較認(rèn)同的傷口堵塞的根本原因是傷口末端形成“蛋白質(zhì)網(wǎng)”堵塞物[29, 31]，其中都離不開(kāi)橡膠粒子的參與。橡膠粒子具有不同的粒徑，主要分布在0.08～2.00 μm范圍內(nèi)[19]，極少數(shù)高達(dá)5～6 μm。通常以0.45 μm為界限，分為大、小橡膠粒子兩大部分[1, 35]，目前，普遍認(rèn)為數(shù)量巨大的小橡膠粒子主要執(zhí)行合成天然橡膠的功能，同時(shí)在乳管傷口堵塞中起重要作用[1, 26-27]。

橡膠粒子執(zhí)行生物功能離不開(kāi)其表面的結(jié)合蛋白，目前研究橡膠粒子上的蛋白主要集中在天然橡膠的生物合成上[8-9, 13, 36-38]，對(duì)參與膠乳凝集、乳管堵塞方面蛋白的研究較少。本研究分級(jí)分離了不同粒徑的橡膠粒子，并對(duì)不同粒徑的橡膠粒子上結(jié)合的凝集相關(guān)蛋白進(jìn)行了分析，結(jié)果表明無(wú)論粒徑大小，橡膠粒子都能結(jié)合C-乳清中的Hev b7與GAPDH蛋白，根據(jù)結(jié)合量的高低，可以認(rèn)為橡膠粒子結(jié)合Hev b7的能力強(qiáng)于GAPDH。B-乳清中的3個(gè)高豐度蛋白中，β-1,3-葡聚糖酶（Glu）與橡膠粒子的結(jié)合能力最強(qiáng)，橡膠素和幾丁質(zhì)酶結(jié)合能力則明顯弱于β-1,3-葡聚糖酶，可見(jiàn)，在與橡膠粒子的結(jié)合中β-1,3-葡聚糖酶（Glu）起到更核心的作用，這一結(jié)果與SHI等[31]利用表面等離子共振技術(shù)（SPR）分析的這幾個(gè)蛋白之間的互作能力的結(jié)果一致。Hev b7、GAPDH、β-1,3-葡聚糖酶（Glu）、橡膠素和幾丁質(zhì)酶作為分別存在于胞質(zhì)和黃色體內(nèi)部的蛋白質(zhì)，不是橡膠粒子本身的蛋白，只能是通過(guò)蛋白互作等方式結(jié)合到橡膠粒子上，通過(guò)清洗的方式，本研究發(fā)現(xiàn)這些蛋白可以在溫和的條件下被洗脫，表明這些蛋白與橡膠粒子的結(jié)合相對(duì)松散。根據(jù)清洗的次數(shù)和殘留的蛋白量，可以推測(cè)出Hev b7和β-1,3-葡聚糖酶（Glu）與橡膠粒子具有更好的結(jié)合能力，而橡膠素和幾丁質(zhì)酶與之結(jié)合能力較弱，已有研究表明橡膠素和幾丁質(zhì)酶這2個(gè)蛋白和β-1,3-葡聚糖酶之間存在互作[31]，那么，它們是否是通過(guò)β-1,3-葡聚糖酶間接結(jié)合到橡膠粒子上而非直接結(jié)合到橡膠粒子上值得進(jìn)一步分析研究。

1～6：依次為黃色體B-乳清、胞質(zhì)C-乳清、B-乳清85%硫酸銨沉淀蛋白組分、純化的β-1,3-葡聚糖酶（Glu）、C-乳清85%硫酸銨沉淀蛋白組分以及小橡膠粒子樣品；6，對(duì)照，小橡膠粒子與緩沖液孵育。M：蛋白質(zhì)標(biāo)樣；A圖中泳道3的短箭頭表示高豐度的橡膠素蛋白，泳道5中的長(zhǎng)箭表示被濃縮的37 kDa的蛋白，其余箭頭表示免疫印跡的目標(biāo)蛋白帶。

SRPP和REF作為橡膠粒子自身的標(biāo)志性蛋白[39-41]，在大、小橡膠粒子上的含量存在差別，以前的觀點(diǎn)認(rèn)為SRPP在小橡膠粒子上占優(yōu)勢(shì)，而REF在大橡膠粒子上占優(yōu)勢(shì)[27]，本研究表明，REF在大、小橡膠粒子上的含量差異不明顯，發(fā)生明顯變化的是SRPP，該蛋白主要分布在小橡膠粒子上，膠乳中隨著小橡膠粒子比例的加大，SRPP的含量是增加的。SRPP和REF與橡膠粒子膜結(jié)合的牢固程度明顯不同，REF不容易洗脫，而SRPP極易被洗脫，因此，可以認(rèn)為SRPP在小橡膠粒子上的結(jié)合相對(duì)松散，容易脫落。小橡膠粒子成長(zhǎng)為大橡膠粒子后，膜表面的SRPP基本消失，執(zhí)行功能可能由合成天然橡膠轉(zhuǎn)化為貯存天然橡膠，SRPP脫落后是否會(huì)重新結(jié)合到小橡膠粒子表面從而循環(huán)使用也是一個(gè)值得研究的問(wèn)題。

鑒于大、小橡膠粒子都能結(jié)合胞質(zhì)C-乳清和黃色體B-乳清中的凝集相關(guān)的蛋白，本研究推測(cè)排膠過(guò)程中不同大小的橡膠粒子可能都參與了乳管的堵塞，目前研究認(rèn)為SRPP是橡膠粒子凝集過(guò)程中與其他蛋白結(jié)合的主要位點(diǎn)[27]，但大橡膠粒子上該蛋白含量極少，是否還有其他蛋白作為錨定位點(diǎn)參與橡膠粒子的凝集值得深入研究。

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Aggregation-related Proteins Binding to Rubber Particles with Different Diameter in Rubber Tree

DING Huan1, WU Shaohua2, XIA Zhihui1, HUANG Xi1, SHI Minjing1,2*

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation and Physiology of Tropical Crops, Haikou, Hainan 571101, China

Rubber tree (Muell.Arg.) is an important rubber-producing plant, and thesecondary laticifer in the trunk bark is the major tissue for the synthesis and storage of natural rubber. Natural rubber is ex-tracted from the latex in laticifer by tapping (mechanical wounding) and synthesized by a special organelle, named the rubber particle. Rubber particle is a spherical structure surrounded by a lipid monolayer and membrane-bound proteins, in which the natural rubber is stored. The peripheral membrane is bound to a variety of proteins that are closely related to the functions of rubber particles. At present, there are many studies on proteins related to natural rubber synthesis, but the proteins related to rubber particle aggregation still remains unclear. Using the latex collected from the clone ‘RY7-33-97’ as the material, rubber particles with different particle sizes were obtained by fractionation at different centrifugal speeds. Subsequently, the rubber particle samples were cleaned by buffer for three times and collected for electrophoresis, respectively. The binding proteins on rubber particles were compared and analyzed by Tricine- SDS-PAGE and Western-blotting techniques. There were obvious differences in the content of bound proteins on rubber particles with different particle size. Accompanied by the decrease of rubber particle size, the content of small rubber particle membrane protein (SRPP) increased significantly, while the content of rubber elongation factor protein (REF) remained stable and had little relationship with the rubber particle size. Hevb7 latex allergen protein (Hevb7) and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in C-serum could bind to the rubber particles, and β-1,3-gluca-nase (Glu), hevein (Hev) and chitinase (Chit) in B-serum could also bind to rubber particles, but in which the binding ability of chitinase to rubber particles was the weakest. After cleaning, as the main membrane protein of rubber particles, the content of SRPP decreased significantly with the times of cleaning, but the content of REF protein did not change obviously, indicating that the binding ability of SRPP to rubber particle membrane is not as strong as that of REF. The content of aggluti-nation-related proteins from C-serum and B-serum decreased significantly with the times of cleaning, usually, the pro-teins could not be detected after the second cleaning. Small rubber particles with about 0.16 μm mean diameter were incubated with different protein samples, the results showed that rubber particles could bind a variety of dif-ferent proteins, in which some proteins were related to the aggregation of rubber particles. In this study, the aggregation-related proteins bound to rubber particles with different particle sizes were preliminarily analyzed, the results would lay a foundation for elucidating the mechanism of latex flow of rubber trees.

Muell.Arg.; rubber particle; aggregation-related protein; western blotting

S794.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.12.003

2022-03-09；

2022-04-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 31870590）；海南省基金創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（No. 320CXTD442）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2018YFD1000502）。

丁 歡（1995—），女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)藝與種業(yè)。*通信作者（Corresponding author）：史敏晶（SHI Minjiing），E-mail：pzbsmjzifeng@163.com。