細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白2A 與腎細(xì)胞癌患者臨床及預(yù)后指標(biāo)相關(guān)性研究

郭海鋒，羅小冬，姜 力，吳佳成，郭 猛

1.南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 南通市腫瘤醫(yī)院 泌尿科，江蘇 南通 226361 ；北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院2.兒外科；3.心內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是常見的泌尿系統(tǒng)致死性疾病，是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的腎惡性腫瘤［1］。全球腎癌發(fā)病人數(shù)呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，預(yù)計(jì)至2030 年發(fā)病人數(shù)將達(dá)到52.0 萬(wàn)人［2］。RCC 的組織類型包括透明細(xì)胞型、乳頭狀細(xì)胞癌及嫌色細(xì)胞癌［3］。約65%的RCC 患者表現(xiàn)為局限性腫瘤，其余患者表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移性RCC，通過手術(shù)切除無(wú)法治愈，常需要配合全身治療［4］。RCC 早期或局部病變手術(shù)治愈率超過90%，局部晚期RCC 患者的5 年存活率為40%～60%［5］。因此，研究RCC 發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)的生物標(biāo)志物對(duì)治療RCC 尤為重要。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）參與不同腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移［6］。而CDKN2A 在RCC中的作用相對(duì)研究較少。有研究表明，CDKN2A 是銅死亡相關(guān)基因之一［7］。銅死亡相關(guān)基因通過銅與三羧酸循環(huán)的脂?；煞种苯咏Y(jié)合，導(dǎo)致脂酰化蛋白的異常聚集和鐵硫簇蛋白的丟失，從而導(dǎo)致蛋白毒性應(yīng)激而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［8-9］。而CDKN2A 作為具有雙重身份的特殊基因，其在腫瘤中發(fā)揮的具體作用還需要進(jìn)一步的探索。本研究旨在探討CDKN2A的表達(dá)及其在預(yù)測(cè)RCC 患者存活率中的作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 通過TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載531 個(gè)RCC 患者的臨床參數(shù)，包括患者的年齡、性別、TNM分期、病理分級(jí)、總體生存期（overall survival，OS）、疾病特異性生存期（disease specific survival，DSS）和無(wú)進(jìn)展間隔期（progression free interval，PFI）等參數(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2 研究方法 下載RCC 患者的臨床參數(shù)CDKN2A和這些臨床參數(shù)以及預(yù)后之間的相關(guān)性。構(gòu)建列線圖預(yù)測(cè)RCC 患者1、3 和 5 年存活率。筆者通過TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建棒棒圖展示在RCC 中CDKN2A表達(dá)和各免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性。使用Metascape在線進(jìn)行功能分析。將差異基因添加到Metascape中進(jìn)行功能分析?？紤]到轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的RCC 對(duì)于對(duì)放化療不敏感，后期治療首選靶向治療為基礎(chǔ)的綜合治療，將CDKN2A 與靶向藥物的靶點(diǎn)分子進(jìn)行相關(guān)性研究。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用軟件R（3.6.3 版本）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。R 包：GEOquery 包（2.54.1 版本）進(jìn)行數(shù)據(jù)下載，limma 包（3.42.2 版本）進(jìn)行差異分析［10-11］。通過基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）探討CDKN2A 可能作用的細(xì)胞機(jī)制。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RCC 組織中CDKN2A 表達(dá)升高 在RCC 腫瘤組織中，CDKN2A 的表達(dá)升高。構(gòu)建受試者工作特征曲線，曲線下面積為0.991，提示CDKN2A 具有很好的預(yù)測(cè)效果。見圖1。

圖1 RCC組織中CDKN2A表達(dá)降低（a.CDKN2A在RCC非配對(duì)組織中的表達(dá)情況；b.CDKN2A在RCC配對(duì)組織中的表達(dá)情況；c.受試者工作特征曲線）

2.2 CDKN2A 與RCC 臨床資料的關(guān)系 較高的TNM 分期、病理分期、組織學(xué)分級(jí)的RCC 患者中CDKN2A 的表達(dá)更高。見圖2。

圖2 CDKN2A分子與RCC患者的臨床資料的相關(guān)性

2.3 CDKN2A 與RCC 預(yù)后相關(guān)性 CDKN2A 低表達(dá)的RCC 患者OS、DSS、PFI 優(yōu)于CDKN2A 高表達(dá)的患者，即CDKN2A 低表達(dá)的RCC 患者的預(yù)后明顯優(yōu)于CDKN2A 高表達(dá)患者。見圖3。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中CDKN2A與RCC患者預(yù)后情況（a.CDKN2A低表達(dá)RCC患者OS；b.CDKN2A低表達(dá)RCC患者DSS；c.CDKN2A低表達(dá)RCC患者PFI；d.T1的RCC患者中，CDKN2A低表達(dá)患者預(yù)后情況；e.M0的RCC患者中，CDKN2A低表達(dá)患者預(yù)后情況；f.年齡≤60歲的RCC患者中，CDKN2A低表達(dá)患者預(yù)后情況）

2.4 列線圖個(gè)性化預(yù)測(cè)RCC 患者1、3 和 5 年的存活率 筆者基于多變量分析的結(jié)果構(gòu)建列線圖，列線圖預(yù)測(cè)RCC 患者1、3 和 5 年的存活率的C-指數(shù)為0.749（0.721～0.776）。校準(zhǔn)圖中的偏差校正線接近理想曲線，表明預(yù)測(cè)值和觀察值之間具有良好的一致性。見圖4。

圖4 列線圖預(yù)測(cè)RCC患者存活率及校準(zhǔn)圖（a.列線圖預(yù)測(cè)RCC患者1、3、5年OS率；b.預(yù)測(cè)OS率列線圖的校準(zhǔn)圖）

2.5 CDKN2A 與免疫細(xì)胞相關(guān)性 筆者通過TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建棒棒圖展示在RCC 中CDKN2A表達(dá)和各免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性。CDKN2A 的表達(dá)與大部分浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞之間呈顯著相關(guān)性，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CDKN2A 表達(dá)與免疫檢查點(diǎn)相關(guān)分子細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA-4），表面抗原分化簇274（cluster of differentiation 274，CD274）、細(xì)胞程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PDCD1）都具有較好的相關(guān)性。見圖5。

圖5 CDKN2A與免疫細(xì)胞相關(guān)性（a.CDKN2A與TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度的相關(guān)性；b.CDKN2A表達(dá)與RCC中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯著相關(guān)；c.CDKN2A表達(dá)與CTLA-4相關(guān)性散點(diǎn)圖；d.CDKN2A表達(dá)與CD274相關(guān)性散點(diǎn)圖；e. CDKN2A表達(dá)與PDCD1相關(guān)性散點(diǎn)圖）

2.6 CDKN2A 的共表達(dá)基因分析 根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)識(shí)別與CDKN2A 共表達(dá)的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的基因各50 個(gè)。見圖6。

圖6 CDKN2A的共表達(dá)基因分析（a.RCC中與CDKN2A正相關(guān)的前50個(gè)基因；b.RCC中與CDKN2A負(fù)相關(guān)的前50個(gè)基因）

2.7 CDKN2A 與分子靶向治療藥物靶點(diǎn)分子之間的相關(guān)性 分析CDKN2A 與分子靶向治療藥物靶點(diǎn)分子之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，CDKN2A 與KIT，MET，TEK和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B 都有較好的相關(guān)性。見圖7。

圖7 CDKN2A與分子靶向治療藥物靶點(diǎn)分子之間相關(guān)性（a.MET；b.TEK；c. 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B；d.KIT）

2.8 基于GSEA 信號(hào)通路預(yù)測(cè) 筆者使用Metascape在線進(jìn)行KEGG 功能分析，發(fā)現(xiàn)CDKN2A 可能通過參與影響細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)p53，銅離子穩(wěn)態(tài)，腫瘤衰老和細(xì)胞毒性這些方面來(lái)影響RCC 的生物學(xué)事件，從而導(dǎo)致RCC 的不同預(yù)后。

3 討論

腎癌在我國(guó)屬低發(fā)瘤種，但人口基數(shù)大，發(fā)病數(shù)較多［12］。因此，闡明RCC 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，以發(fā)現(xiàn)重要的生物標(biāo)志物并制定新的治療策略具有重要意義。

近年來(lái)，測(cè)序和組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為進(jìn)一步了解RCC 的機(jī)制和探索診斷和治療靶點(diǎn)提供更多機(jī)會(huì)［13］。在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中，筆者發(fā)現(xiàn)CDKN2A 在RCC 中表達(dá)升高，而且CDKN2A 低表達(dá)的RCC 患者的較CDKN2A高表達(dá)的患者有更好的預(yù)后。TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)分析結(jié)果及與免疫檢查點(diǎn)相關(guān)分子CTLA-4，CD274、和PDCD1 都具有較好的相關(guān)性，表明CDKN2A 的表達(dá)可能與免疫浸潤(rùn)顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，CDKN2A 與KIT，MET，TEK 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子B 都具有較好的相關(guān)性，對(duì)于靶向藥物的選擇可以提供更好參考性。Ⅲ期臨床JAVELIN Renal 101 臨床試驗(yàn)證實(shí)，對(duì)于進(jìn)展期RCC 患者，Avelumab 聯(lián)合Axitinib（聯(lián)合組A+Ax）比Sunitinib（靶向組S）具有更好的無(wú)疾病進(jìn)展生存期和客觀緩解率［14-15］。本研究結(jié)果顯示，CDKN2A 與RCC 的免疫浸潤(rùn)及靶點(diǎn)分子相關(guān)。

筆者基于GSEA 富集進(jìn)行信號(hào)通路的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)CDKN2A 可能通過參與影響細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)p53，銅離子穩(wěn)態(tài)，腫瘤衰老和細(xì)胞毒性這些方面來(lái)影響RCC 的生物學(xué)事件，從而導(dǎo)致RCC 的不同預(yù)后。筆者研究的分子CDKN2A 屬于銅死亡相關(guān)基因，在TCA 循環(huán)中蛋白質(zhì)脂?；^程中發(fā)揮上游調(diào)節(jié)作用［16］。既往研究表明，CDKN2A 通過 LDHA 介導(dǎo)的AKT/mTOR 通路抑制宮頸癌的細(xì)胞增殖和侵襲［17］；前蛋白轉(zhuǎn)化酶的抑制削弱p53、CDKN2A 和N-Ras 基因改變對(duì)人原發(fā)性黑素瘤細(xì)胞的侵襲性［18］。筆者推測(cè)，CDKN2A 通過TP53 調(diào)節(jié)參與RCC 的周期阻滯，從而導(dǎo)致RCC 患者的不同預(yù)后。

綜上所述，CDKN2A 的表達(dá)降低可以顯著延長(zhǎng)RCC 患者的OS，PFI 和DSS，可以用作RCC 的新型預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，同時(shí),可能與RCC 的免疫浸潤(rùn)相關(guān)，并在RCC 微環(huán)境中對(duì)于腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸可能起著重要的促進(jìn)作用。干擾CDKN2A 可能通過參與TP53 調(diào)節(jié)RCC 的周期阻滯，從而改善RCC的預(yù)后。這些發(fā)現(xiàn)為RCC 抗癌策略的開發(fā)提出一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。